UD.11.

MÉTODOS DE CLONACIÓN Y
SECUENCIACIÓN DEL ADN
BMC 18-20
ÁNGELES OLCINA
 1.Introducción
Descubrimiento (1950)
Genes : cadenas de nucleótidos
Los biólogos moleculares
aprendieron a alterar genes,
cortar y pegar pedazos de
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE ADN de diferentes
INGENIERÍA GENÉTICA organismos y moverlos de
uno a otro.

ADN recombinante: molécula que proviene de la

unión artificial de 2 fragmentos de ADN.
Tecnología del ADN recombinante: conjunto de
técnicas que permiten aislar un gen( ADN o ARN) de
un organismo ( animal, vegetal, bacteria, hongo) o
un virus produzca una proteína que le sea
totalmente extraña.

Ej. Producción de proteínas humanas a gran escala a partir de bacteriasà

Biotecnología : utilización de organismos vivos o de sus productos con fines
prácticos.
2
 1.Introducción
1.Cómo producir grandes
cantidades de genes? PLÁSMIDOS
2.Cómo introducirlos en las Obtener moléculas de
bacterias u otras células huésped? ADN recombinante

Obtenemos así millones de copias del ADN

incorporado, y dado que todas provienen de
una única molécula multiplicada a partir de una
única bacteria que dio lugar a la colonia:à estas
técnicas reciben el nombre:
CLONACIÓN
Amplificación selectiva de una secuencia o
fragmento específico de ADN.

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 1.Introducción
La tecnología del ADN recombinante se agrupa en 2
áreas:
v 1º parte de esta unidad: Técnicas de clonado:
amplificar selectiva/ una secuencia específica de
ADN.

v 2º parte de esta unidad: Métodos de análisis del

ADN: Secuenciación: mutaciones, predecir la
naturaleza y funcionalidad de los productos
codificados ….
Mucha información à herramientas bioinformáticas y
eficaz base de datos

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 2.CLONACIÓN MOLECULAR
Copia genéticamente
idéntica CLON CLONACIÓN

CLONACIÓN MOLECULAR
copiar una sec concreta de
un AN

Un proceso de amplificación IN VIVO de sec

de ADN genómico o de ADNc basada en la
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Colocará un fragmento de ADN PORTADOR DEL GEN O LA SECUENCIA

que interesa dentro de una molécula de ADN EXTRACROMOSÓMICO
( general/ plásmido) con capacidad de autorreplicarse en el interior
de una bacteria . La bacteria transcribe y traduce el segmento de
ADN introducido, de esta forma se obtiene múltiples copias con
rápidez. 5
 2.1.Tipos de clonación y fases del
procedimiento de clonación
• 2 tipos de clonado:
– Replicación del ADN
naturales de las
células in vivo
– Técnica que emplea la Molécula de ADN
reacción en cadena de recombinante

la polimerasa in vitro

Genero un clon de células

genéticamente idénticas ,
todas portan el vector
recombinante

ADN extracromosómico
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7
 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
clonación
• El clonado IN VIVO incluye los sig pasos:
– A. Generación de fragmentos de ADN
– B. Recombinación de los fragmentos de ADN
– C. VECTORES
– D. Transformación del organismo huésped
– E. Búsqueda de los vectores recombinantes
– F. Selección de clones específicos

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2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de clonación
• A. Generación de fragmentos de ADN
– Empleo enzimas de restricción tipo II

ENZIMA ORGANISMO Sitio rotura 5’ – 3’

BamHI Bacillus amyloliquefaciens G•GATCC
H
EcoRI G•AATTC
Escherichia coli RY 13 GG•CC
Hae III
Hind III Haemophilus aegyptius A•AGCTT
GTT•AAC
Hpa I Haemophilus influenzae Rd
Haemophilus parainfluenzae
Pst I CTGCA•G
Sma l Providencia stuartií
CCC•GGG
Serratia marcescens
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 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
clonación

• A. Generación de fragmentos de ADN

Las enzimas de restricción son enzimas bacterianas capaces de cortar el
ADN en todos los sitios que contienen una secuencia de reconocimiento
específica de pequeño tamaño, por lo general de 4 a 8 pares de bases.
Estas enzimas permiten cortar el ADN en fragmentos definidos que
pueden unirse con facilidad a otros fragmentos de ADN cortados de manera
similar.
Se han aislado más de 30 enzimas de restricción diferentes a partir de
varios organismos bacterianos.
Las endonucleasas de restricción se denominan de acuerdo con el
organismo del que derivan, por ejemplo Eco Rl deriva de E.coli y fue la
primera enzima de restricción aislada de un microorganismo.

