ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE
Tecnología del estudio de ADN
Permite el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en otro. Entre sus aplicaciones se encuentra la producción de grandes cantidades de la proteína codificada por dicho gen, como por ejemplo proteínas humanas en cantidad suficiente para que puedan ser utilizadas como fármacos. Las proteínas obtenidas por esta técnica se denominan proteínas recombinantes.

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ADN RECOMBINANTE

INDICE
ADN Recombinante ..................................................................... 1 Aislamiento de segmentos específicos de ADN ........................... 2 Vectores ........................................................................................ 4 Enzimas de Restricción ................................................................ 5 Células Huésped ........................................................................... 5 Clonación ± clones ....................................................................... 6 Hibridación de ácidos nucleicos .................................................. 7 - Métodos de laboratorio (hibridación)....................................... 9 --Uso de Sondas radioactivas ....................................................... 10 Secuenciación de ADN ................................................................. 11 -Técnicas de Secuenciación ......................................................... 12 Biotecnología ............................................................................... 15 Obtención de ADN ....................................................................... 16 Genética molecular de los eucariotas ± Expresión Génica ........................................................................................... 17 El cromosoma eucariótico ± la regulación ................................. 19 Regulación de la expresión génica ± metilación ......................... 20 El genoma eucariótico .................................................................. 22 Clases de ADN .............................................................................. 23 Intrones ......................................................................................... 24 Repeticiones y No repeticiones .................................................... 26 Familias genéticas ± transcripción .............................................. 28 Procesamiento de ARNen eucariotas ......................................... 30 ADN de los organelos energéticos. .............................................. 32 Bibliografía ................................................................................... 33 Anexos

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ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE
La tecnología del ADN recombinante permite el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en otro. Entre sus aplicaciones se encuentra la producción de grandes cantidades de la proteína codificada por dicho gen, como por ejemplo proteínas humanas en cantidad suficiente para que puedan ser utilizadas como fármacos. Las proteínas obtenidas por esta técnica se denominan proteínas recombinantes. Antes de la tecnología del ADN recombinante también se utilizaban como medicamentos algunas proteínas, sin embargo la manera de obtenerlas era o bien por síntesis química, o bien mediante el aislamiento de la proteína a partir de su fuente natural (tejido o fluido animal, humano o de plantas). No obstante, ambas técnicas tienen sus limitaciones. La síntesis química debido a su complejidad y elevado coste sólo es aplicable cuando la proteína de interés es muy pequeña. Por su parte, el aislamiento de las proteínas a partir de la fuente natural a menudo se encuentra con el problema de que el rendimiento de la extracción es muy bajo. Por ejemplo hasta hace relativamente poco tiempo la única manera de obtener factores de coagulación para personas hemofílicas era mediante la manipulación de litros de sangre, y era necesario procesar cientos de hipófisis de cadáveres humanos para sacar una pequeña cantidad de hormona del crecimiento, imprescindible para tratar algunos problemas de enanismo. Mediante la aplicación de las técnicas de ADN recombinante es posible solventar estos problemas y obtener proteínas que no se podrían conseguir con los métodos tradicionales. La tecnología de ADN recombinante se desarrolla en tres pasos: el aislamiento del gen de interés, la clonación y expresión de dicho gen, y la producción a gran escala de la proteína codificada por el gen. Cada uno de estos procesos precisa de unas herramientas la mayoría de las cuales son ofrecidas por la propia naturaleza. El aislamiento de un gen no es fácil. Originariamente lo que se hacía era aislar la proteína de la que se quería obtener el gen e intentar determinar por medios químicos la secuencia de aminoácidos que la componían. Este proceso se denomina secuenciación de proteínas y a diferencia de la secuenciación de ADN es técnicamente muy complicado. Si la proteína es suficientemente pequeña puede ser secuenciada en su totalidad y esta información, gracias al código genético, era utilizada para sintetizar químicamente el gen. Para proteínas de tamaño medio o grande lo que se hacía era secuenciar solamente una pequeña parte de la proteína y, utilizando también el código genético, fabricar una cadena de ADN de 15 ó 20 nucleótidos que era complementaria a una de las cadenas del gen o al ARNm correspondiente. Esta corta cadena de nucleótidos se marcaba radiactivamente o por fluorescencia y se utilizaba como sonda para identificar el gen completo o el ARNm completo que llevan la información para sintetizar la proteína de interés. En el caso de que hayamos localizado el ARNm tenemos

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que convertirlo en ADN. Este proceso se hace mediante la enzima llamada transcriptasa inversa. La cadena de ADN obtenida utilizando la información de un ARNm se llama ADN complementario o abreviadamente ADNc. Actualmente gracias a la existencia de genotecas y a la secuencia de muchos genomas, entre ellos el humano, el aislamiento de cualquier gen es una tarea mucho más simple. Los cromosomas, incluso los de las células eucariotas más simples, contienen una enorme cantidad de DNA, por lo que localizar un segmento específico es como tratar de encontrar una aguja en un pajar. Para localizar fragmentos específicos se utiliza la técnica de hibridación de ácidos nucleicos En los comienzos de la investigación del DNA recombinante, los biólogos se dieron cuenta de que los segmentos de DNA que codifican ciertas proteínas (particularmente las de importancia médica o agrícola) pueden transferirse a bacterias y ser expresados por ellos se las usa como ³fábricas´ para suministrar ilimitadamente proteínas. Estofue el inicio de la biotecnología.

