UNIDAD III

GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA

SEMANA 12
INGENIERÍA GENÉTICA
 INGENIERÍA GENÉTICA
CONTENIDOS

I. Ingeniería genética.
II. Técnicas o procedimientos de Ingeniería genética.
III. Vectores de clonación.
IV. Importancia en la biotecnología(aplicaciones de la
tecnología del ADN recombinante)
La reproducción sexual recombina el ADN

ADN
recombinante
 ADN recombinante en la naturaleza
Las bacterias pueden pasar por varios tipos de recombinación, transfiriendo sus
genes entre especies.

1. Transformación:
• Las bacterias toman
segmentos de ADN del
ambiente.
• El ADN puede ser parte del
cromosoma de otra bacteria,
incluso de otra especie.
• La transformación ocurre
también cuando bacterias
captan diminutas moléculas
circulares de ADN llamadas
plásmidos
2. Conjugación:
• Transferencia del material
hereditario (ADN) de una
bacteria donadora a otra
receptora.
• Requiere el contacto físico entre
las dos estirpes bacterianas, la
donadora y la receptora.
• El contacto físico se establece a
través de los pili-F de la bacteria
donadora formándose un tubo
de conjugación.
3. Transducción:
• No necesita del contacto físico entre dos
estirpes bacterianas.
• El vehículo o vector que transporta ADN de
una bacteria a otra es un virus.
Los virus pueden transferir ADN
entre especies
I. INGENIERÍA GENÉTICA

La metodología del DNA recombinante,

permite transferir genes tanto a células
procariotas como a células vegetales y a
otros organismos eucariotas.
 Aparece en la En sentido
Evolución
década de los 70 general

Significa que se están

Genomas completos
tomando fragmentos de
Tecnología de ADN pueden ser clonados y
ADN y combinándolos
recombinante transferidos de una
con otros fragmentos de
célula a otra
ADN

Incluye el campo de la
Clonación de partículas tecnología del ADN
Con técnicas: Ingeniería
muy pequeñas de ADN y recombinante, la
genética
su cultivo en bacterias genómica y la genética
del siglo XXI
 II. TÉCNICAS O PROCEDIMIENTOS DE INGENIERÍA GENÉTICA

• Para estudio o manipulación.

• La extracción de ARN es mas compleja por la
inestabilidad de la molécula.
• Mediante enzimas de restricción o
endonucleasas.
• Se conocen más de 3000 diferentes)
cortan el ADN en sitios específicos
con determinadas secuencias de
nucleótidos de (4 a 8).
• Actúan como “tijeras moleculares”.
• Las ligasas de ADN unen los
fragmentos.
• Se utilizan para identificar secuencias
específicas de nucleótidos
• Las sondas de ADN unen pares con
secuencias complementarias de ADN.
• Las sondas de ADN son segmentos
cortos de hebras individuales de ADN
que son complementarias a la
secuencia de nucleótidos de una RCT
(o de cualquier otro ADN de interés en
el gel).
• Las sondas de ADN se marcan o
etiquetan mediante radiactividad o
agregándoles moléculas de colores Se identifica una sección corta de una
que las tiñen. hebra de ADN con una molécula de color
• Por tanto, una sonda de ADN dada (círculo rojo). Este ADN señalado se
etiquetará ciertas secuencias de ADN, aparea con una hebra objetivo de ADN
pero no otras con una secuencia de bases
complementarias pero no con una hebra
no complementaria.
• Sirven para identificar a los individuos
por su ADN.
• Cada RCT es corto (consta de dos o
tres nucleótidos), repetido (hasta 50
veces) y en tándem (las repeticiones
se colocan lado a lado)
• En muchas investigaciones criminales
se usa una RCT para amplificar el
ADN y tener suficiente para comparar
el que quedó en la escena del crimen Las repeticiones cortas en tándem son
con el ADN del sospechoso. comunes en las regiones no codificadas
del ADN. Esta RCT contiene la
secuencia AGAT, repetida de siete a 15
veces en diferentes individuos
 Puede usarse para producir cantidades ilimitadas de copias de segmentos seleccionados de
ADN o puede usarse para amplificar ciertos segmentos del ADN.

El proceso se hace automáticamente en

una termocicladora
En un tubo se agregan 4 ingredientes:
1. Muestra de ADN
2. Cebadores o iniciadores
3. Nucleótidos libres y
4. ADN polimerasa.

La no replica el
genoma completo sino únicamente
pequeños fragmentos de ADN.
 El método se basa, en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas
temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre treinta y cuarenta veces.

Las temperaturas elevadas rompen los

enlaces de hidrógeno entre las bases
complementarias, separando al ADN en
hebras simples..

