Tema 13: Tecnología del ADN recombinante

Capítulo 20: La revolución molecular: biotecnología y más allá

20.1 Tecnología del ADN recombinante

• Biotecnología: aplicación de principios de la ingeniería a la producción de bienes y servicios mediante agentes
biológicos (microrganismos)
• Ingeniería genética: conjunto de técnicas que permiten manipular y alterar de forma intencionada el ADN
• Tecnología del ADN recombinante: técnicas empleadas en la manipulación de los genes
▪ Técnica del ADN recombinante: permite crear un ADN modificado
▪ ADN recombinante: es aquel que está creado (artificialmente) a partir de nuevas combinaciones de
secuencias de ADN, mediante corte y empalme de secuencias específicas
Se basa en los siguientes pasos:
1. Preparación del ADN que se quiere expresar: se selecciona el fragmento de ADN con el gen/genes de
interés y se corta con una endonucleasa de restricción
❖ Endonucleasa de restricción: enzima bactriano capaz de cortas las moléculas de ADN en
secuencias de bases específicas llamadas sitios de reconocimiento
2. Preparación del vector: un vector es un ADN capaz de transferirse a una célula y allí expresarse o
incluirse en su genoma
❖ Los vectores más utilizados son los plásmidos bacterianos, que son capaces de obtener copias de
una secuencia de ADN extraña. Además, estos se preparan cortándose con la endonucleasa de
restricción
3. Creación del ADN recombinante
1) Un plásmido contiene un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción especifica
 Los mismos sitios de reconocimiento están presentes en un fragmento del ADN extraño
2) Una endonucleasa de restricción corta los sitios de reconocimiento en el plásmido y en el ADN
extraño
3) Los cortes en el sitio de reconocimiento están espaciados
 De los fragmentos de ADN resultantes se dice que tienen extremos cohesivos, puesto que las
bases monocatenarias de un fragmento son complementarias de las bases del otro
 Como consecuencia de ello, los dos extremos complementarios se unen mediante enlaces de
hidrogeno entre sí
4) A continuación, los investigadores proceden a la unión de los fragmentos de ADN utilizando ADN
ligasa, creando así el ADN recombinante
4. Introducción del ADN recombinante en el organismo receptor: los plásmidos recombinantes son
introducidos en E. coli, haciendo que las células sean permeables al ADN
5. Clonación del ADN recombinante: se cultivan las bacterias para que produzcan copias idénticas del
ADN recombinante cada vez que se dividan
• Transformación: introducción de plásmidos recombinantes en células bacterianas:
▪ Células en transformación: aquellas que absorben ADN de su entorno y lo incorporan a sus genomas
▪ La mayor parte de las células bacterianas no captan ADN por si solas en condiciones de laboratorio. Por lo
que se utilizan sencillos tratamientos químicos o descargas eléctricas para aumentar la permeabilidad de
la membrana plasmática de la célula
▪ En el curso del tratamiento, en cada célula penetra un solo plásmido
 ▪ A continuación, las células se extienden sobre placas de cultivo en unas condiciones que permiten que se
desarrollen hasta formar colonias as células con plásmidos
▪ Lo normal es que ello se haga añadiendo antibióticos a las placas. Esto se hace para comprobar cuales
aportan el ADN recombinante, pues las que poseen el gen de resistencia a los antibióticos (aportado por el
plásmido) se desarrollan en colonias, y las que no mueren

• Uso de la transcriptasa inversa para producir ADNc: un enzima llamado transcriptasa inversa cataliza la síntesis
de ADN a partir de ARN
▪ El ADN producido a partir de ARN se denomina ADN complementario, o ADNc (v.biohabilidad 10)
▪ La transcriptasa inversa inicialmente produce ADNc monocatenario, también puede sintetizar la cadena
complementaria y generar ADN de doble cadena
▪ El enzima transcriptasa inversa es muy importante para la investigación pues los ADNc pueden ser clonados
y analizados para saber qué genes son expresados en un determinado tipo de célula y para conocer cuáles
son sus características, con tan solo un ARNm
 ▪ La técnica del ADN recombinante es un ejemplo de técnica de ingeniería genética
• La ingeniería genética en la agricultura: creación de plantas transgénicas con genes que les aportan resistencia
a las plagas y herbicidas, o capaces de producir nutrientes que de forma natural no podrían
▪ Todo esto mediante la técnica del ADN recombinante
▪ De este modo, las plantas se utilizan para investigan o crear un cultivo genéticamente modificado (GM)

20.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

• Técnica de ingeniería genética
• Reacción en cadena de la polimerasa: reacción de síntesis de ADN in vitro que emplea una ADN polimerasa para
replicar una sección específica de ADN una y otra vez.
