ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE
Tecnología del estudio de ADN
Permite el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en otro. Entre sus aplicaciones se encuentra la producción de grandes cantidades de la proteína codificada por dicho gen, como por ejemplo proteínas humanas en cantidad suficiente para que puedan ser utilizadas como fármacos. Las proteínas obtenidas por esta técnica se denominan proteínas recombinantes.

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ADN RECOMBINANTE

INDICE
ADN Recombinante ..................................................................... 1 Aislamiento de segmentos específicos de ADN ........................... 2 Vectores ........................................................................................ 4 Enzimas de Restricción ................................................................ 5 Células Huésped ........................................................................... 5 Clonación ± clones ....................................................................... 6 Hibridación de ácidos nucleicos .................................................. 7 - Métodos de laboratorio (hibridación)....................................... 9 --Uso de Sondas radioactivas ....................................................... 10 Secuenciación de ADN ................................................................. 11 -Técnicas de Secuenciación ......................................................... 12 Biotecnología ............................................................................... 15 Obtención de ADN ....................................................................... 16 Genética molecular de los eucariotas ± Expresión Génica ........................................................................................... 17 El cromosoma eucariótico ± la regulación ................................. 19 Regulación de la expresión génica ± metilación ......................... 20 El genoma eucariótico .................................................................. 22 Clases de ADN .............................................................................. 23 Intrones ......................................................................................... 24 Repeticiones y No repeticiones .................................................... 26 Familias genéticas ± transcripción .............................................. 28 Procesamiento de ARNen eucariotas ......................................... 30 ADN de los organelos energéticos. .............................................. 32 Bibliografía ................................................................................... 33 Anexos

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ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE
La tecnología del ADN recombinante permite el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en otro. Entre sus aplicaciones se encuentra la producción de grandes cantidades de la proteína codificada por dicho gen, como por ejemplo proteínas humanas en cantidad suficiente para que puedan ser utilizadas como fármacos. Las proteínas obtenidas por esta técnica se denominan proteínas recombinantes. Antes de la tecnología del ADN recombinante también se utilizaban como medicamentos algunas proteínas, sin embargo la manera de obtenerlas era o bien por síntesis química, o bien mediante el aislamiento de la proteína a partir de su fuente natural (tejido o fluido animal, humano o de plantas). No obstante, ambas técnicas tienen sus limitaciones. La síntesis química debido a su complejidad y elevado coste sólo es aplicable cuando la proteína de interés es muy pequeña. Por su parte, el aislamiento de las proteínas a partir de la fuente natural a menudo se encuentra con el problema de que el rendimiento de la extracción es muy bajo. Por ejemplo hasta hace relativamente poco tiempo la única manera de obtener factores de coagulación para personas hemofílicas era mediante la manipulación de litros de sangre, y era necesario procesar cientos de hipófisis de cadáveres humanos para sacar una pequeña cantidad de hormona del crecimiento, imprescindible para tratar algunos problemas de enanismo. Mediante la aplicación de las técnicas de ADN recombinante es posible solventar estos problemas y obtener proteínas que no se podrían conseguir con los métodos tradicionales. La tecnología de ADN recombinante se desarrolla en tres pasos: el aislamiento del gen de interés, la clonación y expresión de dicho gen, y la producción a gran escala de la proteína codificada por el gen. Cada uno de estos procesos precisa de unas herramientas la mayoría de las cuales son ofrecidas por la propia naturaleza. El aislamiento de un gen no es fácil. Originariamente lo que se hacía era aislar la proteína de la que se quería obtener el gen e intentar determinar por medios químicos la secuencia de aminoácidos que la componían. Este proceso se denomina secuenciación de proteínas y a diferencia de la secuenciación de ADN es técnicamente muy complicado. Si la proteína es suficientemente pequeña puede ser secuenciada en su totalidad y esta información, gracias al código genético, era utilizada para sintetizar químicamente el gen. Para proteínas de tamaño medio o grande lo que se hacía era secuenciar solamente una pequeña parte de la proteína y, utilizando también el código genético, fabricar una cadena de ADN de 15 ó 20 nucleótidos que era complementaria a una de las cadenas del gen o al ARNm correspondiente. Esta corta cadena de nucleótidos se marcaba radiactivamente o por fluorescencia y se utilizaba como sonda para identificar el gen completo o el ARNm completo que llevan la información para sintetizar la proteína de interés. En el caso de que hayamos localizado el ARNm tenemos

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que convertirlo en ADN. Este proceso se hace mediante la enzima llamada transcriptasa inversa. La cadena de ADN obtenida utilizando la información de un ARNm se llama ADN complementario o abreviadamente ADNc. Actualmente gracias a la existencia de genotecas y a la secuencia de muchos genomas, entre ellos el humano, el aislamiento de cualquier gen es una tarea mucho más simple. Los cromosomas, incluso los de las células eucariotas más simples, contienen una enorme cantidad de DNA, por lo que localizar un segmento específico es como tratar de encontrar una aguja en un pajar. Para localizar fragmentos específicos se utiliza la técnica de hibridación de ácidos nucleicos En los comienzos de la investigación del DNA recombinante, los biólogos se dieron cuenta de que los segmentos de DNA que codifican ciertas proteínas (particularmente las de importancia médica o agrícola) pueden transferirse a bacterias y ser expresados por ellos se las usa como ³fábricas´ para suministrar ilimitadamente proteínas. Estofue el inicio de la biotecnología.

AISLAMIENTO DE SEGMENTOS ESPECÍFICOS DE DNA
Una de las formas de obtener los fragmentos específicos de DNA es cortando moléculas de DNA con enzimas de restricción, transcribiendo el mRNA a DNA con la enzima transcriptasa inversa, o por medio de la síntesis de oligonucleótidos en el laboratorio. Las enzimas de restricción se encuentran en la naturaleza en las células bacterianas y en algunos bacteriófagos. Escinden las moléculas de DNA en secuencias de reconocimiento específicas, que típicamente tienen de 4 a 8 nucleótidos de longitud. Su función en las células bacterianas es degradar moléculas de DNA extrañas. El DNA de la bacteria se protege de sus propias enzimas de restricción por la metilación de nucleótidos en las secuencias de reconocimiento. Algunas enzimas de restricción producen cortes de la molécula de DNA que dejan extremos rectos. Otras cortan de manera escalonada, dejando extremos ³pegajosos´ que luego pueden unirse, por apareamiento de bases complementarias, con otros fragmentos producidos por la misma enzima. Esto hace posible combinar segmentos de DNA de

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Cuando estos virus infectan una célula hospedadora.ADN RECOMBINANTE fuentes diferentes. o cDNA. -3- . si es tratada o digerida con diferentes enzimas de restricción. la transcriptasa inversa puede utilizarse para sintetizar DNA a partir de un molde de RNA. las dos cadenas complementarias de la secuencia son idénticas. estas secuencias se denominan secuencias palindrómicas. segmentos que se conocen como DNA complementario. el mRNA viral. Otra herramienta para obtener fragmentos específicos de DNA la transcriptasa inversa que fue aislada de ciertos virus que contienen genoma de RNA. cuando se leen en la misma dirección (por ejemplo 5' a 3'). los retrovirus. la transcriptasa inversa cataliza la síntesis de DNA a partir del molde de RNA viral. En el laboratorio. Las enzimas de restricción generalmente se obtienen de bacterias y su nombre deriva del nombre científico de esas bacterias: HpaI es de Hemophilus parainfluenzae. Algunas enzimas como EcoRI y HindIII escinden el DNA dando como resultado extremos "pegajosos". como también el RNA viral que será empaquetado en nuevas partículas virales. que codifica proteínas virales. llamados fragmentos de restricción. Esta enzima es capaz de sintetizar DNA a partir de un molde de mRNA. coli y HindIII es de Hemophilus influenzae. EcoRI es de E. se transcribe a partir de este DNA. El gran número de enzimas de restricción y de secuencias de reconocimiento diferentes hace posible que se las utilice para empalmar segmentos de DNA genómico de una variedad ilimitada de fuentes. Una misma molécula de DNA producirá distintos fragmentos. Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción frecuentemente tienen seis pares de bases de longitud y.

