BIOLOGÍA MOLECULAR Y

CITOGENÉTICA

UNIDAD DIDÁCTICA 7

CLONACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

DANIEL BRELL MARTÍN
LDO. BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
CFGS EN ANATOMÍA PATOLÓGICA Y CITODIAGNÓSTICO
 LOS MÉTODOS DE CLONACIÓN MOLECULAR
❖ Clonación molecular: proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o de ADN monocatenario
basada en la tecnología recombinante.
❖ El proceso de clonación implica:
1. Creación de moléculas de ADN recombinante por aplicación de técnicas de BM (Ej: enzimas de restricción).
2. Inserción del fragmento recombinante que se quiere amplificar en una molécula portadora o vector.
3. Introducción del vector recombinante en una célula viva hospedadora.
4. Selección y multiplicación en cultivo de células hospedadoras del ADN recombinante.
5. Recuperación del fragmento amplificado.

❖ Principales ventajas de la clonación molecular:

❖ Permite obtener cantidades ilimitadas de la secuencia de interés.
❖ Permite la clonación de secuencias de ADN de gran tamaño, en función del vector utilizado.
❖ Posibilita la creación de librerías genómicas (clones de genomas completos de organismos) y de ADNc
(clones de ARNm de distintos organismos).
❖ Tiene numerosas aplicaciones en producción y expresión génica (Ej: hormonas, proteínas, OMGs, etc.)
 LOS MÉTODOS DE CLONACIÓN MOLECULAR

Esquema general de la clonación. Una vez que se ha conseguido la molécula de ADN

recombinante adecuada y se ha introducido en el huésped adecuado, se genera un clon
de células genéticamente idénticas (todas portan el vector recombinante) que se pueden
almacenar y propagar en cultivo indefinidamente.
 COMPONENTES DE LA CLONACIÓN
❖ Vectores de clonación: moléculas de ADN que pueden replicarse autónomamente en una célula huésped, permitiendo
además la inserción de un ADN foráneo (inserto) a la vez que mantienen sus propiedades replicativas.
❖ Características de los vectores de clonación → una molécula debe reunir las siguientes características para poder ser
utilizada como vector de clonación:
❖ Tener un origen de replicación que le permita replicarse dentro de la célula huésped junto con el inserto que
transporte.
❖ Presentar, como mínimo, un sitio de inserción de ADN foráneo (normalmente, serán secuencias dianas afines al
ataque por enzimas de restricción).
❖ Sitio múltiple de clonación / restricción (polylinker) → segmento corto del vector de clonación que reúne
todas (o la gran mayoría) de secuencias de restricción.
❖ Contener algún marcador de selección, que permita distinguir las células que portan el vector de aquellas que no lo
portan.
❖ Contener un marcador de identificación, que permita distinguir las células que portan un vector recombinante con
inserto, de aquellas que presentan un vector de recombinación sin inserto.
❖ Algunos vectores especiales incorporan un promotor (secuencia génica a partir de la cual se inicia el proceso
celular de transcripción del inserto y su posterior traducción a proteína).
 COMPONENTES DE LA CLONACIÓN
❖ Vectores de clonación.
❖ Tipos de vectores de clonación → la mayoría se diferencian por el origen de la molécula, la disposición de
los elementos que la integran y el tamaño del inserto que pueden incorporar. Distinguimos los siguientes:
❖ Plásmidos → moléculas circulares de ADN bicatenario extracromosómico de origen bacteriano con
capacidad autónoma de replicación.
❖ A la hora de elegir el plásmido idóneo intervienen dos parámetros importantes:
❖ El tamaño del inserto que puede transportar.
❖ El número de copias del plásmido por célula que puede alcanzar tras su replicación en la célula
hospedadora.
❖ Algunos de los plásmidos más utilizados son:
❖ El plásmido pBR322 (puede transportar fragmentos de ADN relativamente pequeños con un n.º de copias
aprox. de 20).
❖ El plásmido pUC18 (muy utilizado por su capacidad para aceptar insertos de hasta 10 kb y su alta tasa de
replicación).
 COMPONENTES DE LA CLONACIÓN
❖ Vectores de clonación.
❖ Tipos de vectores de clonación