• Requisitos de la PCR: la PCR es un proceso rápido y tecnológicamente sencillo, pero su inconveniente es que
solo es viable cuando el investigador ya dispone de alguna información sobre las secuencias de ADN próximas
al ADN en cuestión
▪ Esto es necesario porque, para realizar la PCR, hay que comenzar sintetizando fragmentos cortos de ADN
monocatenario que se emparejen con las secuencias situadas a ambos lados de la región de interés
▪ Estos segmentos cortos actúan como cebadores (iniciadores) de la reacción de síntesis de ADN
▪ Mirar biohabilidad 10: Proceso detallado
• Huella de ADN (también huella genética, perfil del ADN o tipificación del ADN): hace referencia a cualquier
técnica de identificación de las personas basada en las singularidades de su genoma
▪ Repeticiones en tándem: secuencias cortas de ADN repetidas una tras otra a lo largo de parte del
cromosoma, y que varían en número de repeticiones en los distintos individuos. Estas son la base de la
determinación de la huella de ADN
▪ Repeticiones cortas en tándem y minisatélites: repeticiones en tándem son de dos clases:
1. Repeticiones cortas en tándem (STR) (también como microsatélites o repeticiones de secuencias
simples (SSR)): son unidades repetidas con una longitud de entre 2 y 6 bases
2. Minisatélites o repeticiones en tándem de número variable (VNTR): son unidades repetidas con una
longitud de entre 8 y 100 bases
o Actualmente para determinar la huella genética se utilizan casi exclusivamente las STR, ya que sus
reducidas dimensiones hacen que sean más fáciles de amplificar mediante PCR
o Se cree que las STR se originan cuando la ADN polimerasa se salta bases o incorpora de manera errónea
bases adicionales durante la replicación
o Las STR son “hipervariables", que significa que varían en las diferentes personas mucho más que otros
tipos de secuencias, haciendo que sean idóneas para la determinación de la huella de ADN
o Alelo de STR: cada variante en el número de repeticiones. Esta es transmitida de padres a hijos igual
que cualquier otra secuencia de ADN
a. Determinación de la huella de ADN mediante PCR: se obtienen una muestra de ADN y se realizan pruebas
de PCR utilizando los cebadores que se sitúan a los lados de una región que contiene una STR o un
minisatélite
o Una vez que una STR se amplifica, la electroforesis con gel (v.Biohabilidad 6) se usa para determinar
el número de repeticiones
o Hay cebadores que permiten el análisis de múltiples STR en una sola PCR
o Ej: métodos de determinación de la huella genética del FBI amplifican 13 STR diferentes en distintas
localizaciones del genoma humano
20.3 Secuenciación del ADN
• El conocimiento de la secuencia de un gen es valioso por:
a. Si la secuencia es conocida, el código genético puede utilizarse para deducir la secuencia de aminoácidos,
que nos proporciona pistas referidas a la función de la proteína
b. Si la secuencia es conocida, podemos saber los motivos por los que los alelos varían su función. Ej: por qué
un alelo causa enfermedad y otro no
c. Las relaciones evolucionistas pueden identificarse comparando las secuencias de un mismo gen en
diferentes especies
• El primer método se remonta a 1977, cuando Frederick Sanger mostró una técnica llamada secuenciación
didesoxi, una reacción de síntesis de ADN in vitro que permite determinar la secuencia de bases del ADN (v.
biohabilicad 10)
• Los nuevos métodos de secuenciación, los llamados secuenciación de próxima generación, han hecho posible
la determinación rápida de la secuencia de genomas completos
• La mayoría de métodos de secuenciación de próxima generación se basan en los pasos de amplificación que
crean numerosas copias de la molécula de ADN empleada como plantilla
• Un inconveniente de estos métodos es que generan lecturas de secuencias cortas de solo 50-200 nucleótidos,
lo que dificulta el ensamblaje de un genoma completo
• Sin embargo, si se dispone de una secuencia del genoma completo del organismo, la secuenciación de próxima
generación es una manera rápida y poco costosa de obtener el genoma completo de un individuo en particular
• La secuenciación didesoxi continúa realizándose, en particular cuando es necesario leer secuencias largas con
gran precisión, si bien, en la actualidad, la secuenciación de próxima generación permite resultados más rápidos
• Secuenciación genoma completo
▪ Para secuenciar el genoma de una especie, se basan en un enfoque conocido como secuenciación aleatoria
(shotgun). En ella, numerosas copias de un genoma se rompen de manera aleatoria, obteniéndose
fragmentos de diferentes tamaños
▪ Dado que las fracturas son al azar y que hay numerosas copias del ADN genómico, cabe prever que estos
fragmentos se solapen en muchas regiones
▪ Ensamblaje genómico: proceso los fragmentos de ADN son secuenciados y las regiones de solapamiento
pueden emplearse como guías para recomponer de nuevo el genoma (v. biohabilidad 10)
• Bioinformática: campo que fusiona las matemáticas, la ciencia de la computación y la biología, para manejar y
analizar los datos referidos a las secuencias
▪ Se han creado bases de datos en las que se puede buscar información sobre secuencias, que permiten que
cualquier científico del mundo evalúe las similitudes existentes entre genes recién descubiertos y genes que
ya han sido estudiados previamente en otras especies
• ¿Qué genomas están siendo secuenciados y por qué?
▪ Los organismos seleccionados para la secuenciación de su genoma completo tienen interés por sus
propiedades biológicas. Ej: de los procariotas que habitan en entornos calientes, para descubrir enzimas
útiles para aplicaciones industriales a altas temperaturas o de arroz o maíz para mejorar los cultivos
• ¿Qué secuencias son genes?