o bien degradaba el gen que se le había introducido. Posteriormente se transcriben. el RNA viral se libera de la cápside y se transcribe a una única cadena de DNA complementaria (cDNA). como los geles de agarosa. b) Una vez que el retrovirus ha entrado en la célula. son catalizadas por la enzima transcriptasa inversa. por ejemplo. El tamaño de poro de este gel permite separar moléculas cuyo tamaño difiere en un solo nucleótido. mediante el uso de técnicas de tinción. tanto el nuevo RNA genómico viral como el mRNA para la síntesis de proteínas virales.ADN RECOMBINANTE a) La cápside de un retrovirus está rodeada típicamente por una envoltura externa de lipoproteína formada por elementos de la membrana celular de su hospedador anterior y por proteínas virales. se utilizan matrices con poros mayores. Para separar fragmentos de DNA menores de 500 nucleótidos se utiliza como matriz un gel de poliacrilamida. Para separar moléculas de DNA de mayor tamaño. El cDNA de doble cadena puede integrarse al cromosoma de la célula hospedadora. a pesar de que se conseguía introducir el gen en la célula huésped que debía fabricar la proteína humana. ésta en lugar de llevar a cabo este proceso. produciéndose una molécula de cDNA de doble cadena. así como la de degradación de la molécula original del RNA viral. a partir del DNA viral integrado. o bien a medida que la célula se dividía. permitiendo que el virus entre en la célula. Estas reacciones. Esta envoltura puede fusionarse con la membrana celular de un nuevo hospedador. VECTORES DE TRANSFERENCIA: PLASMIDOS Los primeros experimentos destinados a conseguir producir proteínas humanas en microorganismos fallaron porque. un polisacárido aislado de ciertas algas. c) Comienza de inmediato la síntesis de la segunda cadena de DNA (complementaria a la primera). Los fragmentos de DNA separados no pueden ser visualizados directamente. Estos problemas fueron soslayados cuando se descubrió que se podían emplear unas herramientas que también están en la naturaleza: los plásmidos y los virus. -4- . sólo una de las hijas recibía copia del gen humano por lo que dicho gen iba diluyéndose.

se podrán unir debido a la complementariedad de sus bases. Hacerlo de manera barata. se transfiere a la célula huésped. se vuelven a unir las cadenas de los ácidos nucleicos quedando insertado nuestro gen de interés en el lugar del genoma del vector que nos interese. por lo que se denominan moléculas transportadoras o vectores.ADN RECOMBINANTE Los plásmidos son moléculas de ADN circular que se encuentran en muchas bacterias y levaduras. levaduras y ciertas células eucariotas como las líneas celulares derivadas de algún -5- . 3. Esto es. gracias a otra enzima denominada ligasa. de las demás. 2. y que por consiguiente son capaces de crecer en un medio con el antibiótico. CÉLULAS HUÉSPED Una vez que el vector presente el gen de interés. Hay tres tipos de células huésped: bacterias. los virus son entidades que están especializadas precisamente en insertar su material genético en células y utilizar la maquinaria de éstas para multiplicarse. independientemente del genoma de la célula. y que se caracterizan porque pueden replicarse. Un buen organismo huésped debe caracterizarse por: 1. Poder crecer rápidamente. Estas enzimas cortan los genomas en unas secuencias específicas. Cortando el genoma huésped y el gen a insertar con las mismas enzimas los extremos de ambos se vuelven "cohesivos". es decir "reproducirse". Muchos de ellos contienen genes de resistencia a antibióticos. Que sea fácilmente manipulable. especialmente cepas de Escherichia coli. Después. Los plásmidos y virus permiten introducir el gen de interés en la célula huésped. ENZIMAS DE RESTRICCION En general para introducir el gen de interés en el genoma de estos vectores se utilizan las enzimas de restricción. lo que permite distinguir las células que han incorporado el plásmido. Por su parte.

no crecen tan rápido y suelen ser más difíciles de tratar. Mediante diferentes técnicas se facilita la entrada del vector en las células. la ventaja es que ambos sistemas pueden llevar a cabo modificaciones como las descritas anteriormente. por ejemplo la glicosilación. suelen crecer muy rápido y las condiciones de crecimiento son bastante sencillas. CLONACIÓN Una vez escogida la célula huésped se pone en contacto con el vector al que se ha incorporado el gen de interés. El aislamiento de una proteína a partir de la mezcla de células. Las levaduras y las líneas celulares son más complicadas. Este proceso de seleccionar y hacer crecer una única célula se denomina clonación. ésta se aísla a partir del medio de cultivo en el que crecen las células o del interior de las propias células dependiendo del tipo de células que se utilizan como sistema de expresión y de cómo se haya diseñado el gene dicha proteína. mayor cantidad de dicha proteína se podrá obtener. A continuación hay que separar las células que han incorporado el vector del resto. Para ello el clon de células huésped que mejor expresa el gen de la proteína de interés se selecciona. Las bacterias se caracterizan porque su material genético es muy simple.en función del tipo de célula huésped. Las células hijas fabricarán todas sub-proteínas más la proteína extraña que se le ha introducido. Una de las células modificadas se hace crecer obteniéndose así múltiples células hijas que contienen el gen y que proceden de una única célula inicial.ADN RECOMBINANTE mamífero. La síntesis de la proteína deseada por la célula huésped es lo que se conoce como expresión del gen de dicha proteína. nutrientes y otras moléculas presentes en el medio de cultivo es una tarea cuya puesta a punto puede ser -6- . No obstante.y se permite que las células crezcan ofreciéndoles las condiciones más favorables de temperatura. etc. nutrientes. Cada uno de estos tipos celulares tiene sus ventajas e inconvenientes. humedad. se inocula a un fermentador o a botellas de cultivo. especialmente estas últimas. Cuantas más células huésped estén fabricando la proteína de interés. Tras obtener suficiente cantidad de proteína de interés. Su principal inconveniente es que no llevan a cabo algunas de las modificaciones que sí realizan las células eucariotas en las proteínas.

que es el proceso por el cual la proteína se preparará en su forma farmacéutica definitiva que será la que le dará la máxima estabilidad y eficacia. lo que nos da bastante juego en los protocolos de extracción de ADN. están totalmente expuestos a la fuente emisora de energía. G C. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ± SONDAS RADIOACTIVAS La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos anti-paralelas y con secuencia de bases complementarias. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de desnaturalización ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrógeno. una simple variación de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultará la unión. el %GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN mitocondrial. es más. por tanto. debido a las diferentes geometrías de los nucleótidos. dicha energía se traduce en una mayor temperatura. y dado que se requiere más energía para romper tres enlaces que para romper dos. según qué tipo vamos a estudiar y esto es importante. ya que en esta última los dobles enlaces de las bases nitrogenadas. El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la solución que contiene a la molécula. C G.ADN RECOMBINANTE compleja y que requiere la aplicación de variadas técnicas bioquímicas de separación como las cromatografías. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260 nm). para uniones ADNARN. para uniones ADN-ADN y tipo Northern. en una única molécula de doble cadena. T=A o U=A Así que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán la una a la otra rápidamente. Por el contrario. En biología molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridación: Tipo Southern. A=U. que son las que captan la energía. la absorción de energía será mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla. que toma la estructura de doble hélice. El %GC no es igual para todas las especies. Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T. En caso de que la proteína recombinante se vaya a utilizar como medicamento. entre otros motivos porque existen enfermedades genéticas debidas a mutaciones en el ADN mitocondrial. el paso siguiente es la formulación de la proteína purificada. -7- . donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior.