10
 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
clonación
• A. Generación de fragmentos de ADN
• Enz R reconocen sec palindrómicas de 4-6 nucleótidos

• La acción de la enzima provoca rotura en doble cadena

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 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
clonación
• A. Generación de fragmentos de ADN
– Todos los ADN de una misma fuente tratados con
la misma enzima de restriscción producirá la
misma colección de fragmentos de ADN.
Patrones de restricción
Fragmentos de restricción

Al conjunto de todos
BIBLIOTECA GÉNICA

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 2.1.Tipos de clonación y fases del
procedimiento de clonación
• B. Recombinación de los fragmentos de ADN
– La misma enz produce frag con idénticos extremos complementarios (
cohesivos o romos)
– Si fuesen frag de 2 fuentes diferentes con una misma enz de restricción.
Los extremos cohesivos podrían unirse por la acción enzima ADN ligasaà
ADN RECOMBINANTE

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 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
clonación
• C. Vectores o replicón
– Molécula de ADN de naturaleza variable ( bacteria, virus,
levadura , células vegetales, animales ) a la que se le
incorpora un ADN exógeno o diana formando una
molécula de ADN recombinante independiente dentro de
un organismo huésped, permite la producción de múltiples
copias de la sí misma

14
Formación de ADN recombinante a partir de plásmidos

15
 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
clonación
• Características de los vectores de clonación**:
– Debe ser fácil su aislamiento en forma pura
– No deben modificarse ni modificar el ADN de la célula huésped tras su
inserción
– Deben presentar varios sitios de restricción que permitan la unión al ADN
exógeno
– Deben ser capaces de replicarse de forma activa en la célula huésped
– Tener un origen de replicación
– Deben tener un tamaño pequeño con el fin de manipularlos con facilidad e
insertarles una mayor cantidad del ADN diana
– Han de tener propiedades que permitan seleccionar de manera simple las
células que los hayan incorporado.
– Contener un marcador de selección ( célula que portan v de las q no portan)
– Contener un marcador de identificación ( célula que portan vector
recombinante con ADN extraño , de célula que portan vector recombinante
sin ADN extraño)

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 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
clonación
• Tipos de vectores
– Plásmidos
• Peq moléc de ADN bicatenario circular (5-10 KB)
extracromósico, presente de f natural en bacterias y
autorreplicables.
• Nº limitado de sitios de restricción únicos
• Contienen genes de R a ATB y a metales pesados
• Pueden incorporar > 10 Kb de ADN exógeno
• Ej: plásmidos de Escherichia coli

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 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
clonación

• Tipos de vectores
– Plásmidos

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 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
clonación

• Tipos de vectores
– Bacteriófagos o fagos : son virus que infectar
bacterias. Los ext fago ƛ son cohesivos y permite
unión ADN exógeno
• Permiten insertar fragmentos > 100 Kb

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 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
• Tipos de vectores
clonación
– Cósmidos: son vectores híbridos con
características del plásmido y del fagoƛ.

Se reemplaza todo el fago excepto secuencias COS

( x ADN exógeno), y el plásmido aporta el ORI, gen
de resistenica y polylinker.
Molécula similar a un plásmido pero con la
capacidad de empaquetarse.
Permite insertos de hasta 50 Kb
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 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
clonación
• Tipos de vectores
– Cromosomas artificiales :
§ Capacidad de transportar fragmentos muy grandes
§ Vectores de alta capacidad
§ Genotecas genómicas à estabilidad

YAC à LEVADURAS
Tienen mayor capacidad de clonación ,
fragmentos de 1000 Kb pero muy inestabes y
cuesta su purificación

BAC à BACTERIAS à PLÁSMIDO F de

E.Coli. 300kb
Muy utilizados , son muy estables

21
 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
clonación
• D. Transformación del organismo huésped
Introducción del vector recombinado en células bacterianas
huéspedes. Peq nº cél bact sufren transformación.
Si la célula huésped es eucariota se den Transfección.

La mb bacteriana no es permeable de forma natural al ADN, pero puede

hacerse mediante diferentes métodos:
• Exposición a ciertas sales ( fosfato, iones metálicos..)
• Exposición a voltajes elevados : Electroporación
• Microinyección
• Infección por fagos y virus : Traducción
• Lipofección : vesículas lipídicas que contiene ADN exógeno se
fusionan con las mb celulares
• Así las bacterias se vuelven COMPETENTES
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 2.1.Tipos de clonación y fases del procedimiento de
clonación
• E. Búsqueda de los vectores recombinantes
– La selección de las células q han incorporado el ADN
recombinante se logra gracias a la presencia en los
vectores de genes que permitan la identificación de las
células transformadas. à 3 tipos de células :
vCélulas no transformadas: no han captado
ninguna molécula de ADN extraño
vCélulas transformadas : portan el vector
recombinantes específico
vCélulas transformadas que portan el vector
no recombinante o alguna molécula de ADN
no deseada producida durante la ligación
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GENES DE Vectores con 2 genes de R: ampicilina y tetraciclina
RESIS- Pto inserción en el interior de uno de estos genes Rà vector
recombinante ese gen no funcional
TENCIA
Si en el punto de inserción esta el gen de R a la T :
Células no transformadas, S a la T y a la A
Células transformadas con el vector recombiannte ,
R a la A y S a la T
Células transformadas con el vector no
recombinante, R a T y R a A

Para su selección, cultivar las células en un medio con ampicilina

para que solo crezcan las bacterias transformadas con y sin.