▪ Anotación del genoma: proceso por el que se identifica qué regiones constituyen los genes y otras
secuencias
▪ En los procariotas, la identificación de los genes es relativamente sencilla, mientras que en los eucariotas es
más compleja
▪ Para anotar los genomas, los biólogos inician el proceso utilizando programas informáticos que examinan
la secuencia genómica en ambas direcciones
▪ Estos programas identifican cada uno de los marcos de lectura (secuencia continua de codones que no se
solapan) que son posibles en las dos cadenas de ADN
▪ Los codones constan de tres bases, por lo que son posibles tres marcos de lectura, lo que forma en conjunto
seis marcos de lectura (con ambas cadenas)
▪ En las secuencias generadas aleatoriamente se contiene un codón de terminación cada 20 codones
▪ Marco de lectura abierto (ORF): tramo largo de codones sin un codón de terminación
▪ En las bacterias, los programas centran su atención en los marcos de lectura abiertos de "tamaño gen" que
están flanqueados por un codón de parada y otro de inicio
▪ Los programas buscan secuencias de consenso típicas de los promotores, sitios de unión de los ribosomas
y otros sitios reguladores para encontrar secuencia codificante
▪ Una vez que se encuentra un ORF, otro programa informático compara su secuencia con las secuencias de
genes conocidos de otras especies
o Si el ORF no es conocido: es necesaria una ulterior investigación antes de que pueda ser considerado
un gen
o Si un ORF comparte una cantidad significativa de secuencia con un gen conocido de otra especie, es
muy probable que corresponda a un gen
▪ Si los genes son homólogos implica que son similares porque están relacionados por origen a partir de un
ancestro común
▪ Para explicar esta similitud, los biólogos han planteado la hipótesis de que el ancestro común tenía genes de
reparación de errores de emparejamiento, y que los descendientes de esta especie ancestral han retenido
estos genes reparadores, con modificaciones específicas en cada linaje
▪ La investigación de datos sobre secuencias eucariotas es más complicada. Pues las regiones codificantes son
interrumpidas por intrones, siendo más difícil de detectar ORF largos, en este contexto se combinan
diferentes enfoques
▪ Una de las estrategias consiste en aislar ARNm de las células, utilizar la transcriptasa inversa para producir
una versión del ADNc de cada ARNm y secuenciar el ADNc, con objeto de producir un mareador de secuencia
expresada (EST)
▪ A fin de localizar el gen que codifica el ARNm, se utilizan programas de emparejamiento de secuencias que
buscan coincidencias entre el ESTY una secuencia en el ADN genómico
20.4 Perspectivas del análisis genómico
• Evolución natural de los genomas procarióticos
Tras el análisis de las secuencias genómicas de miles de especies y cepas procarióticas distintas han surgidos
algunos principios:
▪ Los genomas procarióticos son compactos, pues las secuencias codificantes son ininterrumpidas, con escaso
espacio entre los genes
▪ Hacen un uso profuso de los operones y presentan secuencias reguladoras relativamente escasas
▪ Las especies bacterianas que viven en distintos hábitats y se alimentan de diversas moléculas tienen
genomas grandes
▪ Las especies parásitas que hacen uso de la maquinaria bioquímica del huésped, en vez de sintetizar sus
propias moléculas, tienen en cambio genomas pequeños
▪ La mayoría de los genes hallados en una especie no son compartidos por otras, solo un pequeño conjunto
de genes implicados en procesos fundamentales, como la replicación, transcripción y traducción del ADN,
son similares en una significativa proporción de procariotas
▪ El tamaño y el contenido del genoma varia notablemente entre especies
▪ Los genomas procariotas se reordenan con frecuencia a lo largo de la evolución
o Incluso especies estrechamente relacionadas muestran una escasa similitud en el orden de los genes
▪ Una proporción significativa de muchos de los genomas procariotas ha sido adquirida de otras especies, a
menudo con una relación distante
o Esto se conoce como transferencia lateral de genes, también llamada horizontal, que ha hecho que los
científicos se replanteen qué significa ser una especie
o Transferencia lateral de genes: en la definición tradicional de especie siempre viene que los miembros
integrantes de una especie no pueden intercambiar genes con los de otra, contradiciendo la
transferencia lateral de genes
o Los genes transferidos lateralmente se identifican mediante 2 criterios:
1. El gen de interés es mucho más similar a los genes de especies con una relación distante que a los
de especies con relación estrecha
 Ej: en la bacteria Thermotoga maritima, desarrollada en proximidad de las fuentes
hidrotermales de las profundidades marinas, casi el 25% de sus genes están relacionados
estrechamente con los de ciertas arqueas con las que comparte hábitat
 Los genes similares a los de las arqueas se presentan en agregados bien definidos en el genoma
de T. maritima, lo que avala la hipótesis de que estas secuencias fueron transferidas en
fragmentos grandes entre estos dos dominios de vida distintos
 2. La proporción de pares de bases G-C, con respecto a los pares de bases A-T, en un gen o serie de
genes en particular, es sustancialmente diferente de la composición de las bases del resto del
genoma
 Se cumple porque la proporción de pares de bases G-C en un genoma es característica de
un género o una especie
• ¿Cómo pueden pasar los genes de una especie a otra?