-8- . c. Las bacterias competentes se transforman con plásmidos que contienen distintos fragmentos de DNA obtenidos por digestión de un DNA genómico con una enzima de restricción. Durante el período de exposición. Luego del revelado de la película. Las réplicas de las colonias que estén marcadas con la sonda radiactiva después de este tratamiento. Sólo las bacterias que hayan adquirido el plásmido recombinante crecerán formando colonias aisladas. Las bacterias transformadas son distribuidas en una placa de Petri con un medio de cultivo sólido que contiene el antibiótico de selección. El filtro con el DNA desnaturalizado es incubado en una solución que contiene una sonda radioactiva que consiste en una molécula de DNA o RNA de cadena simple. Cada colonia se origina por divisiones sucesivas de una única bacteria inicial y todas las células de una colonia contienen el mismo plásmido recombinante. Se permite que la sonda se hibride. el radioisótopo libera energía que impacta la emulsión fotográfica. la posición del fragmento radioactivo se observa como una marca oscura. Algunas bacterias de cada colonia son transferidas (blotting) a un filtro especial obteniéndose una réplica. Se lava del filtro el exceso de solución que contiene las sondas que no han hibridado. Las moléculas de doble cadena que se hayan formado permanecen en su lugar en el filtro y su visualización se realiza por medio de autorradiografía. complementaria al segmento de DNA de interés. Los plásmidos contienen. técnica en la cual primero. b.ADN RECOMBINANTE a. El DNA se une químicamente al filtro d. además. identifican las colonias originales que contenían vectores con el segmento de DNA que se deseaba estudiar. cada filtro es cubierto con una película fotográfica y dejado en la oscuridad. un gen de resistencia a un antibiótico que se usará para la selección de las colonias que hayan incorporado el plásmido. producida por un depósito de plata de la emulsión. e. La réplica es tratada con una solución de alto pH para romper las células y desnaturalizar el DNA del plásmido.

A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo).ADN RECOMBINANTE Métodos de Laboratorio Existen dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan frecuentemente en los laboratorios que utilizan técnicas de biología molecular. El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica. M. en qué tejidos o tipos celulares. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas. El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. tipo northern o northern blot. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida. se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda. -9- . durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz. bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. el método northern sirve para identificar ARN. Southern para la detección de genes específicos en el ADN celular. Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físicoquímico. El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. para el caso de sondas  Northern El segundo método. a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN. el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa.  Southern El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. Posteriormente. para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué condiciones.

El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único. se lava el exceso de sonda no unido. violeta. amarillo. un gen que codifica una proteína de membrana de los glóbulos blancos. de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo northern ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material orgánico. Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección. verde. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". región del cromosoma 21 donde se encuentra el gen responsable del Síndrome de Down. técnica de hibridación in situ. una secuencia sin determinar en el cromosoma 5. Utilizando técnicas inmuno-histoquímicas se puede conocer la localización precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas. localización en el cromosoma X del gen de la distrofia muscular infantil más común.10 - . con la que comparte un alto grado de similitud y que podemos observar con un microscopio electrónico. con la capacidad de transportar información. Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir. donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma. un oncogén en el cromosoma 8. blanco. Cada color indica la localización de una secuencia de DNA diferente: rojo. y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que favorezcan la hibridación. las sondas están marcadas con colorantes fluorescentes. SECUENCIACION DE ADN Una secuencia de ADN o secuencia genética es una sucesión de letras representando la estructura primaria de una molécula real o hipotética de ADN o banda. También en esta categoría destaca el FISH. . de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.ADN RECOMBINANTE  Hibridación in situ (uso de sondas radioactivas) Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su observación al microscopio. Tras producirse ésta. En la hibridación in situ.

De todas las moléculas muestreadas. así como en campos aplicados. En algunos casos especiales. G y T) en un oligonucleótido de ADN. hay más de una clase de nucleótidos en esa posición. y T. . determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales. Otros proyectos relacionados. que simbolizan las cuatro subunidades de nucleótidos de una banda ADN .ADN RECOMBINANTE Las posibles letras son A. T. C. guanina. como en la secuencia AAAGTCTGAC. a derecha.adenina. en ocasiones fruto de la colaboración de científicos a escala mundial. Técnicas de Secuenciación Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad. C. G. y G se presentan en una secuencia. como la investigación forense. las letras seguidas de A. las secuencias se presentan pegadas unas a las otras. En el típico caso.11 - . timina. la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. Las reglas de laUnión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) son las que siguen:                A = adenina C = citosina G = guanina T = timina R = G A (purina) Y = T C (pirimidina) K = G T (keto) M = A C (amino) S = G C (enlaces fuertes) W = A T (enlaces débiles) B = G T C (todos y A) D = G A T (todos y C) H = A C T (todos y G) V = G C A (todos y T) N = A G C T (cualquiera) La Secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A. Así pues. los plásmidos. C. han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales. lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular. sin espacios. yendo de 5' a 3' de izq. citosina. plantas y microorganismos. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología. Esas letras representan ambigüedad. que son bases covalentemente ligadas a cadenas fosfóricas.

1. así.1 En una primera etapa. En la secuenciación por el método enzimático. . ddGTP o ddTTP). La solución que contiene al DNA marcado se divide en cuatro porciones. Esta técnica se vale de oligonucleótidos sintéticos y de una DNA polimerasa termoestable. 2. Estos son dideoxinucleótidos que carecen del OH. en el último nucleótido de la cadena. En la secuenciación de un segmento de una molécula de DNA por el método de Maxam y Gilbert.12 - . se procede en varias etapas: 2. se puede inferir la secuencia del segmento completo. La secuenciación depende de la disponibilidad de copias múltiples de un fragmento de DNA. Combinando la información obtenida con cada reacción. La mezcla en la que se producirá la reacción de síntesis se separa en 4 tubos. el oligonucleótido iniciador marcado radiactivamente se aparea con el DNA de simple cadena a secuenciar y se inicia la síntesis de la cadena complementaria por parte de la DNA polimerasa. además.ADN RECOMBINANTE Se usan tres técnicas principales de secuenciación: una implica métodos enzimáticos y la otra usa métodos químicos y la última es una modificación de la anterior. ddCTP. en el que se separan fragmentos que difieren incluso en un nucleótido de longitud. obtenidas por clonado de un segmento producido por digestión con enzimas de restricción o por la técnica de PCR. cada una de las cuales se somete a un tratamiento químico diferente para romper las moléculas en una sola de las cuatro bases nitrogenadas. cada uno de los cuales contiene. no pueden reaccionar con ningún otro nucleótido y se transforman.en la posición 3¶. una vez que son agregados a la cadena que se está sintetizando. el segmento de cadena simple (presente en múltiples copias) se marca radiactivamente en el extremo 5'. por lo que. uno de los nucleótidos terminadores (ddATP. Con los fragmentos resultantes se realiza una electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante.