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ESTRATEGIA
CROMO- § Bacterias hospedadoras
GÉNICA lac- y S al antibiótico para el
que porta R el vector
§ Vector: gen de R + Gen
LacZἁ con un poiylinker en
su interior , no funcional en
vectores recombinantes
Cél no transformadas, S atb y lac-
Células transformadas con vector
recombiante :R y lac –
Células transformadas con el vector no
recombiante: R y lac +

Cultivamos las bacterias en medio con

ATB, inductor del operon lac y el
sustrato cromogénico . à crecen solo
bacterias transformadas que portan
vector recombinante ( lac-) que
producen colonias blancas
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PROTEINAS
• Vectores: gen R y gen que codifica a
FLUORES- una proteína fluorescente GFP (
CENTES plylinker)
Colonias transformadas con vector
recombinante no tendrán fluorescencia

GENES • Vectores con gen de R ( marcador de

selección) y un gen que codifica una
LETALES proteína letal para las ( marcador de
identificación ) (polylinker )

Colonias transformadas con vector

recombinante , son las únicas que se
desarrollan en un medio con el antibiótico en
cuestión ya que el otro gen queda inactivado.

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Técnicas de Transferir las colonias de bacterias huéspedes
Hibridación transformadas con clones recombinantes a filtros de
nitrocelulosa
de AN Los AN se unen a los filtros a modo de réplica
El ADN transferido se desnaturaliza para obtener hebras
simples que se hibridarán con sondas de ADN o ARN
marcadas radiactivamente o con fluorecentes , que
contienen el gen de interés. Las que no hibriden se irán
con los lavados.
Se detecta la hibridación

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 TASA DE TRANSFORMACIÓN
Eficiencia de la introducción del vector en la
célula hospedadora

Nº cél transformadas/ µg

VT vol total de la solución en la que se realiza la

transformación (µL)
C (µg)cantidad del vector empleado ( MEZCLA que
incluye vector recombinante y no recombinante)
Vs vol de suspension bacteria transformada utilizada
para sembrar una placa de medio de cultivo sólido
con antibiótico
UFC colonias que crecen

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 BIBLIOTECAS DE ADN
• Colección de vectores recombinantes clonados cuyas sec de
ADN extraño se han obtenido de un único organismo.
TIPOS à DEPENDIENDO DEL ORIGEN DEL ADN CLONADO
Colecciones de vectores recombinantes
clonados que incluyen todo el genoma
completo, todos los genes de un organismos.
1.BIBLIOTECAS GENÓMICAS
Organismos superiores à fagos, cósmidos,
BAC o YAC
Genoma humano con fagoƛà 8.105 clones
2.BIBLIOTECAS Son biblioteas de ADN construidas a partir de un
CROMOSÓMICAS único cromosoma o fracción cromosómica

Solo un subconjunto de genes

3.BIBLIOTECAS
Se obtienen a partir de ARN m ( x transcriptasa inversa).Cada clon
DE ADN C
porta un gen completo.
O Genotecas de expresión
En estos clones la secuencia del gen carece de intrones,
promotores y secuencias reguladoras
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 Anexo: Patrones de Restricción:
• Técnica del RFLP (polimorfismos de longitud
de fragmentos de restricción)
– Marcadores genéticos, si el corte no es el
mismo marcaría la diferencia en las dos
secuencias.
– Huella genética individual y con la característica
que se transmiten estos elementos genéticos de
padres a hijos generalmente sin cambio. Y los
familiares directos también comportan varios de
estos marcadores.

30
 Anexo: Patrones de Restricción
.

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 Anexo: Patrones de Restricción
• Patrones de restricción--> utilidad:
– Identificación de muestras pertenecientes a un
mismo individuo
– Estudios filogenéticos ( relación evolutiva de los
organismos)
– Detección de anomalías cromosómicas en
diagnóstico prenatal
– Detección de mutaciones ( si se produce una
mutación que afecta a la diana de restricción,
cambiará el patrón ).

32
.

Enfermedad Autosómica
Dominante:

Tendrán la enfermedad

33