▪ En ciertos casos los responsables de la transferencia son los plásmidos
▪ Ej: se han documentado casos de transferencia de genes de resistencia a los antibióticos transmitidos por
plásmidos entre bacterias que guardan una correlación distante
▪ En muchos casos de transferencia lateral de genes, los genes transportados por los plásmidos se integran en
el cromosoma principal de una bacteria, por recombinación genética
▪ La transferencia lateral puede también producirse por transformación, cuando las bacterias y las arqueas
captan fragmentos de ADN del entorno, o por infección por virus, que toman ADN de una célula y lo
transfieren a otra
▪ Por otro lado, la transferencia lateral de genes en los eucariotas es menos habitual, pero en las
investigaciones se ha descubierto que esta desempeña un papel esencial en la evolución de los eucariotas
▪ Ej: captura de células bacterianas que fueron predecesoras de los actuales mitocondrias y cloroplastos y la
posterior transferencia de numerosos genes bacterianos al genoma del huésped
▪ No hay duda de que la transferencia lateral de genes tiene lugar incluso entre organismos relacionados a
distancia. Sin embargo, lo que no se sabe es en qué medida ello repercute en el árbol de la vida
▪ Metagenómica o secuenciación ambiental: estudio del material genético, el cual es obtenido directamente
de muestras ambientales
o La metagenómica es el único modo de controlar adecuadamente la evolución de los tipos de bacterias y
arqueas presentes en un determinado entorno
o Esto es debido a que los métodos tradicionales de identificación de especies se basan en el desarrollo de
especies en condiciones de laboratorio
o En los estudios recientes de metagenómica, se apreció una variedad en los tipos y la abundancia de las
especies en localizaciones determinadas en personas diferentes
• Evolución natural de los genomas eucarióticos
▪ La secuenciación de los genomas eucarióticos presenta 2 grandes problemas
1. El tamaño: el genoma bacteriano de mayores dimensiones cuenta con casi 15 millones de pares de
bases. Sin embargo, la mayoría de los genomas eucarióticos son mucho mayores
❖ Ej: el ser humano 3.000 millones de pares de baces y una flor japonesa Paris japonica, 149.000
millones de pares de bases
2. El ADN repetitivo: secuencias que están repetidas muchas veces
❖ Estas secuencias se presentan en numerosos genomas eucarióticos incluidos las STR y los
minisatélites, que se establecen entre genes o dentro de intrones y que no codifican productos
usados por el organismo
❖ Este ADN repetitivo complica el trabajo de alineación e interpretación de los datos de las
secuencias
▪ ADN repetitivo y elementos transponibles
o Las secuencias de ADN repetidas explican parcialmente la paradoja de la ingente variación de tamaño
de los genomas eucarióticos, pues el 50% de un genoma eucariótico consiste en secuencias repetidas
o Dado que la mayor parte del ADN repetitivo no codifica productos esenciales para la célula,
inicialmente se consideró “ADN basura". No obstante, posteriormente se demostró que muchas de
estas secuencias repetidas derivan de elementos transponibles, segmentos de ADN que pueden
insertarse en nuevas localizaciones en un genoma
o Más tarde su descubrimiento se constató que estaban presentes en los tres dominios de vida, además
de que tienen mucha importancia, pues presentan una amplia variedad de tipos y se difunden en los
genomas de modos muy diferentes
o Los procariotas tienen bastantes menos elementos transponibles que los eucariotas, hecho que ha
inspirado la hipótesis de que las bacterias y las arqueas cuentan con medios eficaces para eliminar los
elementos transponibles o con mecanismos que permiten impedir su inserción
o Algunos elementos se comportan de un modo similar al de ciertos virus, los llamados retrovirus, que
se insertan en el genoma
o Sin embargo, a diferencia de estos, los elementos transponibles habitualmente no abandonan la célula
huésped. En vez de eso, hacen copias de sí mismos, que se insertan en nuevas localizaciones
o Al formar parte del genoma, los elementos transponibles son transmitidos a la descendencia
o Ej: el elemento transponible denominado elemento nuclear intercalado largo (LINE), presente en
humanos y en otros animales
❖ Dado que los LINE codifican una transcriptasa inversa, como los retrovirus, y tienen una forma
similar de insertarse en el genoma y escindirse de él (se cree que los LINE derivan de los retrovirus)
❖ Nuestro genoma contiene casi un millón de LINE, cada uno de ellos con entre 1.000 y 5.000 pares
de bases de longitud
❖ Procedimiento que permiten la transposición de un LINE activo:
 ❖ A medida que los LINE, u otro elemento transponible, se desplazan de un lugar a otro, la inserción
en un nuevo sitio crea una mutación, que puede tener efectos negativos, neutros o positivos en
la eficacia, o aptitud, biológica
❖ Es posible que así se altere la secuencia codificante de los genes, que se modifiquen los patrones
de regulación génica o que se favorezca la duplicación y la pérdida de genes. De este modo, estos
invasores del genoma configuran su estructura, función y su evolución
❖ No obstante, la mayoría de los LINE y otros elementos transponibles en el genoma humano ya no
se desplazan por sus propios medios, porque se ha producido una mutación en un gen o elemento
regulador crítico. Así, contaminando el genoma y se designan como fósiles moleculares
o Familias de genes: ¿Cómo surgen los nuevos genes?