Las posiciones de los fragmentos de DNA permiten leer la secuencia de nucleótidos incógnita de la siguiente manera: por ejemplo. que se ubica en la primera posición en la calle correspondiente a la guanina indica que el primer nucleótido de la secuencia contiene. si el fragmento de un solo nucleótido. En este caso los fragmentos generados a partir del cebador se van a diferenciar porque el ddNTP terminal va a emitir un color característico que se capta en el aparato.ADN RECOMBINANTE 2. en ³calles´ separadas. los productos de reacción son sembrados en la parte superior de un gel. Método automático Se trata de una modificación del método automático de Sanger que ha permitido secuenciar de manera más rápida y reproducible fragmentos de ADN de hasta 500pb. Luego de la corrida electroforética. 3.13 - . que esquematiza la cuba electroforética. una guanina. se señalan las posiciones de los fragmentos de DNA de una porción aumentada del gel. como base nitrogenada. . En el recuadro que se encuentra a la izquierda de la fotografía del gel.2 En una segunda etapa. se realiza la autorradiografía del gel que permite leer la secuencia complementaria del DNA original. La modificación consiste en que cada uno de los dideoxirribonucleótidos (ddNTP) está unido a un fluorocromo distinto que va a excitarse con la luz emitiendo luz de un color determinado.

química. .ADN RECOMBINANTE Los equipos funcionan de forma completamente automática. el láser detecta la fluorescencia emitida por cada cadena sencilla de ADN fluorescente y traduce esta emisión de fluorescencia en la secuencia correspondiente. agronomía. leyendo orden de 450 nucleótidos en el plazo de una hora en lugar de las 2-4 horas que se necesitan en un gel En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación. una ciencia. Las muestras se colocan en pocillos para ser inyectadas automáticamente a un capilar previamente cargado con un polímero que funciona como lo hace el gel desnaturalizante de acrilamida. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia. en sí misma. genética. es un enfoque multidisciplinario que involucra varias disciplinas y ciencias (biología. ingeniería. medicina y veterinaria entre otras). A una altura determinada del capilar. Hay muchas definiciones para describir la biotecnología. Una vez desarrollada la electroforesis de la primera muestra. bioquímica. el capilar se vacía rellenándose nuevamente con polímero fresco y nueva muestra y así sucesivamente. BIOTECNOLOGÍA La biotecnología no es. Las principales ventajas de estos equipos son la automatización completa de todo el proceso.14 - . y la rapidez en el análisis de cada muestra. inyectando las muestras que se preparan exactamente igual que para la secuenciación en geles de acrilamida. En términos generales biotecnología es el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de valor para el hombre. virología.

se ha logrado introducir en células bacterianas genes para otras proteínas útiles en medicina. Los plásmidos utilizados para la expresión de proteínas foráneas se conocen con el nombre de vectores de expresión. capaces de reconocer y cortar el ADN en puntos determinados. hasta la biotecnología moderna. mediante la utilización de las enzimas de restricción. los anticuerpos monoclonales y los nuevos métodos de cultivo de células y tejidos. que son introducidos en células bacterianas. Otro es el gen para la somatotropina u hormona de crecimiento. que han funcionado correctamente para la síntesis de las proteínas codificadas. Un ejemplo es el gen para la insulina humana. El descubrimiento de las enzimas llamadas endonucleasas de restricción. Las técnicas de DNA recombinante permiten la construcción de vectores. Más recientemente. unión de este a un ADN vector. y la transformación en una célula procariota o eucariota. las cuales sintetizan las proteínas codificadas por los genes.. largamente establecidas y ampliamente conocidas y utilizadas (e. La primera síntesis de una proteína de mamífero en una célula bacteriana fue realizada usando el gen para la hormona somatostatina.g. . fermentación de alimentos. control biológico). fue la pista que orientó hacia el momento en que se podían recombinar los genes en el laboratorio.ADN RECOMBINANTE La biotecnología consiste en un gradiente de tecnologías que van desde las técnicas de la biotecnología "tradicional". una proteína pequeña de sólo 14 aminoácidos que podía ser detectada en cantidades muy pequeñas.15 - . OBTENCIÓN DEL ADN Comprende las siguientes etapas: obtención del inserto de ADN que interese. basada en la utilización de las nuevas técnicas del DNA recombinante (llamadas de ingeniería genética). que se utiliza para tratar cierta forma de enanismo en los niños. portadores de genes específicos.

se producen partículas fágicas infecciosas. Posteriormente. se mezcla con la cubierta del virus lambda. donde pueden ser replicados. Otra enzima clave para unir ADNs es la transferencia terminal. y después ser transportados como pasajeros al interior de las células de E. Sus extremos cohesivos se aparearán dando lugar a un nuevo ADN recombinado.ADN RECOMBINANTE Si se quieren unir dos ADNs. que se encuentran en el citoplasma de la mayoría de las bacterias. si el tamaño del ADN recombinado no es muy distinto del ADN natural del virus lambda. Las uniones covalentes se consiguen añadiendo ADN ligasa y una fuente energética para formar los enlaces (forma A). con su gen pasajero. ya que transporta el inserto de ADN a una molécula hospedadora. Como estas colas son complementarias. Los dos DNAs así cortados se mezclan. se calientan y sé enfrían suavemente. El ADN vector es el vehículo de clonaje. Éstas están formadas por todas las . Cada plásmido contiene varios genes que se replican. Cada ADN se trata con una endonucleasa de restricción que origina en este caso un corte escalonado en las dos hebras dobles de ADN. transcriben y traducen independientemente de los genes del cromóforo bacteriano. coli. Los procesos de clonaje y de aislamiento de estos fragmentos se inician con la construcción de una biblioteca de ADN o un banco de ADN. pero simultáneamente en el tiempo. Es otro vector que puede ser utilizado para introducir genes en bacterias. Plásmidos Estos son pequeños ADNs de cadena doble y circular. ADN del fago lambda. De este modo pueden construirse colas de poli G (nucleótico de guanina) en los extremos 3 de las dos hebras de ADN dúplex y colas de poli C (nucleótico de citosina) en los extremos del otro ADN. Los vectores o transportadores más utilizados son los plásmidos y el ADN del fago lambda. cada uno de los cuales procede de una especie diferente podemos utilizar dichas enzimas como herramientas. Cuando el ADN recombinado del fago lambda. con lo cual. se forman los enlaces covalentes por el ADN ligasa (forma B). permitirán que los dos ADNs se unan por complementariedad. Los extremos escalonados del ADN1 y el ADN2 son complementarios. con uniones no covalentes. Se pueden unir genes extraños a los plásmidos con mucha facilidad.16 - . que puede adicionar muchos residuos de desoxirribonucleótidos sucesivos al extremo 3 de las hebras del ADN. una condición que tiene que tener los dos ADNs que se quiere unir es que tengan un pequeño fragmento igualen sus secuencias.

ADN RECOMBINANTE moléculas de plásmidos o fagos recombinantes originados al unir un ADN a un vector. Sin embargo. Las bibliotecas deben cumplir la característica de poder introducirse en células donde cada recombinante pueda aplicarse in vivo. GENÉTICA MOLECULAR DE LOS EUCARIOTAS ± EXPRESIÓN GÉNICA Con la ayuda creciente de las herramientas de la tecnología del DNA recombinante. Un organismo multicelular usualmente inicia su vida en forma de huevo fecundado. La regulación génica en los eucariotas. se fue ampliando. La regulación de la expresión génica en los procariotas está relacionada fundamentalmente con el ajuste fino de la maquinaria metabólica de la célula. un mismo tipo celular puede producir variantes de las proteínas que sintetiza en distintas etapas del desarrollo del organismo. en vez de disminuir. es muy diferente. Las investigaciones realizadas sobre estos organismos a nivel molecular develaron también muchas diferencias importantes entre el genoma de los eucariotas y de los procariotas. y es llevada a cabo activando o reprimiendo la expresión de ciertos genes. especialmente en los multicelulares. en respuesta a cambios en los nutrientes en el ambiente. toda la información genética originalmente presente en el cigoto también está presente en cada célula diploide del organismo. A su vez. En primer lugar. Resulta claro que la diferenciación de las . el cigoto. El cigoto se divide repetidamente produciendo muchas células que se diferencian y cada tipo celular comienza a producir proteínas característicamente diferentes que lo distinguen de otros tipos de células.17 - . el cromosoma eucariótico difiere en muchos aspectos del cromosoma procariótico. progresaron los estudios de genética molecular de los eucariotas y la distancia entre los eucariotas y los procariotas.