La reducción de temperatura permite a

los cebadores formar pares de bases
complementarias con las hebras
originales de ADN

La temperatura se eleva y la ADN

polimerasa usa los nucleótidos libres
para elaborar copias del segmento del
ADN acotado por los cebadores

El ciclo se repite, normalmente de 30 a 40 veces,

hasta que se hayan terminado los reactantes.
La electroforesis en gel se utiliza para separar proteínas o fragmentos de
ADN. Los fragmentos de ADN se mueven sobre un campo eléctrico y se
alejan más o menos dependiendo de su carga y su tamaño.
 Siempre se utiliza una muestra estándar formada por una serie
de fragmentos sintéticos de ADN de tamaños conocidos

• Los fragmentos más Electrodo

pequeños viajan más - negativo
rápido que los más
grandes Fragmentos más grandes

• Se hacen las
comparaciones con
los patrones de
banda que se Dirección de
obtienen migración

Fragmentos más pequeños

Electrodo
+ positivo
Clonación del ADN mediante el cual se consigue que un fragmento de
ADN se integre a un génico autorreplicante (plásmido) que habita en una
bacteria, de tal manera que se generen muchos miles de millones de
copias idénticas.
Proceso de clonación de un gen en bacterias

1. Obtención de plásmido
recombinante

2. Transformación de
bacterias

3. Selección de bacterias
transformadas

4. Crecimiento de bacterias
transformadas

5. Aislamiento de los
plásmidos recombinantes
Clonación de un gen en un plásmido
1. Extracción del ADN del espécimen
que contiene el gen de interés. Se
aisla el ADN y se fragmenta usando
enzimas de restricción.
2. Preparación de un vector de clonación.
3. Formación del ADN recombinante.
4. Introducción del ADN recombinante
en la bacteria o célula anfitriona.
5. Propagación del cultivo de la bacteria
o célula anfitriona.
6. Detección y selección de las células.
transformadas (clones recombinantes).
 III. VECTORES DE CLONACIÓN
Son partes de DNA que pueden aceptar, transportar y replicar (clonar) otras
partes de ADN.

1. Vectores plásmidos 2. Vectores bacteriófagos:

• Son moléculas de ADN circular extra
cromosómico
• Los plásmidos siguen siendo los vectores de
clonación más utilizados.
• Son populares porque permiten la clonación y
manipulación rutinaria de trozos pequeños de
DNA
• Características:
-Tamaño pequeño
-Gran estabilidad
-Replicación independiente del DNA nuclear
-Resistencia a antibióticos
-Número múltiple de copias
-Presencia de marcadores seleccionables
• El DNA del bacteriófago lambda (λ) fue uno
de los primeros vectores fágicos utilizados en
la clonación.
• El cromosoma λ es una estructura lineal de
aproximadamente 49 kb de tamaño
• Se utilizan estos fagos para infectar E. coli.
• A cada extremo del cromosoma λ hay
secuencias de 12 nucleótidos llamadas sitios
o extremos cohesivos (COS).
• El bacteriófago λ se replica mediante un
proceso conocido como ciclo lítico
3. Vectores cósmidos 5. Cromosomas artificiales bacterianos
• Los vectores cósmidos contienen extremos COS
• Los BAC son grandes plásmidos de bajo
de DNA λ, un origen plasmídico de replicación y
número de copias.
genes de resistencia antibiótica
• Una de las principales ventajas de los cósmidos • De una a dos copias en células
es que permiten la clonación de fragmentos de bacterianas que contienen genes que
DNA en el rango de los 20 a los 45 kb. codifican el factor F.
• Los BAC fueron muy utilizados en el
4. Vectores de expresión
PGH para clonar y secuenciar grandes
• Los vectores de expresión de proteínas permiten fragmentos de cromosomas humano.
la síntesis de alto nivel de las proteínas
eucariotas dentro de las células bacterianas
• Contienen una secuencia promotora procariota
adyacente al sitio en el que se inserta el DNA en
el plásmido.
• Se utilizan con frecuencia en Bacillus subtilis,
una cepa más adecuada para la secreción de
proteínas.
6. Cromosomas artificiales de levaduras 7. Vectores Ti
• Los cromosomas artificiales de levaduras • Los vectores Ti son plásmidos
(YAC) son pequeños plásmidos que han que se originan naturalmente.
crecido en E. coli y han sido introducidos en • De 200 kb de tamaño
células de levadura como Saccharomyces
cerevisiae. • Aislados de la bacteria
Agrobacterium tumefaciens.
• Un YAC es una versión en miniatura de un
cromosoma eucariota. • Los vectores Ti se utilizan para
transferir genes a plantas.
• Los YACs son particularmente útiles para
clonar grandes fragmentos de DNA de 200
kb hasta aproximadamente 2 mb de tamaño.
• Similares a los BAC, los YAC también han
desempeñado un papel importante en PGH.
 Características del vector de clonación
Los modernos vectores de clonación del DNA plasmídico suelen incluir la mayoría de
las siguientes características deseables y prácticas

1. Tamaño: 2. Origen de la replicación (ori):

• Deberían ser lo suficientemente • Es el sitio de replicación del DNA que
pequeños como para que se puedan permite a los plásmidos replicarse de
separar fácilmente del DNA forma separada del cromosoma de la
cromosómico de la bacteria célula hospedadora.
hospedadora.