❖ En los eucariotas, surgen por la duplicación de los genes existentes, proceso que añade copias
adicionales de los genes al genoma
❖ Esto se deduce que se ha producido cuando encuentran grupos genes con semejanzas en sus
secuencias y en otras características, como la disposición de los exones e intrones
❖ En una especie, los genes con estructura y función similares se consideran parte de la misma
familia de genes y se les asigna una secuencia ancestral coincidente, desarrollada por
duplicación
❖ Una vía en la que los genes se duplican es el entrecruzamiento desigual durante la meiosis
 Con frecuencia, este proceso afecta a secuencias de ADN repetidas, como los elementos
transponibles
 Si un mismo tipo de elemento transponible, o cualquier otra secuencia de ADN repetida,
delimita un gen, en casos poco frecuentes puede producirse un cruzamiento en la meiosis
entre copias mal alineadas de una repetición de la secuencia
 Cuando esto sucede, una de las cromátidas presenta una deleción en el segmento de ADN
comprendido entre las repeticiones de una secuencia, y la cromátida homóloga presenta
una duplicación del segmento
 Como en las STR, los segmentos duplicados se ordenan en tándem, uno después del otro.
La duplicación de genes es importante porque el gen original aún es funcional y genera un
producto normal
 Como consecuencia, los nuevos segmentos duplicados de la secuencia son redundantes
 Si las mutaciones en la secuencia duplicada alteran el producto proteico, en la que se
incorpore una nueva función beneficiosa, un nuevo gen se habrá añadido al genoma
 En conjunto, estos procesos que crean nuevos genes se designan como de duplicación y
divergencia
 ❖ Las familias de genes son abundantes en los genomas eucarióticos. Ej: subgrupo de genes de la
globina humana
 Este grupo de genes se conoce como familia de genes de la β-globina, y codifica proteínas
que forman parte de la hemoglobina
 Cada uno de los genes codificantes de la familia desarrolla una función ligeramente
distinta
❖ Las mutaciones en regiones duplicadas pueden crear genes con nuevas funciones. Aunque,
esas mutaciones no suelen dan a genes funcionales
❖ Seudogén: miembro de una familia génica que se asemeja a un gen codificante, pero que no
codifica ningún producto funcional
❖ Cabe reseñar que la familia de la B-globina contiene seudogenes, junto con diversos genes que
codifican las proteínas
❖ Los seudogenes son frecuentes, en el genoma humano hay aproximadamente tantos
seudogenes como genes funcionales

• Perspectivas del Proyecto Genoma Humano

▪ El Proyecto Genoma Humano es un proyecto en el que se
consiguió secuenciar todo el genoma humano
▪ Los resultados más importantes fueron:
o Menos del 2% de exones codifican proteínas
o Casi la mitad de exones elementos transponibles
o Los intrones suponen cuarta parte del genoma y son
17 veces más abundantes que los exones que
codifican proteínas
▪ Una aplicación a la secuenciación del genoma completo es
el proyecto, Proyecto 1.000 Genomas, que tiene como
objetivo secuenciar más de 1.000 genomas de personas
seleccionas por todo el mundo y evaluar las similitudes y
diferencias, para comprender nuestra evolución
▪ También, a partir de este proyecto, se procedió a las comparaciones del genoma humano con el de otras
especies. Así comprobando, que el nº de genes humanos no es muy alto, pues solo es el 50% más que el de
una mosca de la fruta o un poco menos que el del arroz
▪ Muchos biólogos se esperaban un mayor nº de genes, pero esto es posible a:
o Corte y empalme alternativo: una hipótesis se basa en el corte y empalme alternativo o empalme
alternativo
❖ Cabe recordar que los exones de un determinado gen pueden cortarse y empalmarse de formas que
producen diferentes ARNM maduros
❖ En consecuencia, un mismo gen eucariótico codifica múltiples transcritos y, por lo tanto, múltiples
proteínas
 ❖ Se estiman que más del 95% de los genes humanos producen transcritos que son empalmados
alternativamente, con un promedio de más de tres ARNm distintos por cada gen que codifica
proteínas
❖ Significando que el nº de proteínas diferentes que pueden producirse es más del triple del nº de
genes
❖ El empalme alternativo hace posible que un nº reducido de genes produzca conjuntos de proteínas
mucho mayores
o ARN no codificantes: en torno al 90% del genoma humano es transcrito
❖ Algunos de estos transcritos codifican ARN reguladores con funciones conocidas, como los
micro-ARN
❖ También se ha descubierto el ARN no codificante largo, que se ha identificado en miles de genes.