AISLAMIENTO DE SEGMENTOS ESPECÍFICOS DE DNA
Una de las formas de obtener los fragmentos específicos de DNA es cortando moléculas de DNA con enzimas de restricción, transcribiendo el mRNA a DNA con la enzima transcriptasa inversa, o por medio de la síntesis de oligonucleótidos en el laboratorio. Las enzimas de restricción se encuentran en la naturaleza en las células bacterianas y en algunos bacteriófagos. Escinden las moléculas de DNA en secuencias de reconocimiento específicas, que típicamente tienen de 4 a 8 nucleótidos de longitud. Su función en las células bacterianas es degradar moléculas de DNA extrañas. El DNA de la bacteria se protege de sus propias enzimas de restricción por la metilación de nucleótidos en las secuencias de reconocimiento. Algunas enzimas de restricción producen cortes de la molécula de DNA que dejan extremos rectos. Otras cortan de manera escalonada, dejando extremos ³pegajosos´ que luego pueden unirse, por apareamiento de bases complementarias, con otros fragmentos producidos por la misma enzima. Esto hace posible combinar segmentos de DNA de

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la transcriptasa inversa cataliza la síntesis de DNA a partir del molde de RNA viral. segmentos que se conocen como DNA complementario. como también el RNA viral que será empaquetado en nuevas partículas virales. estas secuencias se denominan secuencias palindrómicas. Algunas enzimas como EcoRI y HindIII escinden el DNA dando como resultado extremos "pegajosos". se transcribe a partir de este DNA. Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción frecuentemente tienen seis pares de bases de longitud y. Esta enzima es capaz de sintetizar DNA a partir de un molde de mRNA. Las enzimas de restricción generalmente se obtienen de bacterias y su nombre deriva del nombre científico de esas bacterias: HpaI es de Hemophilus parainfluenzae.ADN RECOMBINANTE fuentes diferentes. que codifica proteínas virales. si es tratada o digerida con diferentes enzimas de restricción. En el laboratorio. EcoRI es de E. la transcriptasa inversa puede utilizarse para sintetizar DNA a partir de un molde de RNA. -3- . los retrovirus. coli y HindIII es de Hemophilus influenzae. o cDNA. cuando se leen en la misma dirección (por ejemplo 5' a 3'). Cuando estos virus infectan una célula hospedadora. Otra herramienta para obtener fragmentos específicos de DNA la transcriptasa inversa que fue aislada de ciertos virus que contienen genoma de RNA. llamados fragmentos de restricción. el mRNA viral. Una misma molécula de DNA producirá distintos fragmentos. El gran número de enzimas de restricción y de secuencias de reconocimiento diferentes hace posible que se las utilice para empalmar segmentos de DNA genómico de una variedad ilimitada de fuentes. las dos cadenas complementarias de la secuencia son idénticas.

ésta en lugar de llevar a cabo este proceso. mediante el uso de técnicas de tinción. tanto el nuevo RNA genómico viral como el mRNA para la síntesis de proteínas virales. por ejemplo. Para separar moléculas de DNA de mayor tamaño. un polisacárido aislado de ciertas algas. o bien a medida que la célula se dividía. a pesar de que se conseguía introducir el gen en la célula huésped que debía fabricar la proteína humana. -4- . como los geles de agarosa. Los fragmentos de DNA separados no pueden ser visualizados directamente. produciéndose una molécula de cDNA de doble cadena. Estos problemas fueron soslayados cuando se descubrió que se podían emplear unas herramientas que también están en la naturaleza: los plásmidos y los virus. a partir del DNA viral integrado. Esta envoltura puede fusionarse con la membrana celular de un nuevo hospedador. así como la de degradación de la molécula original del RNA viral. El cDNA de doble cadena puede integrarse al cromosoma de la célula hospedadora. Para separar fragmentos de DNA menores de 500 nucleótidos se utiliza como matriz un gel de poliacrilamida. son catalizadas por la enzima transcriptasa inversa. c) Comienza de inmediato la síntesis de la segunda cadena de DNA (complementaria a la primera). permitiendo que el virus entre en la célula. sólo una de las hijas recibía copia del gen humano por lo que dicho gen iba diluyéndose. VECTORES DE TRANSFERENCIA: PLASMIDOS Los primeros experimentos destinados a conseguir producir proteínas humanas en microorganismos fallaron porque.ADN RECOMBINANTE a) La cápside de un retrovirus está rodeada típicamente por una envoltura externa de lipoproteína formada por elementos de la membrana celular de su hospedador anterior y por proteínas virales. b) Una vez que el retrovirus ha entrado en la célula. El tamaño de poro de este gel permite separar moléculas cuyo tamaño difiere en un solo nucleótido. el RNA viral se libera de la cápside y se transcribe a una única cadena de DNA complementaria (cDNA). o bien degradaba el gen que se le había introducido. Estas reacciones. Posteriormente se transcriben. se utilizan matrices con poros mayores.