Más aun. es decir. Las investigaciones en eucariotas han demostrado que. todos los virus conocidos causantes de cáncer son virus que introducen información en los cromosomas de las células hospedadoras. El nuevo gen debe establecerse en un gran número de células del tipo apropiado y quedar sujeto a los complicados. En consecuencia. Estos incluyen tanto virus con genoma de DNA como retrovirus con genoma de RNA. controles del gen normal. y luego expresado. El mayor anhelo relativo a las aplicaciones basadas en la tecnología del DNA recombinante es que en algún tiempo futuro sea posible corregir defectos genéticos sustituyendo genes ³malos´ ³por genes´ ³buenos´. genes extraños han sido incorporados y expresados en el nuevo hospedador. En ocasiones. de una regulación de la expresión. incorporado a un cromosoma. La expresión de los genes puede ser regulada en distintas etapas del camino que conduce desde el DNA a las proteínas. En cada uno de estos casos. las células escapan a los factores que regulan el crecimiento celular normal. Los virus pueden provocar cambios en la constitución genética de la célula y algunos pueden causar cáncer. En los últimos años también se desarrollaron técnicas que permiten obtener copias idénticas de organismos.18 - .ADN RECOMBINANTE células de un organismo multicelular depende de la inactivación de ciertos grupos de genes y de la activación de otros. Hay varias evidencias que han relacionado el desarrollo del cáncer con cambios en el material genético. y todavía grandemente desconocidos. Las células se hacen crecer en cultivo en tubos de ensayo y se transfieren a óvulos fecundados de ratón y de otras especies de mamíferos y a embriones de Drosophila. Requiere primero la preparación de un gen que será captado por una célula eucariótica. el genoma eucariótico contiene un sorprendente arreglo de elementos genéticos móviles. amontonándose. deleciones y adiciones. como en el caso de los procariotas. invadiendo y destruyendo otros tejidos. Se han desarrollado técnicas que permiten la transferencia de genes a células eucarióticas. las células se multiplican sin control. los clones. CROMOSOMA EUCARIÓTICO . El análisis del cromosoma eucariótico ha revelado que éste también está sujeto a reordenamientos. Esta es una tarea enormemente compleja. En estos casos se produce el cáncer. pero esto es sólo el comienzo. El descubrimiento del papel de la transcriptasa inversa forjó el eslabón crucial entre los retrovirus y los cromosomas de las células eucarióticas.

El DNA puede tomar in vitro la forma de B-DNA (la hélice dextrógira descrita por Watson y Crick). La cadena que une los núcleos de los nucleosomas contiene otros 30 ó 60 pares de bases. El centro de cada nucleosoma está compuesto por alrededor de 140 pares de bases de DNA y un conjunto de ocho moléculas de histona. en principio. La mayoría de estas proteínas son histonas. Como en los procariotas. La replicación del DNA en los eucariotas es igual. a la replicación del DNA de los procariotas. La molécula de DNA se envuelve alrededor de núcleos formados por ocho moléculas de histonas. para formar nucleosomas. La distancia entre los nucleosomas es entre 10 y 11 nanómetros y el diámetro de cada cuenta es aproximadamente de 7 nanómetros. las DNA polimerasas operan solamente en una . moléculas relativamente pequeñas con carga positiva. con distintas funciones biológicas.ADN RECOMBINANTE El DNA eucariótico siempre está asociado con proteínas. que constituyen más de la mitad del peso del cromosoma. Los nucleótidos en la forma de trifosfatos se acoplan a lo largo de una cadena molde de DNA en la forma semiconservativa.19 - . Los nucleosomas se empaquetan unos sobre otros formando una estructura más condensada ±la fibra de 30 nanómetros± que se encuentra tanto en la cromatina en la etapa de interfase como en los cromosomas que entran en mitosis. las unidades de empaquetamiento básico del DNA de los eucariotas. en la síntesis de las cadenas complementarias. Las distintas formas del DNA podrían coexistir in vivo. A-DNA (una hélice dextrógira menos fuertemente enrollada) o Z-DNA (una hélice levógira).

que luego se unen por la acción de la enzima DNA ligasa. En el cromosoma procariótico circular.20 - . desempeña un papel principal en la regulación de la expresión génica en las células eucarióticas. Las histonas ensambladas en los nucleosomas raramente se separan del DNA. a las que se unen las proteínas que activan la transcripción. Los sitios en los cuales se unen esas proteínas regulatorias pueden estar a centenares o miles de pares de bases de distancia de la secuencia promotora en la que se une la RNA polimerasa. el DNA eucariótico forma los nucleosomas y se asocia también con otras proteínas compactándose en los niveles superiores de condensación. la cadena complementaria a la otra hebra madre ¶¶se sintetiza como una serie de fragmentos de Okazaki. se cuentan las secuencias denominadas enhancers. Se cree que cada nucleosoma se desenrolla transitoriamente. la replicación comienza en un único origen y procede bidireccionalmente a lo largo de dos horquillas de replicación. pasar a través de los nucleosomas parentales. que se observa mediante la tinción de la cromatina. se hace cada vez más claro que este nivel de control de la transcripción es mucho más complejo en los eucariotas. Si bien en los procariotas también se da una regulación a este nivel. de alguna manera. En cuanto se sintetiza. permitiendo que la DNA polimerasa copie el DNA nucleosomal desenrollado. en particular. algunas de las cuales tienden a activar el gen y otras a desactivarlo. llamadas factores generales de transcripción. Esto permite la unión de la RNA polimerasa y la posterior transcripción. Muchas evidencias indican que el grado de condensación del DNA del cromosoma. Una variedad de proteínas reguladoras específicas desempeñan papeles centrales en la regulación de la expresión génica.ADN RECOMBINANTE dirección¶¶. La tinción revela dos tipos de . LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN LOS EUCARIOTAS METILACIÓN Los biólogos están comenzando a comprender algunos aspectos de la regulación de la expresión génica en eucariotas. por lo tanto. Para poder iniciar la transcripción. Durante el desarrollo embrionario. El DNA recién sintetizado hereda parte de las viejas histonas pero requiere también de nuevas histonas para empaquetarse y formar la cromatina. Entre estas secuencias regulatorias. la RNA polimerasa requiere que un grupo de proteínas. a medida que la horquilla de replicación avanza debe. un gen parece responder a la suma de muchas proteínas regulatorias diferentes. en los multicelulares. En un organismo multicelular. comparativamente pequeño. diferentes grupos de genes se activan o inactivan en diferentes tipos de células. se ensamblen en la región promotora del gen que se va a transcribir.

virtualmente todo el DNA se expresa. coli. Este tipo de heterocromatina se denomina heterocromatina constitutiva. que no codifica para proteínas. casi la mitad del DNA de la célula eucariótica consiste en secuencias de nucleótidos que se repiten centenas.ADN RECOMBINANTE cromatina: la eucromatina y la heterocromatina. Se estima que en las células eucarióticas menos del 10% de todo el DNA codifica para proteínas. Durante la interfase. Un ejemplo es la cromatina altamente condensada. desempeña un papel estructural en el movimiento de los cromosomas durante la mitosis y la meiosis. excepto por las secuencias reguladoras o secuencias señal. los individuos tienen la misma cantidad de DNA en cada una de sus células diploides (lo cual no es sorprendente). esta cifra puede disminuir hasta el 1%. Otro factor que está involucrado en la regulación génica es la metilación de las bases nitrogenadas citosinas. en los seres humanos. que ha sido por largo tiempo el modelo para los genetistas moleculares. Otras regiones de cromatina condensada. en cada célula eucariótica parece haber un gran exceso de DNA. La transcripción del DNA a RNA ocurre solamente durante la interfase. cuando la eucromatina está laxa. pero la eucromatina se vuelve más laxa. cuando las células se diferencian durante el desarrollo embrionario. Por contraste en los procariotas y más aún en los virus. o hasta millones de veces. pero las variaciones entre las diferentes especies son enormes. Además. con algunas pocas excepciones. La metilación diferencial de ciertos genes en ambos sexos. localizada en la región del centrómero del cromosoma. reflejando la biosíntesis de diferentes proteínas por diferentes tipos de células. Algunas regiones heterocromáticas son constantes de célula a célula y nunca se expresan. Esto fue un descubrimiento particularmente sorprendente. por el contrario. desempeña un papel en el desarrollo temprano del embrión. cada molécula de DNA cromosómico contiene típicamente sólo una . o por lo menos de DNA cuyas funciones son desconocidas. varían de un tipo de célula a otro dentro del mismo organismo. Esta región. En segundo lugar. en una misma especie. METILACION GENOMA EUCARIÓTICO El examen del DNA de las células eucarióticas reveló cuatro sorpresas principales. que ocurre durante la gametogénesis. En primer lugar. que ocurre después de la replicación. la impronta genómica. la heterocromatina permanece condensada. la proporción de heterocromatina aumenta respecto de la de eucromatina a medida que la célula se vuelve más especializada. En E.21 - . En tercer lugar.