No obstante, rara vez codifican proteínas y, al menos algunos de ellos, regulan la expresión génica

20.5 Hallazgo y manipulación de genes: la historia de la enfermedad de Huntington

• La genómica y la bioinformática han permitido que se encuentren genes basándose en sus secuencias y en
indicios derivados de genes descubiertos anteriormente
• Sin embargo, la información es insuficiente debido a que el conocimiento de la secuencia de un genoma
completo no proporciona ni tan siquiera un mínimo indicio de qué gen da lugar a un rasgo en particular
• Los investigadores utilizan el siguiente enfoque para encontrar los genes asociados a unos determinados rasgos:
se empieza examinando un mapa de sitios conocidos del genoma y, a continuación, se busca una asociación
entre uno de esos sitios conocidos y el fenotipo en el que se está interesado
▪ El gen que afecta al fenotipo está probablemente próximo al sitio conocido. Partiendo de este punto, de lo
que se trata es de buscar e identificar el gen en las secuencias de ADN próximas
▪ En la práctica, el proceso no es tan sencillo. Una el gen asociado a la enfermedad de Huntington
• Gen asociado a la enfermedad de Huntington: fue una de las primeras investigaciones que tuvo éxito sobre un
gen humano basado en un fenotipo
▪ La enfermedad de Huntington es una enfermedad poco frecuente
▪ En los primeros años, la persona desarrolla pequeños tics y movimientos anómalos. Con el tiempo, aparecen
espasmos y retorcimientos involuntarios, y la personalidad y la inteligencia se deterioran
▪ Tras un análisis el rasgo de la patología se relaciona con un único alelo autosómico dominante
▪ Para localizar e identificar el gen implicado, al iniciar la investigación elaboraron un mapa genético o mapa
de ligamiento, este muestra las posiciones relativas de los genes en el mismo cromosoma, determinadas
por análisis de la frecuencia de la recombinación entre pares de genes
▪ Los biólogos también utilizan mapas físicos del genoma, en el que muestra la posición absoluta de un gen a
lo largo de un cromosoma
▪ Los mapas genéticos útiles para identificar genes contienen marcadores genéticos, que son genes o
secuencias de ADN fácilmente identificables y de localización conocida
▪ La mayoría de los marcadores genéticos utilizados en los estudios de ligamiento solo ayudan a detectar, a
que tengan una localización conocida y que presenten diferentes formas (alelos)
▪ Por lo que, el objetivo de la investigación era encontrar un marcador genético que se heredara casi siempre
junto con el alelo causante de la enfermedad
▪ Cuando se estaba investigand, los mejores marcadores genéticos eran los sitios de reconocimiento de las
endonucleasas de restricción, que eran secuencias de ADN polimorfas
▪ Algunos alelos presentaban una secuencia que permitía que se produjeran cortes, y en otros, la secuencia
de ADN en el mismo sitio variaba ligeramente, y esos cortes no eran posibles
▪ Si un marcador y una enfermedad se heredan casi siempre juntas, significa que el gen del marcador y el gen
de la enfermedad están estrechamente ligados
▪ Si no fuera así, serian frecuentes los entrecruzamientos entre ellos y no se heredarían juntos

▪ En la actualidad, los investigadores disponen de un extenso catálogo de marcadores genéticos, entre los
que destacan los polimorfismos de nucleótido único (SNP)
▪ Un SNP es un sitio en el ADN que varía entre alelos para un mismo par de bases. Ej de SNP:

▪ En el genoma humano se han identificado unos 10 millones de SNP

▪ La mayoría se sitúan fuera de las regiones codificantes o reguladoras, y no tienen efectos directos sobre el
fenotipo
▪ Un estudio de ligamiento: otro planteamiento para encontrar el gen fue el estudio de ligamiento, que
dependía del seguimiento de la herencia del rasgo, la enfermedad de Huntington, y de numerosos
marcadores genéticos
o Para la investigación, se utilizó una extensa familia, en el que se analizaron sus ADN
o Cuando el equipo buscó asociaciones entre la presencia o ausencia del fenotipo de la enfermedad y los
marcadores genéticos, observaron que un marcador localizado en el cromosoma 4 estaba
estrechamente ligado a la enfermedad de Huntington
o Finalmente, delimitaron la localización del alelo a una región de 500.000 pares de bases
▪ Localización precisa del defecto: una vez establecida la localización general del gen, los biólogos buscaron
exones en la región de 500.000 pares de bases
o A continuación, secuenciaron esos exones en personas enfermas y sanas para determinar las bases
específicas que diferían en ambos grupos
o Se halló que las personas con la enfermedad tenían un nº inusualmente alto de codones CAG
(codificantes de glutamina) cerca del extremo 5' de un gen, con esto se concluyó la búsqueda del gen
• ¿Cómo se hallan los genes en la actualidad?: mediante estudio de asociación del genoma completo (GWAS)
▪ En este se utilizan los SNP conocidos en el genoma humano, junto con los métodos estadísticos y
bioinformáticos, que permiten una rápida búsqueda de asociaciones entre un determinado SNP y un rasgo
de enfermedad o, para los efectos, cualquier otro rasgo influido genéticamente
▪ En un GWAS, se determinan los genotipos de SNP de miles de personas con y sin el rasgo de interés
▪ A continuación, en aplicación de la noción de "culpabilidad por asociación" (fund para GWAS) se busca la