por lo que se denominan moléculas transportadoras o vectores. Por su parte. 3. independientemente del genoma de la célula. se podrán unir debido a la complementariedad de sus bases. Los plásmidos y virus permiten introducir el gen de interés en la célula huésped. Hacerlo de manera barata. de las demás. CÉLULAS HUÉSPED Una vez que el vector presente el gen de interés. Cortando el genoma huésped y el gen a insertar con las mismas enzimas los extremos de ambos se vuelven "cohesivos". Hay tres tipos de células huésped: bacterias. se transfiere a la célula huésped. y que se caracterizan porque pueden replicarse. se vuelven a unir las cadenas de los ácidos nucleicos quedando insertado nuestro gen de interés en el lugar del genoma del vector que nos interese. especialmente cepas de Escherichia coli. lo que permite distinguir las células que han incorporado el plásmido. es decir "reproducirse". Un buen organismo huésped debe caracterizarse por: 1. Esto es. ENZIMAS DE RESTRICCION En general para introducir el gen de interés en el genoma de estos vectores se utilizan las enzimas de restricción. Que sea fácilmente manipulable. Poder crecer rápidamente. y que por consiguiente son capaces de crecer en un medio con el antibiótico. los virus son entidades que están especializadas precisamente en insertar su material genético en células y utilizar la maquinaria de éstas para multiplicarse. gracias a otra enzima denominada ligasa. Muchos de ellos contienen genes de resistencia a antibióticos. 2. Después.ADN RECOMBINANTE Los plásmidos son moléculas de ADN circular que se encuentran en muchas bacterias y levaduras. Estas enzimas cortan los genomas en unas secuencias específicas. levaduras y ciertas células eucariotas como las líneas celulares derivadas de algún -5- .

ésta se aísla a partir del medio de cultivo en el que crecen las células o del interior de las propias células dependiendo del tipo de células que se utilizan como sistema de expresión y de cómo se haya diseñado el gene dicha proteína. El aislamiento de una proteína a partir de la mezcla de células.ADN RECOMBINANTE mamífero. etc. se inocula a un fermentador o a botellas de cultivo. Las bacterias se caracterizan porque su material genético es muy simple. A continuación hay que separar las células que han incorporado el vector del resto.y se permite que las células crezcan ofreciéndoles las condiciones más favorables de temperatura. nutrientes. humedad. Para ello el clon de células huésped que mejor expresa el gen de la proteína de interés se selecciona. Cuantas más células huésped estén fabricando la proteína de interés. CLONACIÓN Una vez escogida la célula huésped se pone en contacto con el vector al que se ha incorporado el gen de interés. Las células hijas fabricarán todas sub-proteínas más la proteína extraña que se le ha introducido. Cada uno de estos tipos celulares tiene sus ventajas e inconvenientes. no crecen tan rápido y suelen ser más difíciles de tratar. nutrientes y otras moléculas presentes en el medio de cultivo es una tarea cuya puesta a punto puede ser -6- .en función del tipo de célula huésped. Mediante diferentes técnicas se facilita la entrada del vector en las células. la ventaja es que ambos sistemas pueden llevar a cabo modificaciones como las descritas anteriormente. Una de las células modificadas se hace crecer obteniéndose así múltiples células hijas que contienen el gen y que proceden de una única célula inicial. Este proceso de seleccionar y hacer crecer una única célula se denomina clonación. suelen crecer muy rápido y las condiciones de crecimiento son bastante sencillas. especialmente estas últimas. Su principal inconveniente es que no llevan a cabo algunas de las modificaciones que sí realizan las células eucariotas en las proteínas. mayor cantidad de dicha proteína se podrá obtener. No obstante. Tras obtener suficiente cantidad de proteína de interés. por ejemplo la glicosilación. La síntesis de la proteína deseada por la célula huésped es lo que se conoce como expresión del gen de dicha proteína. Las levaduras y las líneas celulares son más complicadas.

El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de desnaturalización ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrógeno. que son las que captan la energía. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ± SONDAS RADIOACTIVAS La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos anti-paralelas y con secuencia de bases complementarias. T=A o U=A Así que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán la una a la otra rápidamente. En caso de que la proteína recombinante se vaya a utilizar como medicamento. A=U. una simple variación de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultará la unión. es más. debido a las diferentes geometrías de los nucleótidos. están totalmente expuestos a la fuente emisora de energía. para uniones ADNARN. entre otros motivos porque existen enfermedades genéticas debidas a mutaciones en el ADN mitocondrial. Por el contrario. el %GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN mitocondrial. y dado que se requiere más energía para romper tres enlaces que para romper dos. por tanto. que toma la estructura de doble hélice. El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la solución que contiene a la molécula. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260 nm). para uniones ADN-ADN y tipo Northern. que es el proceso por el cual la proteína se preparará en su forma farmacéutica definitiva que será la que le dará la máxima estabilidad y eficacia.ADN RECOMBINANTE compleja y que requiere la aplicación de variadas técnicas bioquímicas de separación como las cromatografías. lo que nos da bastante juego en los protocolos de extracción de ADN. donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. en una única molécula de doble cadena. dicha energía se traduce en una mayor temperatura. El %GC no es igual para todas las especies. según qué tipo vamos a estudiar y esto es importante. Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T. En biología molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridación: Tipo Southern. ya que en esta última los dobles enlaces de las bases nitrogenadas. C G. G C. -7- . la absorción de energía será mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla. el paso siguiente es la formulación de la proteína purificada.