se conocen como DNA de secuencia simple.ADN RECOMBINANTE copia de cualquier gen dado. este hallazgo fue sorprendente porque. Además. el DNA de copia única. pero también existe en pequeña cantidad en las mitocondrias y . las proteínas que ellos codifican difieren ligeramente en estructura y en propiedades biológicas. estas secuencias de DNA se conocen como pseudogenes. CLASES ADN El ADN es por lo común el constituyente básico de la cromatina (cromosoma) nuclear en las células eucarióticas. y las secuencias codificadoras. en consecuencia. como los que codifican para las cadenas polipeptídicas de las moléculas de hemoglobina. aquellas que se expresan. constituye hasta el 70% del DNA cromosómico en los seres humanos y dentro de esta fracción se encuentra el DNA que codifica para la mayor parte de las proteínas. RNA de transferencia e histonas. Los estudios de hibridación y secuenciación han mostrado tres clases de DNA eucariótico. forman familias génicas. El DNA de secuencia simple está asociado con la heterocromatina fuertemente condensada en la región del centrómero. así. El DNA de repetición intermedia incluye múltiples copias de los genes que codifican para los RNA ribosómico. un gen está presente solamente dos veces por cada célula eucariótica diploide. Las repeticiones múltiples de secuencias de nucleótidos cortas. dispuestas característicamente en tándem. Algunos miembros de las familias génicas no se expresan. Se cree que las familias génicas tienen sus orígenes en duplicaciones génicas que ocurrieron como resultado de ³errores´ de recombinación. se conocen como DNA de repetición intermedia. las principales excepciones son los genes que codifican los RNA ribosómicos. Los datos actuales indican que sólo un 1% del genoma humano puede traducirse a proteína. La tercera clase. La cuarta sorpresa. Los exones son los segmentos que están presentes en el mRNA citoplásmico y que se traducen a proteína. no en una multitud de copias. no están presentes en el mRNA en el citoplasma y. supuestamente a raíz de mutaciones deletéreas. sino que están interrumpidas por secuencias no codificadoras. Aunque los intrones se transcriben a RNA en el núcleo. seguidos por diferentes mutaciones en diferentes copias del gen. no se traducen a proteínas. Las secuencias no codificadoras que producen interrupciones dentro de un gen se conocen como secuencias interpuestas o intrones. y tal vez la más inesperada de todas. fue que las secuencias de genes eucarióticos que codifican para proteínas habitualmente no son continuas. Las repeticiones más largas. Los genes individuales de la familia difieren ligeramente en sus secuencias de nucleótidos. de acuerdo con la genética mendeliana. Algunos genes estructurales. habitualmente dispersas en el cromosoma. son llamadas exones.22 - .

es desnudo) y en los virus (DNA virus) que lo poseen constituyen el virión o elemento infestante. y las proporciones serían las mismas en otras especies. Por cada vuelta de la hélice hay 11pb. a diferencia de los exones que .  ADN satélite(altamente repetitivo: 28 %)son unidades cortas de pares de nucleótidos que se repiten en el genomio. Los porcentajes indicados son del hombre y el ratón. Existen diferentes tipos que los podemos dividiren:  ADN de copia única(el 57 % del total) formados por segmentos de aproximadamente 1000 pares de nucleótidos del longitud. Está formado no por 1 par de bases como unidad sino por 2 pares de bases. Son característicos en cada especie y pueden ser separados por centrifugación. Constituyen la heterocromatina y no se le conoce función.23 - . Las bases nitrogenadas se colocan casi exactamente perpendiculares al eje de la doble cadena (eje azúcar ± fosfato). A-ADN: es ADN de tipo Dextrogiro (la hélice está enrollada hacia la derecha). Acorde a lasevidencias. Por cada vuelta de la hélice hay 10pb. Es la estructura más estable de las 3. y se cree se forma durante la transcripsion. Tiene una estructura molecular más distendida y por lo tanto relativamente "débil" porque la distancia entre las bases y el eje de la hélice es mayor. todo eso provoca que la molécula adquiera una forma de zig ± zag.ADN RECOMBINANTE cloroplastos. Se intercalan con el ADN de copia única. B-ADN: es Dextrogiro también y es la forma más abundante del ADN. Al parecer se presenta cuando intracelularmente no hay agua o en muestras de ADN deshidratadas (por ejemplo en las usadas para cristalografía). INTRONES Unaregión del ADN que debe ser eliminada del transcrito primario de ARN es un intrónpor el hecho que son segmentos no codificados. En los procariontes forma el nucloide (que a diferencia de los eucariontes no va asociado a proteínas. Este ADN tiene la particularidad de presentar zonas metiladas por lo cual no puede ser transcrito a ARN mensajero. sólo una pequeña parte del ADN constituye genes (menos del 10 %). una pequeña parte de este ADN contiene los genes. Z-ADN: Es de tipo Levógiro.  ADN repetitivo(20 %)son unidades de aproximadamente 300 pares de nucleótidos* que se repiten en el genoma unas 105 veces(unidades de repetición).

haciendo más fácil moverlos y crear nuevos genes. Takifugu rubripees. en lo que constituye un proceso más eficiente que construir los nuevos genes a razón de un nucleótido a la vez. mientras que los mamíferos y las angiospermas (plantas con flores) suelen presentar numerosos intrones. La segunda pregunta sigue siendo tema de estudio. el pez globo. Existen diferentes métodos de empalme del ARN. la primera es la que tiene la respuesta más satisfactoria. Esta teoría nos lleva hacia la "hipótesis de barajeo de exones". la cual afirma que los intrones incrementan el porcentaje de recombinación de los exones. así como entre los genes de una misma especie. Los Intrones son comunes en todos los tipos de ARN eucariota. que ocurre dentro del núcleo de una célula. y la mayoría requiere de la ayuda de proteínas que reconocen secuencias específicas en el pre-ARN. . El número y longitud de los intrones varía enormemente entre especies. motiva la formación de nuevos genes a partir de sub-unidades estructurales y funcionales de los genes existentes. Se sabe que los intrones son removidos del ARN mediante un proceso denominado empalme del ARN. La denominada "teoría exótica de los genes" sugiere que los exones son los bloques constructores de las proteínas y que los genes se crean a partir de las combinaciones de estos bloques constructores. tiene pocos intrones en su genoma. Por ejemplo.24 - . además pueden encontrarse en algunos ARNt y ARNr de procariotas. especialmente en los ARN mensajeros (ARNm).ADN RECOMBINANTE son regiones que codifican para una determinada proteína. Existen 3 preguntas que los científicos estan tratando de resolver acerca de los intrones: ¿Cómo se remueven los intrones del ADN? ¿Qué hacen los intrones? ¿Cuál es el origen de los intrones? De estas 3 preguntas. De acuerdo a esta teoría. el cual es una especie de "edición" del contenido del ARN (es decir. la estructura intrón-exón de los genes eucarióticos. es un proceso de remoción de intrones).