Estructura del plásmido pUC18 con la Estructura del plásmido pBR322 con la
localización del origen de replicación (Ori), el localización del origen de replicación (Ori),
gen de resistencia a la ampicilina, el gen LacZα los genes de resistencia a la ampicilina y la
y el polylinker con las dianas de restricción. tetraciclina y las dianas de restricción.
 COMPONENTES DE LA CLONACIÓN
❖ Vectores de clonación.
❖ Tipos de vectores de clonación
❖ Bacteriófagos (fagos) → son virus que infectan bacterias e introducen su material genético con el objetivo
de adueñarse de la maquinaria metabólica de la célula, tras lo cual pueden llevar a
cabo uno de los siguientes ciclos:
❖ Ciclo lítico → el material genético del virus
(cromosoma vírico) se replica y da lugar a
nuevos virus que se liberan al medio extracelular
una vez lisan la célula hospedadora.

❖ Ciclo lisogénico → el cromosoma vírico se

recombina con el cromosoma bacteriano. Es el
caso del fago λ, uno de los más usados como
vector de clonación, con capacidad para admitir
insertos de hasta 20 kb.
 COMPONENTES DE LA CLONACIÓN
❖ Vectores de clonación.
❖ Tipos de vectores de clonación
❖ Cósmidos → vectores híbridos construidos por combinación del cromosoma del fago λ (secuencias cos) y
de un plásmido bacteriano (origen de replicación + gen de resistencia a antibióticos + polylinker).
Admiten insertos de hasta 50 kb.

❖ Fagémidos → vectores híbridos compuestos por un plásmido bacteriano (con su respectivo origen de
replicación) al que se le inserta el origen de replicación de un fago M13. Muy útiles para ensayos
de secuenciación y para producción de sondas monocatenarias.

❖ Cromosomas artificiales → vectores de clonación de alta capacidad para transportar fragmentos de gran tamaño.
Son idóneos para la construcción de genotecas, siendo los más utilizados:
❖ Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) → permiten insertos de hasta 300 kb.
❖ Cromosomas artificiales de levaduras (YAC) → son los de mayor capacidad (insertos > 1 Mb).
 COMPONENTES DE LA CLONACIÓN
❖ Vectores de clonación. B
❖ Tipos de vectores de clonación
❖ Vectores lanzadera → vectores híbridos que poseen orígenes de replicación
de dos hospedadores distintos (normal/, uno de plásmido bacteriano y otro de
levadura o de virus animal). Muy útiles para estudios de expresión genética,
pues permiten transportar insertos entre dos hospedadores distintos.
A
A) Estructura de un cromosoma artificial bacteriano (BAC),
basado en el plásmido F de E. coli. El BAC mantiene los
genes que controlan la replicación y el número de copias del
plásmido, un origen de replicación, un gen de resistencia al
cloranfenicol y un polylinker en el interior del gen LacZ.
B) Estructura de un cromosoma artificial de levadura (YAC),
que contiene un origen de replicación (Ori), un centrómero
(CEN), dos secuencias teloméricas (TEL), dos marcadores de
selección (A y B) y un polylinker en el interior de un gen de
identificación (C). Mediante tratamiento con la enzima de
restricción 1 (Enz 1) se lineariza el YAC.
 COMPONENTES DE LA CLONACIÓN
❖ Células hospedadoras → aquellas en las que se introduce el vector de clonación para su amplificación.
❖ La elección de la célula hospedadora, tanto procariota como eucariota, depende del vector de clonación empleado y del
objetivo del ensayo (sistema vector / hospedador):
❖ Células hospedadoras → gran versatilidad, baja complejidad técnica y alta tasa de crecimiento poblacional. Las
especies más usadas en clonación son E. coli (cepa K12), Bacillus subtilis y varias
especies del género Streptomyces.

❖ Células hospedadoras eucariotas

❖ Levaduras: se usan como hospedadores para clonar YAC y ciertos plásmidos de levaduras, siendo la más
utilizada en clonación Saccharomyces cerevisiae.
❖ Células vegetales y animales: este tipo de células se usan generalmente para ensayos de clonación
encaminados a la inserción de genes foráneos en su genoma y su posterior expresión para obtener
organismos transgénicos.
❖ En el caso de células vegetales, se suelen utilizar vectores basados en el plásmido Ti de la bacteria
Agrobacterium tumefaciens.
❖ En el caso de células animales, se suelen utilizar vectores víricos.
 FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN
❖ El proceso de clonación se desarrolla, con independencia del vector empleado y de la célula hospedadora
seleccionada, en tres fases:
❖ Fase I: Creación de un vector recombinante.
❖ Fase II: Introducción del vector recombinante en la célula hospedadora.
❖ Fase III: Selección e identificación de los clones que portan la secuencia de interés.