Luego del revelado de la película. Las moléculas de doble cadena que se hayan formado permanecen en su lugar en el filtro y su visualización se realiza por medio de autorradiografía. Las bacterias competentes se transforman con plásmidos que contienen distintos fragmentos de DNA obtenidos por digestión de un DNA genómico con una enzima de restricción. c. identifican las colonias originales que contenían vectores con el segmento de DNA que se deseaba estudiar. además. cada filtro es cubierto con una película fotográfica y dejado en la oscuridad. Sólo las bacterias que hayan adquirido el plásmido recombinante crecerán formando colonias aisladas. Durante el período de exposición. complementaria al segmento de DNA de interés. -8- . El DNA se une químicamente al filtro d. Se lava del filtro el exceso de solución que contiene las sondas que no han hibridado. Se permite que la sonda se hibride. Cada colonia se origina por divisiones sucesivas de una única bacteria inicial y todas las células de una colonia contienen el mismo plásmido recombinante. producida por un depósito de plata de la emulsión. técnica en la cual primero. Las réplicas de las colonias que estén marcadas con la sonda radiactiva después de este tratamiento. El filtro con el DNA desnaturalizado es incubado en una solución que contiene una sonda radioactiva que consiste en una molécula de DNA o RNA de cadena simple. Las bacterias transformadas son distribuidas en una placa de Petri con un medio de cultivo sólido que contiene el antibiótico de selección. un gen de resistencia a un antibiótico que se usará para la selección de las colonias que hayan incorporado el plásmido. la posición del fragmento radioactivo se observa como una marca oscura. La réplica es tratada con una solución de alto pH para romper las células y desnaturalizar el DNA del plásmido. b. Algunas bacterias de cada colonia son transferidas (blotting) a un filtro especial obteniéndose una réplica. Los plásmidos contienen. el radioisótopo libera energía que impacta la emulsión fotográfica. e.ADN RECOMBINANTE a.

Southern para la detección de genes específicos en el ADN celular.ADN RECOMBINANTE Métodos de Laboratorio Existen dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan frecuentemente en los laboratorios que utilizan técnicas de biología molecular. a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN. el método northern sirve para identificar ARN. El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. Posteriormente. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas. en qué tejidos o tipos celulares. para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué condiciones. Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físicoquímico. tipo northern o northern blot. para el caso de sondas  Northern El segundo método. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz. bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. M. El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica. el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa. -9- . A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo). se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.  Southern El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida).

Utilizando técnicas inmuno-histoquímicas se puede conocer la localización precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". con la que comparte un alto grado de similitud y que podemos observar con un microscopio electrónico. violeta. un gen que codifica una proteína de membrana de los glóbulos blancos. Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección. técnica de hibridación in situ. una secuencia sin determinar en el cromosoma 5. donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma. región del cromosoma 21 donde se encuentra el gen responsable del Síndrome de Down. amarillo. las sondas están marcadas con colorantes fluorescentes. localización en el cromosoma X del gen de la distrofia muscular infantil más común. Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir. Tras producirse ésta. y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. Cada color indica la localización de una secuencia de DNA diferente: rojo. de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana. bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que favorezcan la hibridación. junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo northern ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material orgánico. se lava el exceso de sonda no unido. . El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único. verde. con la capacidad de transportar información. un oncogén en el cromosoma 8.10 - . También en esta categoría destaca el FISH. blanco.ADN RECOMBINANTE  Hibridación in situ (uso de sondas radioactivas) Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su observación al microscopio. SECUENCIACION DE ADN Una secuencia de ADN o secuencia genética es una sucesión de letras representando la estructura primaria de una molécula real o hipotética de ADN o banda. En la hibridación in situ.

De todas las moléculas muestreadas. guanina. a derecha. Las reglas de laUnión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) son las que siguen:                A = adenina C = citosina G = guanina T = timina R = G A (purina) Y = T C (pirimidina) K = G T (keto) M = A C (amino) S = G C (enlaces fuertes) W = A T (enlaces débiles) B = G T C (todos y A) D = G A T (todos y C) H = A C T (todos y G) V = G C A (todos y T) N = A G C T (cualquiera) La Secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A. Esas letras representan ambigüedad. que son bases covalentemente ligadas a cadenas fosfóricas. Técnicas de Secuenciación Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad. Así pues. como la investigación forense. y G se presentan en una secuencia.adenina. timina.ADN RECOMBINANTE Las posibles letras son A. sin espacios. Otros proyectos relacionados. yendo de 5' a 3' de izq. En el típico caso. que simbolizan las cuatro subunidades de nucleótidos de una banda ADN . así como en campos aplicados. determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales. G. . la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. en ocasiones fruto de la colaboración de científicos a escala mundial. G y T) en un oligonucleótido de ADN. C.11 - . T. plantas y microorganismos. C. los plásmidos. hay más de una clase de nucleótidos en esa posición. lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. las secuencias se presentan pegadas unas a las otras. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular. En algunos casos especiales. han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales. las letras seguidas de A. C. como en la secuencia AAAGTCTGAC. citosina. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología. y T.