presencia concurrente (asociación) de un determinado alelo de SNP y de un rasgo en particular
▪ Si el rasgo y el alelo del SNP específico casi siempre se detectan juntos, se deduce que el gen del rasgo debe
situarse en proximidad de la localización conocida del SNP
▪ Esto se basa en que una mutación que contribuye al desarrollo de un nuevo rasgo, como una enfermedad,
aparece en un determinado cromosoma con un conjunto especifico de alelos de SNP
▪ Esta mutación se puede extender en la población, manteniendo asociada a otras regiones próximas del
cromosoma, incluidas las de los alelos de SNP específicos
▪ Esto se debe a que la probabilidad de que un entrecruzamiento en la meiosis separe la mutación asociada al
rasgo de los alelos de SNP se reduce cuando la distancia entre el SNP y el gen de interés es pequeña
▪ Dado que la secuencia del genoma humano está establecida, la posición del SNP identifica los genes vecinos
▪ En principio, uno de estos genes vecinos da lugar al rasgo o contribuye a su desarrollo
▪ Ventajas de un GWAS:
o No son necesarios árboles genealógicos multigeneracionales
o La localización del rasgo puede delimitarse a una localización muy pequeña, gracias a la escasa
separación entre los marcadores de los SNP
o Es posible el estudio de rasgos poligénicos
o Pueden ser identificados todos los alelos que contribuyen a la aparición de un rasgo en una población
• ¿Cuáles son los beneficios de encontrar el gen de una enfermedad? Estos son:
▪ Mejora del conocimiento del fenotipo: gracias a su identificación y secuenciación, se pueden desvelar los
motivos por los que su producto provoca la enfermedad
o Ej: la enfermedad de Huntington se produce por una gradual acumulación de aglomeraciones o
agregados de huntingtina, la proteína codificada por el gen de la enfermedad
o Los agregados de huntingtina son consecuencia directa del efecto de los segmentos largos de glutamina
producidos al aumentar el nº de repeticiones CAG en el gen de la enfermedad de Huntington
▪ Modelos de enfermedad en animales transgénicos: esto es posible gracias a la capacidad de manipular los
genomas y de crear organismos genéticamente modificados
o Modelo animal: animal de laboratorio con síntomas de enfermedad similares a los de una enfermedad
humana
o Una vez hallado el gen de Huntington, se introdujo un alelo defectuoso en ratones para buscar nuevos
tratamientos
o Estos producen versiones defectuosas de la proteína huntingtina y desarrollan una versión de la
enfermedad de Huntington
o Los modelos animales son útiles, puesto que pueden usarse para probar potenciales tratamientos
 ▪ Pruebas genéticas: cuando se identificó el gen de Huntington, se pudo desarrollar una prueba que detectara
el alelo defectuoso
o En ella, se toma una muestra de ADN y la región del cromosoma que contiene las repeticiones CAG, se
amplifica, mediante PCR
o Un número de repeticiones de 40 o más determina un diagnóstico positivo de desarrollo de
enfermedad de Huntington
• Terapia génica: técnica experimental que se consigue reemplazando las copias defectuosas del gen por alelos
normales, o aumentando el número de estos
▪ Para que la terapia génica tenga éxito, es necesario que cumplan tres requisitos fundamentales:
1. La enfermedad solo puede tener defectos en un solo gen
2. La secuencia del alelo asociada al fenotipo sano ha de conocerse
3. Debe disponerse de un método que permita introducir este alelo en las personas afectadas y que el
mismo se exprese en los tejidos adecuados, en la cantidad correcta y en el momento oportuno
▪ Si el alelo defectuoso es dominante, como en la enfermedad de Huntington, la tarea es más compleja: el
alelo introducido debe reemplazar físicamente al alelo dominante no deseado, o bien debe bloquear su
expresión
▪ Nuevas tecnologías ofrecen soluciones para la sustitución o el bloqueo de la expresión de los alelos
defectuosos. Ej: se está investigando la introducción de ARN de interferencia pequeños que actúen
específicamente sobre la degradación del ARNM en la enfermedad de Huntington
▪ Los investigadores han incorporado también un sistema de defensa bacteriano, llamado CRISPR-Cas9, que
actúa sobre el ADN vírico para destruirlo, manipulándolo para generar roturas en sitios específicos de las
dobles cadenas del ADN genómico eucariota, para a continuación introducir los cambios precisos en la
secuencia del genoma
o Estos incluyen la sustitución de un alelo defectuoso, como el de la enfermedad de Huntington, por un
alelo de función normal
▪ Por otro lado, recordamos el modo en el que las secuencias de ADN recombinante son incorporadas a
plásmidos y captadas por células de E. coli. Sin embargo, los humanos y otros mamíferos carecen de
plásmidos
▪ Así pues, los investigadores se han centrado en incorporar genes extraños a virus para introducirlos en las
células humanas
o Los virus han sido manipulados, de modo que puedan conducir los genes a las células, pero sin replicarse
para producir nuevos virus y los virus elegidos para el transporte normalmente integran su ADN en el
cromosoma de la célula huésped
o Así estos virus funcionan como vectores, para conducir los genes manipulados a los cromosomas de las
células diana
o Los genes liberados tienen el potencial de ser expresados y de generar un producto capaz de curar una
enfermedad genética