3. Sitio de clonación múltiple MCS

• El MCS, también llamado polylinker, es un
fragmento de DNA con secuencias de
reconocimiento para muchas enzimas de
restricción comunes diferentes.
• Un MCS (o polylinker) aporta gran flexibilidad a
los fragmentos de DNA que pueden ser
clonados en un plásmido porque es posible
insertar fragmentos de DNA generados por los
cortes con muchas enzimas diferentes.
4. Genes marcadores que se puedan seleccionar:
• Estos genes permiten la selección e identificación de
bacterias transformadas mediante un plásmido
recombinante en comparación con las células no
transformadas.
6. Secuencias de cebadores
• Algunos de los marcadores más comunes que se
(primers u oligonucleótidos)
pueden seleccionar son genes de resistencia a la
para la secuenciación del DNA:
ampicilina (ampR) y a la tetraciclina (tetR) y el gen
Estos cebadores permiten la
lacZ utilizado para la selección azul-blanca.
secuenciación de nucleótidos de
5. Secuencias del promotor de RNA polimerasa: fragmentos de DNA clonado que
• Estas secuencias se utilizan para la transcripción hayan sido insertados en el
del RNA in vivo e in vitro por la RNA polimerasa. plásmido.
• In vivo, estas secuencias permiten a las células
bacterianas fabricar RNA a partir de genes clonados,
lo que a su vez causa la síntesis de proteínas.
• El RNA transcrito in vitro puede ser utilizado para
sintetizar «sondas» de RNA que pueden servir para
estudiar la expresión génica.
Vectores de DNA y sus aplicaciones
 VI. IMPORTANCIA EN LA BIOTECNOLOGÍA
APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Obtención de productos Medicina forense
farmacéuticos Marcadores genéticos
Insulina Huella genética
Interferón
H. de crecimiento
Factor VIII
Terapia génica

Diagnóstico de Inserción de genes

enfermedades funcionales para
corregir un defecto
Detección enfermedades
genético
hereditarias por técnicas
de ADN recombinante en
En células En células somáticas
personas o fetos.
germinales
Análisis del ADN, prueba del ADN o huella genética (TEST de ADN)
El análisis de ADN implica la comparación de muestras de ADN.

El análisis de ADN implica las siguientes etapas:

▪ Se obtiene una muestra de ADN de un individuo
(conocido, de un fósil o de una escena de un
crimen).
▪ Se seleccionan aquellas secuencias del genoma
que varíen mucho de unos individuos a otros y se
amplifican en la PCR.
▪ El ADN copiado se rompe en fragmentos más
pequeños utilizando enzimas de restricción.
▪ Los fragmentos se separan mediante
electroforesis.
▪ Esto produce un patrón de bandas que es
siempre el mismo en el ADN del mismo individuo:
su perfil de ADN o huella genética.
▪ Perfiles de distintos individuos dan lugar a
distintas bandas que se pueden comparar para
buscar coincidencias o diferencias.
Producción de insulina recombinante en bacterias
Producción de Vacunas recombinantes: Hepatitis B
Plantas farmaceúticas
(biofarmaceútica)
•Producción de proteínas
Vacunas, anticuerpos son mas
económicas y contienen
mecanismos de modificación
postraduccional de las proteínas,
a diferencia de las bacterias
Proteínas terapéuticas procedentes de bacterias recombinantes
Algunas proteínas recombinantes de hongos
 Actualmente se consiguen mejorar diferentes características con
técnicas de ADN recombinante -Plantas transgénicas-

Resistencia a herbicidas (mejora

vegetal)
Resistencia al glifosfato
herbicida no selectivo, con gen
de E. coli resistente, clonado e
incorporado
Resistencia a plagas, con
toxina de Bacillus turingiensis
Resistencia a virus, con
proteínas de la cápside del
virus.

FASES:
2. Regeneración
1. Transferencia
de plantas
de genes
completas
Arroz dorado
Enriquecido con beta-caroteno, el cual
se convierte en vitamina A en nuestro
cuerpo, Puede prevenir la ceguera
asociada a la malnutrición en países en
desarrollo cuya alimentación esté
basada en el arroz.