uno de los nucleótidos terminadores (ddATP.ADN RECOMBINANTE Se usan tres técnicas principales de secuenciación: una implica métodos enzimáticos y la otra usa métodos químicos y la última es una modificación de la anterior. . La solución que contiene al DNA marcado se divide en cuatro porciones. Combinando la información obtenida con cada reacción. La mezcla en la que se producirá la reacción de síntesis se separa en 4 tubos. Esta técnica se vale de oligonucleótidos sintéticos y de una DNA polimerasa termoestable. no pueden reaccionar con ningún otro nucleótido y se transforman. por lo que. en el que se separan fragmentos que difieren incluso en un nucleótido de longitud. La secuenciación depende de la disponibilidad de copias múltiples de un fragmento de DNA.12 - . ddCTP. así. En la secuenciación por el método enzimático. se puede inferir la secuencia del segmento completo. el segmento de cadena simple (presente en múltiples copias) se marca radiactivamente en el extremo 5'. Estos son dideoxinucleótidos que carecen del OH. una vez que son agregados a la cadena que se está sintetizando. cada una de las cuales se somete a un tratamiento químico diferente para romper las moléculas en una sola de las cuatro bases nitrogenadas. 1. además.1 En una primera etapa. se procede en varias etapas: 2. en el último nucleótido de la cadena. el oligonucleótido iniciador marcado radiactivamente se aparea con el DNA de simple cadena a secuenciar y se inicia la síntesis de la cadena complementaria por parte de la DNA polimerasa. En la secuenciación de un segmento de una molécula de DNA por el método de Maxam y Gilbert. ddGTP o ddTTP). cada uno de los cuales contiene. 2. Con los fragmentos resultantes se realiza una electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. obtenidas por clonado de un segmento producido por digestión con enzimas de restricción o por la técnica de PCR.en la posición 3¶.

como base nitrogenada. que esquematiza la cuba electroforética. . se señalan las posiciones de los fragmentos de DNA de una porción aumentada del gel. 3. La modificación consiste en que cada uno de los dideoxirribonucleótidos (ddNTP) está unido a un fluorocromo distinto que va a excitarse con la luz emitiendo luz de un color determinado. Luego de la corrida electroforética. los productos de reacción son sembrados en la parte superior de un gel.ADN RECOMBINANTE 2. que se ubica en la primera posición en la calle correspondiente a la guanina indica que el primer nucleótido de la secuencia contiene. se realiza la autorradiografía del gel que permite leer la secuencia complementaria del DNA original. si el fragmento de un solo nucleótido. una guanina. en ³calles´ separadas. En este caso los fragmentos generados a partir del cebador se van a diferenciar porque el ddNTP terminal va a emitir un color característico que se capta en el aparato.13 - . En el recuadro que se encuentra a la izquierda de la fotografía del gel. Las posiciones de los fragmentos de DNA permiten leer la secuencia de nucleótidos incógnita de la siguiente manera: por ejemplo. Método automático Se trata de una modificación del método automático de Sanger que ha permitido secuenciar de manera más rápida y reproducible fragmentos de ADN de hasta 500pb.2 En una segunda etapa.

el láser detecta la fluorescencia emitida por cada cadena sencilla de ADN fluorescente y traduce esta emisión de fluorescencia en la secuencia correspondiente. genética. virología. leyendo orden de 450 nucleótidos en el plazo de una hora en lugar de las 2-4 horas que se necesitan en un gel En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación. en sí misma. una ciencia. A una altura determinada del capilar. Las principales ventajas de estos equipos son la automatización completa de todo el proceso. y la rapidez en el análisis de cada muestra. BIOTECNOLOGÍA La biotecnología no es. ingeniería. medicina y veterinaria entre otras).ADN RECOMBINANTE Los equipos funcionan de forma completamente automática. Las muestras se colocan en pocillos para ser inyectadas automáticamente a un capilar previamente cargado con un polímero que funciona como lo hace el gel desnaturalizante de acrilamida. bioquímica. . Hay muchas definiciones para describir la biotecnología.14 - . es un enfoque multidisciplinario que involucra varias disciplinas y ciencias (biología. En términos generales biotecnología es el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de valor para el hombre. el capilar se vacía rellenándose nuevamente con polímero fresco y nueva muestra y así sucesivamente. agronomía. Una vez desarrollada la electroforesis de la primera muestra. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia. inyectando las muestras que se preparan exactamente igual que para la secuenciación en geles de acrilamida. química.