❖ Fase I: Creación de un vector recombinante

❖ Requiere la preparación previa del ADN que se pretende clonar, así como del vector de clonación (creación
de extremos cohesivos y complementarios entre ambas moléculas, que permitan la unión vía enzimática o
vía ligasa).
❖ Preparación del ADN que se pretende clonar
❖ Tratamiento del ADN bicatenario con enzimas de restricción (general/, compatibles con el vector
de clonación y sin secuencia diana interior).
❖ La compatibilidad con el vector implica que éste debe tener una diana de restricción para la misma
enzima.
❖ Cuando se pretende clonar un único gen, es preferible realizar una amplificación PCR previa.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN

Fases generales del proceso de clonación.

 FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN
❖ Fase I: Creación de un vector recombinante
❖ Preparación del vector de clonación
❖ Digestión con la misma enzima de restricción utilizada para generar los fragmentos de la
secuencia a clonar. Hay cuatro situaciones de partida posibles:
❖ Vector circular con diana de restricción única → tras el tratamiento enzimático, el vector
se transforma en una molécula lineal de extremos cohesivos (Ej. La gran mayoría de
plásmidos).

❖ Vector circular con dos dianas de restricción → tras el tratamiento enzimático, se obtiene
dos moléculas lineales con extremos cohesivos, de tamaños muy diferentes: grande
(conteniendo marcadores de selección e identificación, siendo la base del vector de
clonación) y pequeño (sin relevancia genética, siendo sustituido por el inserto).

❖ Vector lineal con una diana de restricción única → tras el tratamiento enzimático, se
obtienen dos brazos (izquierdo y derecho), cada uno con un extremo romo y un extremo
cohesivo.
 FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN
❖ Fase I: Creación de un vector recombinante
❖ Preparación del vector de
clonación
❖ Vector lineal con dos dianas
de restricción → tras el
tratamiento enzimático, se
obtienen dos brazos (izquierdo
y derecho, portando los
marcadores de selección e
identificación), con un
extremo romo y otro cohesivo,
y una región central
flanqueada por extremos
cohesivos que será sustituida
por el inserto (Ej: el fago λ).
 FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN
❖ Fase I: Creación de un vector recombinante
❖ Inserción del ADN foráneo (inserto) en el vector
❖ Se lleva a cabo por incubación de ambos a concentraciones adecuadas y condiciones óptimas que
favorezcan la unión de las moléculas por sus extremos cohesivos, en presencia de una ADN ligasa
(o por actividad exonucleasa de la propia enzima).
❖ La ligasa sellará covalentemente las mellas en la doble hélice de ADN (ligación), dando lugar al
vector recombinante.
❖ Los productos no deseados formados durante la ligación (Ej: vectores recircularizados, vectores
sin inserto, vectores unidos entre sí, etc.) serán eliminados en fases posteriores de la clonación,
mediante el uso de los marcadores de selección e identificación celulares.
 FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN
❖ Fase II: Introducción del vector recombinante en la célula hospedadora.
❖ Dependiendo del tipo de vector empleado distinguimos varios métodos:
❖ Transformación bacteriana → captación e internalización de moléculas de ADN desnudas
extracelulares por parte de una bacteria.
❖ No todas las bacterias pueden llevar a cabo este proceso (solo son capaces las competentes).
❖ Algunos géneros bacterianos son competentes de forma natural (Streptococcus, Bacillus,
Pseudomonas, etc).
❖ E. coli constituye la especie bacteriana más utilizada como hospedadora.Sin embargo, no es
competente de forma natural, por lo que requiere tratamiento químico (adición de CaCl2) o
físico (choque térmico), que aumente la permeabilidad de la membrana plasmática y la pared
celular, facilitando la incorporación del vector recombinante.
❖ Transfección → introducción de vectores recombinantes (sin intervención de virus) en células
eucariotas.
❖ Esté método implica el uso de agentes químicos [Ej: solución tamponada de Ca3(PO4)2] o la
introducción del vector en liposomas.
 FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN
❖ Fase II: Introducción del vector recombinante en la célula hospedadora.
❖ Dependiendo del tipo de vector empleado distinguimos varios métodos:
❖ Transducción → introducción de material genético extraño en una célula por acción de un virus.
❖ El vector recombinante se empaqueta en la cápside de un virus con el que se infecta un
cultivo de células hospedadoras.
❖ Generalmente, se utilizan fagos recombinantes o cósmidos empaquetados en fagos, aunque
también pueden usarse otros géneros de virus como agentes para la inserción de vectores
recombinantes en células hospedadoras (Ej: adenovirus, baculovirus, retrovirus, etc).