20.6 Genómica funcional, proteómica y biología de sistemas
• Genómica: estudia el genoma en su conjunto
• Secuencia genómica: lista de componentes. Una vez que los componentes de esa lista se han ensamblado, se
profundiza en su estudio para comprender el modo en el que los genes interactúan para producir un organismo
• Mientras que la secuenciación del genoma completo proporciona la lista de componentes, la genómica funcional
da respuesta a las preguntas sobre qué hacen los genes específicos, de qué modo se expresan y cómo actúan en
conjunto para generar un fenotipo
• ¿Qué es la genómica funcional? En la actualidad, los investigadores de genómica funcional pueden preguntarse
cómo, cuándo y dónde se expresan y actúan todos los genes de un organismo
▪ Este enfoque orientado al análisis a gran escala de la expresión génica es causado por la constatación de
que numerosos ARN y proteínas actúan conjuntamente para responder a ciertas situaciones ambientales
▪ Conocer la expresión de los genes aislados no suele ser suficiente
▪ Una micromatriz de ADN permite estudiar la expresión de miles de genes simultáneamente
▪ Como consecuencia de ello, pueden identificar qué conjuntos de genes son expresados de manera
concertada bajo condiciones específicas (v. biohabilidad 10)
▪ Las micromatrices pueden emplearse de diferentes maneras. Ej: para establecer que genes son transcritos
en los distintos órganos y tejidos, en cánceres o en respuesta a cambios en las condiciones ambientales
▪ Otro enfoque a gran escala destinado a la valoración de la expresión génica es la secuenciación directa de
ADNc mediante técnicas de secuenciación de próxima generación, denominados de secuenciación
profunda
▪ Por otra parte, las cantidades relativas de ADNc y, por consiguiente, del correspondiente ARNm, se
determinan por secuenciación extensa de una población de ADNc preparada a partir de un tipo celular o
tejido especifico. Ej: si los biólogos desean conocer los cambios en la expresión génica inducidos por una
hormona, prepararán dos conjuntos de ADNc diferentes, uno a partir de controles y otro a partir de células
tratadas con la hormona
o Tras la secuenciación de millones de ADNc, utilizarán herramientas de bioinformática para determinar
la frecuencia de cada tipo de ADNc en cada muestra, comparando las frecuencias registradas para
determinar el modo en el que el tratamiento hormonal altera la expresión génica
• ¿Qué es la proteómica? Es una disciplina que estudia el funcionamiento global del conjunto de proteínas
codificado por un mismo genoma. También se considera estudio del total de las proteínas de una célula o un
organismo
▪ Los biólogos utilizan los términos transcriptoma, para hacer referencia al conjunto de moléculas de ARN
transcritas en una determinada célula, y proteoma, para referirse al total de las proteínas producidas
▪ La proteómica empieza por establecer una lista de componentes del conjunto completo de las proteínas
presentes en una célula, tejido u organismo
▪ Las técnicas utilizadas para la identificación de proteínas son distintas a las del ADN
▪ En proteómica, se emplea una técnica llamada espectroscopia de masas, complementada con métodos
informáticos, para determinar las dimensiones precisas y la secuencia de aminoácidos, de cada proteína
presente en una muestra
▪ Tras identificar las proteínas individuales, estudian el modo en el que las proteínas presentes cambian con
el tiempo, interactúan y varían en las diferentes células
▪ Y este estudio, se centra en el análisis de todas las presentes
 ▪ Una extensión lógica del Proyecto Genoma Humano, catalogó las proteínas producidas en 30 tejidos
diferentes e identificó las codificadas por 17.000 de los 20.000 genes humanos
▪ Además de establecer un nivel basal para determinar los tipos de proteínas expresados en los diferentes
tejidos, los investigadores descubrieron que casi 200 proteínas eran codificadas en regiones del genoma
que antes se consideraban no codificantes
• La biología de sistemas se centra en el modo en el que las interacciones entre las partes individuales de un
sistema dan lugar a las propiedades de la vida, y se basa en la premisa de que el todo es mayor que la suma de
las partes. Ej: ¿qué repercusiones tiene en el metabolismo la interactuación de las proteínas en el interior de una
célula?
▪ Las propiedades como estas, que surgen en un nivel de organización a partir de elementos más simples
pertenecientes a otro nivel de organización inferior, se designan como propiedades emergentes. Ej:
replicación del ADN, el metabolismo, el cáncer son pues se desarrollan a partir de interacciones entre
elementos más simples, genes y proteínas, que no exhiben tales propiedades en sí mismas
▪ Las propiedades emergentes son casi imposibles, de predecir conociendo solo las partes individuales de un
sistema
▪ Muchas de las investigaciones sobre biología de sistemas se centran en el trazado de mapas de
interacciones entre genes o proteínas en determinados tipos de células
▪ La genómica y la proteómica proporcionan el conjunto de partes necesario para iniciar los estudios de
biología de sistemas
▪ El trabajo de un biólogo de sistemas consiste en conocer el modo en el que estas partes se vinculan entre sí
formando redes y en el que las nuevas propiedades emergen a partir de estas interacciones