portadores de genes específicos. control biológico). una proteína pequeña de sólo 14 aminoácidos que podía ser detectada en cantidades muy pequeñas. que son introducidos en células bacterianas. largamente establecidas y ampliamente conocidas y utilizadas (e. Las técnicas de DNA recombinante permiten la construcción de vectores. las cuales sintetizan las proteínas codificadas por los genes.. fermentación de alimentos.g. capaces de reconocer y cortar el ADN en puntos determinados. unión de este a un ADN vector. Otro es el gen para la somatotropina u hormona de crecimiento.ADN RECOMBINANTE La biotecnología consiste en un gradiente de tecnologías que van desde las técnicas de la biotecnología "tradicional". Los plásmidos utilizados para la expresión de proteínas foráneas se conocen con el nombre de vectores de expresión. hasta la biotecnología moderna. basada en la utilización de las nuevas técnicas del DNA recombinante (llamadas de ingeniería genética). El descubrimiento de las enzimas llamadas endonucleasas de restricción. La primera síntesis de una proteína de mamífero en una célula bacteriana fue realizada usando el gen para la hormona somatostatina.15 - . mediante la utilización de las enzimas de restricción. . OBTENCIÓN DEL ADN Comprende las siguientes etapas: obtención del inserto de ADN que interese. fue la pista que orientó hacia el momento en que se podían recombinar los genes en el laboratorio. se ha logrado introducir en células bacterianas genes para otras proteínas útiles en medicina. Más recientemente. los anticuerpos monoclonales y los nuevos métodos de cultivo de células y tejidos. y la transformación en una célula procariota o eucariota. que han funcionado correctamente para la síntesis de las proteínas codificadas. Un ejemplo es el gen para la insulina humana. que se utiliza para tratar cierta forma de enanismo en los niños.

pero simultáneamente en el tiempo. El ADN vector es el vehículo de clonaje. Se pueden unir genes extraños a los plásmidos con mucha facilidad. Los extremos escalonados del ADN1 y el ADN2 son complementarios. con su gen pasajero. cada uno de los cuales procede de una especie diferente podemos utilizar dichas enzimas como herramientas. se mezcla con la cubierta del virus lambda.16 - . se producen partículas fágicas infecciosas. Cada ADN se trata con una endonucleasa de restricción que origina en este caso un corte escalonado en las dos hebras dobles de ADN. que puede adicionar muchos residuos de desoxirribonucleótidos sucesivos al extremo 3 de las hebras del ADN. Otra enzima clave para unir ADNs es la transferencia terminal. con uniones no covalentes. Es otro vector que puede ser utilizado para introducir genes en bacterias. con lo cual. si el tamaño del ADN recombinado no es muy distinto del ADN natural del virus lambda. se forman los enlaces covalentes por el ADN ligasa (forma B). y después ser transportados como pasajeros al interior de las células de E. transcriben y traducen independientemente de los genes del cromóforo bacteriano.ADN RECOMBINANTE Si se quieren unir dos ADNs. una condición que tiene que tener los dos ADNs que se quiere unir es que tengan un pequeño fragmento igualen sus secuencias. Sus extremos cohesivos se aparearán dando lugar a un nuevo ADN recombinado. permitirán que los dos ADNs se unan por complementariedad. ADN del fago lambda. ya que transporta el inserto de ADN a una molécula hospedadora. donde pueden ser replicados. Posteriormente. Las uniones covalentes se consiguen añadiendo ADN ligasa y una fuente energética para formar los enlaces (forma A). que se encuentran en el citoplasma de la mayoría de las bacterias. Plásmidos Estos son pequeños ADNs de cadena doble y circular. Los procesos de clonaje y de aislamiento de estos fragmentos se inician con la construcción de una biblioteca de ADN o un banco de ADN. Los dos DNAs así cortados se mezclan. Cuando el ADN recombinado del fago lambda. se calientan y sé enfrían suavemente. Éstas están formadas por todas las . coli. Los vectores o transportadores más utilizados son los plásmidos y el ADN del fago lambda. De este modo pueden construirse colas de poli G (nucleótico de guanina) en los extremos 3 de las dos hebras de ADN dúplex y colas de poli C (nucleótico de citosina) en los extremos del otro ADN. Cada plásmido contiene varios genes que se replican. Como estas colas son complementarias.