❖ Electroporación → aplicación de cortos pulsos eléctricos de alto voltaje a una mezcla de células
hospedadoras en suspensión y vectores recombinantes en solución.
❖ La generación de pulsos eléctricos provoca un aumento de la permeabilidad de la membrana
plasmática, lo que favorece el paso de los vectores hacia el interior celular.
❖ Constituye un método de gran eficiencia, aplicable a todo tipo de células hospedadoras.
 FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN
❖ Fase III: Selección e identificación de los clones que portan la secuencia de interés.
❖ Tras la inserción del vector recombinante en la célula hospedadora se obtienen tres tipos de células:
❖ Células no transformadas (no han captado el vector recombinante).
❖ Células transformadas (portan el vector recombinante).
❖ Células transformadas portadoras de un vector no recombinante o de un ADN no deseado.
❖ La determinación de estos tres tipos celulares implica procesos de selección (eliminación de células no
transformadas) e identificación de los clones recombinantes.
❖ Ambos procesos se encuentran condicionados a la existencia de ciertos marcadores genéticos en las células
que portan el vector recombinante:
❖ Genes de resistencia a antibióticos → se basa en el empleo de vectores con dos genes de
resistencia a antibióticos, uno de ellos con el punto de inserción del ADN inserto en su interior
(inactivación genética por inserción).
❖ Proteínas fluorescentes → se basa en el empleo de vectores con un gen de resistencia (marcador
de selección) y un gen que codifica una proteína fluorescente (la GFP, marcador de identificación)
con una secuencia polylinker en su interior (inactivación genética por inserción).
 FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN
❖ Fase III: Selección e identificación de los clones que portan la secuencia de interés.
❖ Genes de resistencia a antibióticos

Selección e identificación de colonias

con plásmidos recombinantes basados
en dos genes de resistencia a
antibióticos.
En una placa con ampicilina crecen todas
las bacterias transformadas, puesto que
todos los vectores conservan intacto el
gen de resistencia para ese antibiótico. En
la placa con tetraciclina solo crecen las
bacterias transformadas con el plásmido
no recombinante, ya que en el plásmido
recombinante el gen de resistencia a la
tetraciclina se ha inactivado por inserción
del ADN extraño.
 FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN
❖ Fase III: Selección e identificación de los clones que portan la secuencia de interés.
❖ Ambos procesos se encuentran condicionados a la existencia de ciertos marcadores genéticos en las células
que portan el vector recombinante:

❖ Estrategia cromogénica → se utilizan bacterias hospedadoras lac- [gen lacZ con una región
polylinker en su interior (inactivación génica por inserción)], sensibles a un determinado
antibiótico cuya resistencia será codificada por el ADN inserto.
❖ La selección e identificación es simultánea por cultivo de las bacterias hospedadoras en un
medio sólido con antibiótico + inductor del operón lac y un sustrato cromogénico X-gal
[bacterias con VR (lac-)→ colonias blancas / bacterias con VNR (lac+) → colonias azules).