Los intrones del grupo II y III son muy similares y presentan una estructura secundaria altamente conservada. estos ancestros no poseían intrones y los eucariotas los obtuvieron durante el proceso evolutivo. los ancestros de los eucariotas y los procariotas poseían intrones. respectivamente. la pregunta que resulta más obvia es: si los intrones son útiles para la recombinación. se forma una estructura en lazo característica denominada lariat. pero éstos últimos los perdieron durante su proceso evolutivo. De acuerdo con la segunda teoría. Los del grupo IV están presentes en los ARNt de los eucariotas y se caracterizan por ser los únicos que se eliminan mediante un corte endonucleótido seguido de un ligamiento en lugar de la reacción de transesterificación . existen dos teorías comúnmente aceptadas: la teoría de los "intrones tempranos" y la de los "intrones tardíos". Los intrones del grupo I están presentes en los genes de ARNr de algunos eucariotas inferiores y en los genes mitocondriales de hongos.25 - . entonces ¿por qué sólo aparecen en los organismos eucariotas y no en los procariotas? Respecto a la tercera pregunta. aunque pueden tenerlas en su interior.ADN RECOMBINANTE Ante esta teoría. De hecho a veces los intrones del grupo III son identificados como intrones del grupo II debido a su similitud funcional y estructural. En ambos grupos. spliceosomales o intrones del grupo IV Los intrones del grupo I. Se caracterizan por eliminarse mediante un proceso auto-catalítico que requiere de una guanosina o un nucleótido de guanosina libre. II y III son intrones que sufren de autosplicing mediante reacciones de transesterificación. La frecuencia con la que encontramos estos intrones en el genoma es relativamente rara si la comparamos con la frecuencia de los intrones spliceosomales. Según la primera. así como por carecer de secuencias consenso en los puntos de empalme. durante el proceso de empalme de los exones. Los del grupo II y III se eliminan mediante un proceso auto-catalítico que requiere de una adenina o de un spliceosoma. Actualmente se reconocen cuatro clases de intrones: Intrones del grupo I Intrones del grupo II Intrones del grupo III Intrones nucleares.

La enzima que añade este polinucleótido (diferente para cada especie) es la telomerasa. Las repeticiones suelen ser de decenas. Expansión de trinucleótidos: En ciertos genes hay repeticiones de un trinucleótido entre 10 y 100 veces. que no se da en otras partes del genoma. que sintetiza ADN independientemente de molde. que abundan en el ADN espaciador entre genes. Favorecen la replicación del ADN en el extremo lineal del cromosoma. Repeticiones de CA en el ADN centromérico. hay dos presentes en todos los ARNm y que se encuentran antes y después de los codones y y y y . ADN telomérico: Consta de secuencias altamente repetidas (cientos de veces) de 4 a 8 nt. ayuda a estabilizar los cromosomas y evitar su degradación por esos extremos. antes del promotor. pero también parece limitar el número de potenciales divisiones celulares. Parece que. además. con un patrón de distribución del dinucleótido característico. hacen suponer una misión reguladora a estas secuencias. Agrupaciones de AT y de CA. por lo que probablemente modulen la unión a ese elemento. De hecho. Tanto la rareza como esta especial distribución y concentración. y Islas CG: Se encuentran aproximadamente 1 Kpb a 5' de muchos genes. sobre todo. tanto en la secuencia codificante como en los intrones y las 3' y 5' UTR (untranslated terminal region: región no traducida terminal. se han encontrado elementos conocidos de regulación solapando con ellas (cajas).26 - .ADN RECOMBINANTE REPETICIONES Y NO REPETICIONES ADN repetido.

en algún momento. porque la proteína pierde su función. Se sabe que estos elementos son capaces de incluirse en otro sitio del genoma porque se han detectado casos de mutaciones en las que un exón quedaba interrumpido por una de estas secuencias que antes no estaba ahí. traducirse (no se sabe si con un promotor propio o con otro cercano) para después retro-transcribirse (como los retrovirus. Estructura de ADN en cuádruplex formada por repeticiones Repeticiones de secuencias largas. cuando no parecen tener ninguna función. y la enfermedad se desarrolla cuando se sobrepasa cualquiera de los dos límites. probablemente. LINE (secuencias largas dispersas entre genes): Son secuencias de unos 7000 pb que se encuentran flanqueando genes. Por su tamaño forman parte del ADN y . Se dice entonces que la mutación es knockin (mutación por inclusión de material genético). y SINE (secuencias cortas dispersas entre genes): Son secuencias de unos cientos de pb.27 - . Lo que es evidente es que juegan un papel importante en la construcción de genomas y que.ADN RECOMBINANTE de inicio y terminación. posee entre 10 y 30 repeticiones del trinucleótido CAG cuando es funcional. la huntingtina. Las que mejor se conocen son las de la familia Alu. en la que el gen que codifica para la proteína responsable. No se conoce el mecanismo de replicación de estas secuencias. lo han hecho a lo largo de la evolución generando una gran variabilidad. pero se supone que deben. y la gravedad es proporcional al número de repeticiones de más. cada una con 300 pb y distribuidas en 500000 copias. pero en cualquier caso no se sabe qué son ni porqué permanecen en el genoma. respectivamente. posibles implicaciones evolutivas) en ADNds y posteriormente incluirse al azar en el genoma. con las secuencias de adhesión y disociación del ribosoma y con implicaciones en la expresión génica). Este fenómeno se conoce muy bien en la enfermedad de la corea de Huntington. presentes en un muy elevado número de copias.

la unión o separación de cromosomas. sobre él pueden desarrollarse fenómenos de mutación al azar que deriven en un gen funcional y reviertan la inactivación o. Es importante no confundirlo con ADN repetido. el codón de iniciación. Sin embargo. como es el caso de la mayoría de las talasemias que conciernen al locus de la hemoglobina. denominados LCR (locus controlling regions: regiones controladoras del locus). se conoce desde hace mucho tiempo que familias génicas como. aun constando de proteínas independientes. Generalmente las familias génicas se encuentran agrupadas. Muchas veces. Se cree que favorecen la recombinación y el sobrecruzamiento. el producto no es funcional. sin llegar a ser alelos (variantes de un mismo gen) porque codifican para productos distintos. por lo que su principal misión sería favorecer la diversificación genética. excepto alguno esencial (el promotor. durante la evolución de una copia de un gen determinado. ya que alguna vez la recombinación puede no ser homóloga y provocar. etc. por ejemplo. FAMILIAS GENÉTICAS -TRANSCRIPCIÓN Y PROCESAMIENTO DE ARN EN EUCARIOTES Una familia génica es un conjunto de genes con un alto grado de homología que. y los genes que las constituyen distan unos pocos Kpb unos de otros. . es parte activa en procesos de recombinación genética porque su secuencia es altamente homóloga con la de los genes funcionales de su alrededor. la de las hemoglobinas. por ejemplo. A pesar de que es un gen inútil. de modo que se puede considerar la existencia de un elemento de regulación de la familia entera. posee una regulación conjunta de todos los genes durante el desarrollo. por lo que se selecciona negativamente y se inactiva permanentemente. a corto plazo. pero no se sabe cómo actúan.ADN RECOMBINANTE moderadamente repetido. sobre todo porque controlan la expresión de genes que están a Mpb de distancia. Este gen nunca transcrito se llama pseudogén. También tiene importantes implicaciones evolutivas. a veces. Este hecho permite la aparición de mutantes híbridos. actúan de manera totalmente independiente. diversificación y evolución independiente. poseen un parentesco evolutivo que es consistente con un proceso de copia. o impide el buen funcionamiento en uno u otro sentido. cada uno con sus propios elementos de regulación que. porque tiene todos los elementos necesarios para poder llegar a sintetizarse. Se han descubierto elementos de ese tipo a 5' del locus de la hemoglobina.28 - . pero son independientes.).