y es llevada a cabo activando o reprimiendo la expresión de ciertos genes. un mismo tipo celular puede producir variantes de las proteínas que sintetiza en distintas etapas del desarrollo del organismo.17 - . en respuesta a cambios en los nutrientes en el ambiente. Un organismo multicelular usualmente inicia su vida en forma de huevo fecundado. GENÉTICA MOLECULAR DE LOS EUCARIOTAS ± EXPRESIÓN GÉNICA Con la ayuda creciente de las herramientas de la tecnología del DNA recombinante. se fue ampliando. progresaron los estudios de genética molecular de los eucariotas y la distancia entre los eucariotas y los procariotas. Las investigaciones realizadas sobre estos organismos a nivel molecular develaron también muchas diferencias importantes entre el genoma de los eucariotas y de los procariotas. El cigoto se divide repetidamente produciendo muchas células que se diferencian y cada tipo celular comienza a producir proteínas característicamente diferentes que lo distinguen de otros tipos de células. toda la información genética originalmente presente en el cigoto también está presente en cada célula diploide del organismo. el cromosoma eucariótico difiere en muchos aspectos del cromosoma procariótico. el cigoto. En primer lugar. es muy diferente. Resulta claro que la diferenciación de las . Sin embargo. La regulación génica en los eucariotas. en vez de disminuir. A su vez.ADN RECOMBINANTE moléculas de plásmidos o fagos recombinantes originados al unir un ADN a un vector. especialmente en los multicelulares. La regulación de la expresión génica en los procariotas está relacionada fundamentalmente con el ajuste fino de la maquinaria metabólica de la célula. Las bibliotecas deben cumplir la característica de poder introducirse en células donde cada recombinante pueda aplicarse in vivo.

La expresión de los genes puede ser regulada en distintas etapas del camino que conduce desde el DNA a las proteínas. es decir. El mayor anhelo relativo a las aplicaciones basadas en la tecnología del DNA recombinante es que en algún tiempo futuro sea posible corregir defectos genéticos sustituyendo genes ³malos´ ³por genes´ ³buenos´. invadiendo y destruyendo otros tejidos. y luego expresado. Esta es una tarea enormemente compleja. Estos incluyen tanto virus con genoma de DNA como retrovirus con genoma de RNA. incorporado a un cromosoma. deleciones y adiciones. controles del gen normal. genes extraños han sido incorporados y expresados en el nuevo hospedador. Se han desarrollado técnicas que permiten la transferencia de genes a células eucarióticas. En estos casos se produce el cáncer. En consecuencia.ADN RECOMBINANTE células de un organismo multicelular depende de la inactivación de ciertos grupos de genes y de la activación de otros. de una regulación de la expresión. Más aun. los clones. todos los virus conocidos causantes de cáncer son virus que introducen información en los cromosomas de las células hospedadoras. Las células se hacen crecer en cultivo en tubos de ensayo y se transfieren a óvulos fecundados de ratón y de otras especies de mamíferos y a embriones de Drosophila. pero esto es sólo el comienzo. y todavía grandemente desconocidos. CROMOSOMA EUCARIÓTICO . En los últimos años también se desarrollaron técnicas que permiten obtener copias idénticas de organismos. Los virus pueden provocar cambios en la constitución genética de la célula y algunos pueden causar cáncer. El descubrimiento del papel de la transcriptasa inversa forjó el eslabón crucial entre los retrovirus y los cromosomas de las células eucarióticas. El análisis del cromosoma eucariótico ha revelado que éste también está sujeto a reordenamientos. En ocasiones.18 - . El nuevo gen debe establecerse en un gran número de células del tipo apropiado y quedar sujeto a los complicados. como en el caso de los procariotas. Hay varias evidencias que han relacionado el desarrollo del cáncer con cambios en el material genético. En cada uno de estos casos. las células se multiplican sin control. amontonándose. las células escapan a los factores que regulan el crecimiento celular normal. Requiere primero la preparación de un gen que será captado por una célula eucariótica. Las investigaciones en eucariotas han demostrado que. el genoma eucariótico contiene un sorprendente arreglo de elementos genéticos móviles.

en principio. para formar nucleosomas. El centro de cada nucleosoma está compuesto por alrededor de 140 pares de bases de DNA y un conjunto de ocho moléculas de histona. El DNA puede tomar in vitro la forma de B-DNA (la hélice dextrógira descrita por Watson y Crick). La mayoría de estas proteínas son histonas. con distintas funciones biológicas. en la síntesis de las cadenas complementarias. Los nucleótidos en la forma de trifosfatos se acoplan a lo largo de una cadena molde de DNA en la forma semiconservativa. Como en los procariotas. que constituyen más de la mitad del peso del cromosoma. A-DNA (una hélice dextrógira menos fuertemente enrollada) o Z-DNA (una hélice levógira). Los nucleosomas se empaquetan unos sobre otros formando una estructura más condensada ±la fibra de 30 nanómetros± que se encuentra tanto en la cromatina en la etapa de interfase como en los cromosomas que entran en mitosis. La distancia entre los nucleosomas es entre 10 y 11 nanómetros y el diámetro de cada cuenta es aproximadamente de 7 nanómetros. La replicación del DNA en los eucariotas es igual. La molécula de DNA se envuelve alrededor de núcleos formados por ocho moléculas de histonas. Las distintas formas del DNA podrían coexistir in vivo. las DNA polimerasas operan solamente en una .ADN RECOMBINANTE El DNA eucariótico siempre está asociado con proteínas. moléculas relativamente pequeñas con carga positiva. a la replicación del DNA de los procariotas. La cadena que une los núcleos de los nucleosomas contiene otros 30 ó 60 pares de bases. las unidades de empaquetamiento básico del DNA de los eucariotas.19 - .