❖ Genes letales → se basa en el uso de vectores con un gen de resistencia a un antibiótico (permite
la selección) y un gen que codifique una proteína letal para la bacteria hospedadora (marcador de
identificación) con una secuencia polylinker en su interior (inactivación génica por inserción).
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN
❖ Tasa de transformación → eficiencia de introducción del vector de
recombinación en la célula hospedadora.
❖ VT: volumen total de la solución en la que se realiza la
transformación (en μl)
❖ C: cantidad de vector empleado (VR y VNR, en μg).
❖ Vs: volumen de suspensión bacteriana transformada utilizada
para siembra de una placa con medio de cultivo sólido.
❖ UFC: unidades formadoras de colonias que crecen en esa placa.
❖ Se expresa como n.º de células transformadas / μg de vector.
Esquema de clonación en un BAC
La selección e identificación de los clones recombinantes se realiza
simultáneamente mediante un gen de resistencia al cloranfenicol y una reacción
coloreada basada en la acción de la β-galactosidasa sobre un sustrato cromogénico.
Selección e identificación de colonias
con plásmidos recombinantes basados
en dos genes de resistencia a
antibióticos.
En una placa con ampicilina crecen todas
las bacterias transformadas, puesto que
todos los vectores conservan intacto el
gen de resistencia para ese antibiótico. En
la placa con tetraciclina solo crecen las
bacterias transformadas con el plásmido
no recombinante, ya que en el plásmido
recombinante el gen de resistencia a la
tetraciclina se ha inactivado por inserción
del ADN extraño.
 BIBLIOTECAS DE ADN
❖ Biblioteca de ADN: colección de vectores recombinantes clonados cuyas secuencias de ADN extraño (insertos) se
han obtenido de un único organismo.

❖ Tipos de bibliotecas de ADN → tres tipos, en función del origen del ADN:

❖ Bibliotecas genómicas → colecciones de VR clonados que incluyen el genoma completo de un organismo.

- En una biblioteca genómica

están representados todos los
genes de un organismo.
- En su construcción suelen
usarse vectores de alta
capacidad (fagos, cósmidos,
BAC o YAC).
Obtención de una biblioteca genómica en fagos e
identificación de un clon recombinante concreto
mediante hibridación en placas virales.
 BIBLIOTECAS DE ADN
❖ Tipos de bibliotecas de ADN → tres tipos, en función del origen del ADN:

❖ Bibliotecas cromosómicas → bibliotecas de ADN construidas a partir de un único cromosoma o

fracción cromosómica.
- Se obtienen por aislamiento de un único cromosoma de células mitóticas en metafase.

❖ Bibliotecas de ADNc → obtenidas a partir del ARNm de un tejido o población celular determinada,
tras una transcripción inversa mediada por una enzima retrotranscriptasa.
- Representan un subconjunto de genes de un organismo que se están expresando en un tipo
celular y en un estado metabólico concreto.
- Cada gen clonado carece de los intrones, promotores y secuencias reguladoras presentes en la
secuencia original.
 BIBLIOTECAS DE ADN
❖ Análisis de una biblioteca de ADN → involucra tres pasos fundamentales:

1. Identificación de los clones que contienen un gen o secuencia concreta, a través de técnicas de
hibridación del ADN con una sonda o también mediante técnicas inmunológicas para la
detección de ciertas proteínas.

2. Paseo cromosómico o identificación de clones que porten secuencias consecutivas, de forma

que permita localizar sucesivamente clones con insertos de ADN que se solapan parcialmente,
permitiendo el mapeo físico y la clonación posicional de una determinada biblioteca.

3. Secuenciación del ADN insertado que porta el vector recombinante en un clon concreto, de
manera que la secuenciación de todos los clones de una biblioteca proporcione la codificación
completa del genoma clonado, encontrándose dichas secuencias alineadas en base a los
solapamientos.
APLICACIONES DE LA CLONACIÓN MOLECULAR
❖ Entre las principales aplicaciones de la clonación molecular podemos destacar las siguientes:
❖ Proporciona cantidades prácticamente ilimitadas de cualquier gen o secuencia de interés.
❖ Posibilita la expresión de genes concretos y su integración en el genoma de un organismo determinado.
❖ Constituye una herramienta que facilita secuenciación completa de cualquier organismo, con el fin de
establecer relaciones de parentesco evolutivo, filogenia, así como diversidad y expresión genéticas.
❖ Producción industrial de proteínas recombinantes (Ej: insulina, GH, vacunas, enzimas y catalizadores
químicos, OMGs capaces de biodegradar ciertos productos nocivos para el medioambiente, etc.)
❖ Mejora genética de organismos a los que se les confiere resistencia frente a algún tipo de sustancia o estrés
medioambiental (organismos transgénicos u OMGs).
❖ Medicina existen dos aplicaciones de la clonación molecular con una especial relevancia:
❖ Ratones transgénicos → ratones a los que se les ha modificado su ADN (por inserción o eliminación
de algún gen) para realizar estudios en torno a ciertas enfermedades genéticas.
❖ Terapia genética → transferencia de genes normales a células somáticas para corregir una enfermedad
genética concreta.