Una ristra de adeninas (tanto como 200 nucleótidos conocido como poli-A) se agrega al extremo 3' del mARN luego de la transcripción.ADN RECOMBINANTE Los ARNr son un ejemplo de familia génica. claro. Transcripción El proceso de transcripción en los eucariotas es similar a los de los procariota. Si bien los procariotas tienen un solo tipo de ARN polimerasa para todos los tipos de ARN. Luego que en el núcleo de la célula eucariota se transcribe un ARN. Cada gen eucariota se transcribe separadamente. una para los rARN largos y una tercera para los rARN cortos y los tARN. el ARN transcripto es extensamente modificado antes de ser exportado al citoplasma. Cada una de estas copias tiene su propio promotor. pero puede usarse para capturar mARN para estudios. mientras que en eucariotas tenemos dos procesos separados en tiempo y localización (recordar la existencia de una envoltura nuclear). pero en todas es el mismo. Se le agrega 7-metilguanina (una base inusual) al extremo 5' del mARN. no por las posibles analogías entre cada uno de ellos. En procariotas la traducción comienza inclusive antes que la transcripción haya terminado. La función de esta "cola" de poli A no se conoce. Una para el mARN.29 - . los eucariotas tienen una para cada tipo. Los genes eucariotas no se agrupan en operones como los de los procariotas. y esto resulta esencial para el pegado del mARN al ribosoma. sino en que en una célula eucariota suele haber cientos de repeticiones en tándem del conjunto de genes que los codifican. Existen muchos ejemplos de mensajes idénticos procesados por diferentes métodos (ver El ACTH y su . Los intrones se cortan y los exones se colocan juntos antes que el mARN deje el núcleo. En el humano son unas 200 copias repartidas en cinco cromosomas. existen sin embargo algunas diferencias. con un control transcripcional independiente para cada gen.

El ARN mensajero (ARNm. Esta cola protege al ARNm frente a la degradación. es decir. el procesamiento del ARN en eucariotas comprende diferentes fases: 1.30 - . o mRNA de su nombre en inglés) es el ácido ribonucleico que contiene la información genética procedente del ADN para utilizarse en la síntesis de proteínas. a veces los intrones se tornan exones y viceversa. contienen información para una sola cadena polipeptídica. el ARN mensajero sufre la eliminación de secuencias internas. En la mayoría de los casos.ADN RECOMBINANTE familia de péptidos). la adición de otros no codificados en el ADN y la modificación covalente de ciertas bases nitrogenadas. que en la mayoría de los casos no se libera del complejo de transcripción en forma totalmente activa. situada unos 20-30 nucleótidos antes del extremo 3' original. no codificantes. que se añade al extremo 5' de la cadena del ARNm transcrito primario (ubicado aún en el núcleo celular) mediante un enlace 5'-fosfato 5'1 fosfato en lugar del habitual enlace 3'. codifican más de una proteína. de modo que se puede sintetizar mayor cantidad de proteína. sino que ha de sufrir modificaciones antes de ejercer su función (procesamiento o maduración del ARN). Poliadenilación: es la adición al extremo 3' de una cola poli-A. Procesamiento de ARN El ARN mensajero obtenido después de la transcripción se conoce como transcrito primario o ARN precursor (pre-ARN). una secuencia larga de poliadenilato. es decir. Su adición está mediada por una secuencia o señal de poliadenilación (AAUAAA). aumentando su vida media en el citosol. es decir. Moléculas de proteínas se pegan al mARN y luego se exportan del núcleo formando partículas llamadas ribonucleoproteínas (mRNPs) que parecen ayudar en el transporte por los poros nucleares y también en el pegado a los ribosomas. ya que estas no poseen intrones en su ADN. Todos los ARNm eucarióticos son monocistrónicos. El proceso de retirada de los intrones y . Esto no ocurre en células procariontes. mientras que en los procariotas los ARNm son con frecuencia policistrónicos. 2. la 7metilguanosina. El ARN mensajero es un ácido nucleico monocatenario. Entre esas modificaciones se encuentran la eliminación de fragmentos (splicing). Adición al extremo 5' de la estructura denominada caperuza o casquete (o CAP.5'-fosfodiéster. es decir. Esta caperuza es necesaria para el proceso normal de traducción del ARN y para mantener su estabilidad. un tramo de RNA cuyas bases son todas adenina. 3. Concretamente. al contrario que el ADN que es bicatenario. llamadas intrones. determina el orden en que se unirán los aminoácidos. esto es crítico para el reconocimiento y el acceso apropiado del ribosoma. su nombre en inglés) que es un nucleótido modificado de guanina.

generalmente con la ayuda de ribonucleasas. en las procariotas. el ARN mensajero no pasa por un proceso de maduración y. o corte y empalme (en inglés. Después de cierta cantidad de tiempo el ARNm se degrada en sus nucleótidos componentes. La diferencia fundamental está en que. ni se le quitan intrones. . El proceso de transcripción y el de traducción se realizan de manera similar que en las células eucariotas. Además no tiene que salir del núcleo como en las eucariotas. A veces un mismo transcrito primario o pre-ARNm se puede ayustar de diversas maneras. splicing). 6. estos dos organelos tienen su propia información genética y se replican de manera independiente del DNA nuclear. a través de poros de la membrana nuclear. que son la maquinaria encargada de la síntesis proteica. 4. no se le añade caperuza ni cola. porque en las células procariotas no hay un núcleo definido.ADN RECOMBINANTE conexión o empalme de los exones se llama ayuste. permitiendo que con un solo gen se obtengan varias proteínas diferentes. por lo cual su DNA presenta muchas mutaciones. ADN DE LOS ORGANELOS ENERGÉTICOS Existen dentro de la célula dos organelos que aportan energía la mitocondria y el cloroplasto. el ARNm se acoplan los ribosomas. Ciertas enzimas parecen estar involucrados en editar el RNA antes de su exportación fuera del núcleo.31 - . a este fenómeno se le llama ayuste alternativo. 5. En procariontes. intercambiando o eliminando nucleótidos erróneos. la unión de los ribosomas ocurre mientras la cadena de ARNm está siendo sintetizada. El ARN mensajero maduro es trasladado al citosol de la célula. en el caso de los seres eucariontes. por lo tanto. Una vez en el citoplasma. Aquí ocurren diversas reacciones de fosforilación oxidativa.

htm Trabajos y Páginas web consultadas http://es.cobach-elr. ya no pudieron dejar de ser diferentes organismos y al evolucionar. N. BIBLIOGRAFÍA Molecular CellBiologyfiftheditionLodish BiologíaCelulardelosMicroorganismos-Brock 10ma Edición Biología de Curtis H.es/personal_pdi/ciencias/bolarios/BiologiaCCAA/resumenes/tema14. se convirtieron en una sola célula.com/academias/quimicas/biologia/biologia/curtis/inicio.fmedic.org/wiki/ADN_recombinante http://www.32 - .wikipedia. y 6ta edición versión online http://www. Sue Barnes 5ta. así que estos tres organismos comenzaron a convivir.uam.htm http://laguna. haciendo que unos dependieran de otro. eran organismos procariotes capaces de realizar dichas funciones antes mencionadas y que aportan a la célula energía.mx/~evazquez/0403/dna%20recombinante.html . Las células eucariotes primitivas no eran capaces de fotosintetizar (cloroplastos) o de realizar fosforilizaciones (mitocondria).. Al crearse ese vínculo fuerte.ADN RECOMBINANTE El por qué estos dos organelos tienen DNA está basado en una teoría llamada "endosimbiótica" en donde menciona que la mitocondria y el cloroplastos.unam.

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34 - .ADN RECOMBINANTE .

ADN RECOMBINANTE CUADROS DE RESUMEN I .

ADN RECOMBINANTE II .

ADN RECOMBINANTE III .

ADN RECOMBINANTE IV .

ADN RECOMBINANTE V .

ADN RECOMBINANTE VI .