Maíz transgénico resistentes a plagas

y tolerante a los herbicidas
Produce proteínas que a las plagas no
les gusta, además no es necesario
utilizar insecticidas en las granjas. Se
comercializa en muchos países: EEUU
(85%), España (20%).

Tomates resistentes a la sal pueden

crecer en suelos salinos.
 Ovejas Leche de cabra con seda
productoras que contiene proteínas de
del Factor IX la seda de la araña, para
Producen extraerla comercialmente.
factores de El hilo de seda de la araña
coagulación es extremadamente fuerte
humanos en su y puede tener multitud de
leche, para los aplicaciones.
tratamientos de
Cerdos fluorescentes
hemofilia.
Las células fluorescentes de los cerdos se utilizan en
ovejas cuya leche contiene una proteína, alfa-1- trasplantes e injertos para estudiar el destino final de
antitripsina, que puede resultar valiosa para el las células trasplantadas en el cuerpo del hospedador.
tratamiento de la fibrosis quística.
Reses pueden dar leche que produce
eritropoyetina (una hormona que estimula la
síntesis de glóbulos rojos), factores de coagulación
(para el tratamiento de hemofilia) o proteínas que
disuelven coágulos (para tratar ataques cardiacos
producidos por coágulos de las arterias coronarias
Biorremedación: bacterias modificadas para degradar
hidrocarburos

Bioadsorción: Bacterias modificadas

que adsorben metales pesados
 Fitorremedación: Plantas transgénicas que transforman
contaminantes peligrosos en sustancias inocuas

Álamos modificados para acumular metales, actualmente

en condiciones controladas en invernadero

La fitoestabilización :plantas que inmovilizan los metales

en el suelo por absorción o adsorción en las raíces. Los
contaminantes permanecen retenidos bajo la superficie del
suelo

La fitoextracción: plantas tolerantes capaces de absorber

los metales desde el suelo y acumularlos en su biomasa
aérea. Posteriormente, esta biomasa es cosechada,
incinerada y tratada como residuo peligroso
1990 Proyecto Genoma Humano
El PGH un esfuerzo de colaboración internacional
con un plan a 15 años.
• Identificar todos los genes humanos, que
originalmente se estimaban entre 80.000 y
100.000 genes.
• Secuenciar los aproximadamente 3 mil millones
de pares de bases que se pensaba comprendían
los 24 diferentes cromosomas humanos
(cromosomas 1 al 22, X, Y).
14 de abril de 2003
«mapa» del genoma humano.
• El genoma humano consiste sólo en 20.000 a
25.000 genes codificadores de proteínas, no los
100.000 genes que se había predicho.
• Esta predicción se basaba principalmente en la
estimación de que las células humanas fabrican
aproximadamente de 100.000 a 150.000
proteínas.
El PGH también se diseñó para:
• Analizar variaciones genéticas entre seres
humanos. Esto incluía la identificación de
polimorfismos de nucleótidos simples.
• Cartografiar y secuenciar los genomas de
• Desarrollar nuevas técnicas de laboratorio,
tales como secuenciadores automatizados y
tecnologías informáticas de alta resolución
(incluyendo bases de datos de información
sobre el genoma) que pueden ser utilizadas
para avanzar en nuestro análisis y
comprensión de la estructura Difundir la
información sobre el genoma entre los
científicos y el público en general.
• Considerar los temas éticos, legales y
sociales que acompañan al Proyecto del
Genoma Humano y a la investigación
genética.
Lo que se aprendió del PGH
• El genoma humano consiste en unos 3,1 mil millones de pares de bases; 2,85 mil millones de
pares de bases ya se han secuenciado por completo.
• El genoma es aproximadamente el mismo en un 99,9 por ciento en personas de todas las
nacionalidades y orígenes.
• Menos del 2 por ciento del genoma codifica para los genes
• La gran mayoría de nuestro DNA no codifica proteínas y las secuencias de DNA repetidas
componen al menos el 50 por ciento del DNA no codificante.
• El genoma contiene aproximadamente de 20.000 a 25.000 genes codificadores de proteínas.
• Muchos genes humanos son capaces de fabricar más de una proteína, permitiendo que las
células humanas fabriquen tal vez de 80.000 a 100.000 proteínas a partir de sólo 20.000 a
25.000 genes.
• Las funciones de más de la mitad de todos los genes humanos son desconocidas.
• El cromosoma 1 es el que contiene el mayor número de genes. El cromosoma Y es el que
contiene menos genes.
• Gran parte del genoma humano muestra un alto grado de similitud en las secuencias con
genes de otros organismos.
• Se han identificado y mapeado miles de genes de enfermedades humanas en sus
localizaciones cromosómicas.
Comparación de genomas
Práctica: Evolución humana
Seminario: Impacto del proyecto genoma humano