TEMA 2: GENES Y GENOMAS

¿Cuál es el principal problema de tr4abajar con genes específicos?  La escasez, una

única copia por célula en organismos superiores
Soluciónclonar en bacterias de rápido crecimiento y en plásmidos (varias copias en
cada célula).
DNA recombinante DNA que proviene de dos fuentes biológicas distintas.

Plásmidos observados por TEM.

TEM microscopia electrónica de transmisión. La
corriente eléctrica atraviesa los tejidos.
SEM escanear tejidos.

Plásmidos y enzimas para manipulación del DNA

Cortar endonucleasas de restricción
Pegar DNA ligasa
Copiar  DNADNA (DNA polimerasa)
RNADNA (transcriptasa reversa)
DNARNA (RNA polimerasa)
Varios: fosfatasas/kinasas RNAasas (degradar RNA) DNAasas (degradar DNA)

Edonucleasas de restricción
 Enzimas con origen bacteriano que reconocen
secuencias específicas de nucleótidos en el ADN y
cortan las dos cadenas de este en sitios de secuencia
reconocida o próximos a ella.
Para proteger el DNA de la propia bacteria estas
endonucleasas van acompañadas de metilasas que
modifican las bases de la secuencia reconocida y evitan
que sea atacada por las endonucleasas
correspondientes.
Tipos:
Tipo I: una sola enzima (multimérica que posee 3 subunidades) reconoce la secuencia
específica de ADN, metila y restringe. Pero la restricción no ocurre en el sitio de
reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento. Que sea al
azar hacer que sea “inútil” para la ingeniería genética.
Tipo II: La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento. Son utilizadas en genética
molecular ya que permite romper el ADN en sitios específicos.
Tipo IIP: reconocen secuencias simétricas (palindrómicas, que se lee igual del
derecho y del revés) y cortan en esa misma secuencia.
-Dímeros
-Tipos de corte:
Extremos protuberantes dejan
extremos 3´y 5´. Deja bases libres.

Extremos romos (cortan la cadena

por la mitad) (Blunt ends) No deja
ningún extremo libre.

IIS el sitio de reconocimiento es distinto al del reconocimiento.

IIB hay dos tipos de reconocimiento y cortará a ambos lados del sitio de reconocimiento (no
en el sitio en concreto).

IIE hay dos sitios de reconocimiento, uno no será cortado y el otro si será cortado.

DNA Ligasa Todos los seres vivos tienen ligasa porque actúa en la replicación y
reparación del DNA. En ingeniería genética se usa para catalizar la formación de
enlaces fosfodiéster en los extremos de cadenas de DNA que ya están apareados por
complementación de pares de bases. La ligasa comercial viene del fago T4.
Es capaz de crear un enlace covalente ente el grupo fosfato 5´de una cadena con el
grupo adtacente 3´-OH de otra.
Es necesario ATP.

1972Paul Berg, PRIMER EXPERIMENTO DE INGENIERÍA GENÉTICA

Primera vez enque se hizo un DNA recombinante (virus SV40 y lambda). Cogió una
endonucleasa (corta dentro de los nucleótidos) y cortó los ADN circulares. Con una
exonucleasa (corta en los extremos) cortó los extremos para que sean complementarios.

PLÁSMIDOS
Molécula de DNA circular de 10-100kb con capacidad de replicación autónoma en
ciertas bacterias y microorganismos eucarióticos como las levaduras.
Partes:
 Marcadores para selección desde el
punto de vista microbiológico
Desde la ingeniería genética es interesante
que sean resisten a antibióticos

Origen de replicación secuencia de 100-

300 bp que permiten a los plásmidos ser
reconocidos por la maquinaria de replicación de la bacteria. Contiene secuencias que
controlan el número de copias del plásmido. Cuando llegue la polimerasa y se una aquí,
empezará a sintetizar plásmido tras plásmido.

MCS: MULTICLONING SITE (SITIOS DE MULTICLONAJE) (“POLILINKER”):

Agrupación de secuencias reconocidas por varias enzimas de restricción. Se usa para
insertar fragmentos de DNA exógeno.
¿Por qué hay un montón de sitios de restricción donde podemos clonar multitud de
enzimas? Finalidad: amplificar fragmento de ADN y meterlo en el plásmido. Si
intentamos meterlo en un sitio de restricción de tipo A, cuando el DNA es de tipo B, no
nos sirve. Pero si tenemos un sitio que es B, si se puede insertar. En estos sitios hay
muchos tipos.
Analizo el fragmento veo que sitio tengo lo introduzco.
PCR
Varios componentes Los metemos en un termociclador : máquina capaz de cambiar
temperatura en muy poco tiempo gracias al efecto Peltier (por electromagnetismo).
Con esto haremos varias fases de temperatura:
1º DESNATURALIZACIÓN a 95º, sin degradarse
del todo. Se abre la doble cadena del
ADN patrón.
2º HIBRIDACIÓNdepende de la secuencia de los
cebadores. Cada timina o adenina añade 2ºC, y si es
una guanina o citosina 4 ºC. Llegamos a 55º-65º C.
3º EXTENSIÓN la polilmerasa se ancla al
primer, y comienza la replicación, del 5’ al 3’.

¿Cómo se diseñan primers?

La secuencia siempre viene dada como 5’-3’.
La temperatura de alineamiento es ideal que sea 1-2ºC por debajo de la que te pongan
para los primers.
 REPLICACIÓN DE DNA FISIOLÓGICA VS PCR

DNA POLIMERASA I
Actividad exonucleasa 3’5’ Es capaz de corregir errores que ella misma acaba de
cometer (ir para atrás y cambiar la bases errónea).
Actividad exonucleasa 5´3´ Si tiene un DNA por delante, es capaz de eliminarlo
para seguir con la replicación.
Otras polimerasas:
- DNA Polimerasa T4: Polimerasa del fago T4

Actividades enzimáticas muy similares a Klenow. PERO su actividad 3´

5´ exonucleasa 200 veces mayor.
- DNA Polimerasa T7: Polimerasa del fago T4
Actividades enzimáticas muy similares a la T4. PERO alta procesividad
(sintetiza cadenas de DNA muy largas antes de disociarse del molde).
“Aguanta más seguir secuenciando”.
- Polimerasas termoestables: Son polimerasas de bacterias termofílicas y por tanto actúan con
máxima eficacia a temperaturas muy altas (75-80 oC). Se utilizan en reacciones de PCR.

TRANSCIPTASA INVERSA
 Producto: DNA, Molde: RNA.
Estas enzimas las usan de forma natural los virus. Al virus le interesa integrarse dentro
del DNA bacteriano. Como su DNA, y lo integra en el cromosoma bacteriano.
Proceso:
qRTPCR

¿Para hacer una

retrotranscipción se
necesita un primer?
Si, siempre se necesita
un primer.