Durante el desarrollo embrionario. En un organismo multicelular. Si bien en los procariotas también se da una regulación a este nivel. comparativamente pequeño. Las histonas ensambladas en los nucleosomas raramente se separan del DNA. se cuentan las secuencias denominadas enhancers. En el cromosoma procariótico circular. LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN LOS EUCARIOTAS METILACIÓN Los biólogos están comenzando a comprender algunos aspectos de la regulación de la expresión génica en eucariotas. la replicación comienza en un único origen y procede bidireccionalmente a lo largo de dos horquillas de replicación. a medida que la horquilla de replicación avanza debe. Muchas evidencias indican que el grado de condensación del DNA del cromosoma. llamadas factores generales de transcripción. de alguna manera. la RNA polimerasa requiere que un grupo de proteínas. que luego se unen por la acción de la enzima DNA ligasa. se hace cada vez más claro que este nivel de control de la transcripción es mucho más complejo en los eucariotas. Entre estas secuencias regulatorias. Se cree que cada nucleosoma se desenrolla transitoriamente. La tinción revela dos tipos de . algunas de las cuales tienden a activar el gen y otras a desactivarlo. que se observa mediante la tinción de la cromatina. permitiendo que la DNA polimerasa copie el DNA nucleosomal desenrollado. un gen parece responder a la suma de muchas proteínas regulatorias diferentes. Para poder iniciar la transcripción. desempeña un papel principal en la regulación de la expresión génica en las células eucarióticas. El DNA recién sintetizado hereda parte de las viejas histonas pero requiere también de nuevas histonas para empaquetarse y formar la cromatina. en los multicelulares. pasar a través de los nucleosomas parentales. En cuanto se sintetiza.ADN RECOMBINANTE dirección¶¶. la cadena complementaria a la otra hebra madre ¶¶se sintetiza como una serie de fragmentos de Okazaki. Esto permite la unión de la RNA polimerasa y la posterior transcripción. Una variedad de proteínas reguladoras específicas desempeñan papeles centrales en la regulación de la expresión génica. Los sitios en los cuales se unen esas proteínas regulatorias pueden estar a centenares o miles de pares de bases de distancia de la secuencia promotora en la que se une la RNA polimerasa. a las que se unen las proteínas que activan la transcripción. el DNA eucariótico forma los nucleosomas y se asocia también con otras proteínas compactándose en los niveles superiores de condensación. en particular. se ensamblen en la región promotora del gen que se va a transcribir.20 - . por lo tanto. diferentes grupos de genes se activan o inactivan en diferentes tipos de células.

localizada en la región del centrómero del cromosoma. coli. Un ejemplo es la cromatina altamente condensada. Además. pero la eucromatina se vuelve más laxa. por el contrario. la impronta genómica. Durante la interfase. desempeña un papel estructural en el movimiento de los cromosomas durante la mitosis y la meiosis. o por lo menos de DNA cuyas funciones son desconocidas. con algunas pocas excepciones.21 - . Otro factor que está involucrado en la regulación génica es la metilación de las bases nitrogenadas citosinas. la heterocromatina permanece condensada. En tercer lugar. cuando la eucromatina está laxa. o hasta millones de veces. Esta región. pero las variaciones entre las diferentes especies son enormes. En primer lugar. En E. que no codifica para proteínas. en cada célula eucariótica parece haber un gran exceso de DNA. virtualmente todo el DNA se expresa. La metilación diferencial de ciertos genes en ambos sexos. la proporción de heterocromatina aumenta respecto de la de eucromatina a medida que la célula se vuelve más especializada. Este tipo de heterocromatina se denomina heterocromatina constitutiva. varían de un tipo de célula a otro dentro del mismo organismo. excepto por las secuencias reguladoras o secuencias señal. En segundo lugar. La transcripción del DNA a RNA ocurre solamente durante la interfase. en una misma especie. los individuos tienen la misma cantidad de DNA en cada una de sus células diploides (lo cual no es sorprendente). desempeña un papel en el desarrollo temprano del embrión. Por contraste en los procariotas y más aún en los virus. que ocurre después de la replicación. cuando las células se diferencian durante el desarrollo embrionario. METILACION GENOMA EUCARIÓTICO El examen del DNA de las células eucarióticas reveló cuatro sorpresas principales. esta cifra puede disminuir hasta el 1%. Se estima que en las células eucarióticas menos del 10% de todo el DNA codifica para proteínas. reflejando la biosíntesis de diferentes proteínas por diferentes tipos de células. casi la mitad del DNA de la célula eucariótica consiste en secuencias de nucleótidos que se repiten centenas. Algunas regiones heterocromáticas son constantes de célula a célula y nunca se expresan. que ocurre durante la gametogénesis.ADN RECOMBINANTE cromatina: la eucromatina y la heterocromatina. cada molécula de DNA cromosómico contiene típicamente sólo una . Esto fue un descubrimiento particularmente sorprendente. en los seres humanos. Otras regiones de cromatina condensada. que ha sido por largo tiempo el modelo para los genetistas moleculares.

y tal vez la más inesperada de todas. Las secuencias no codificadoras que producen interrupciones dentro de un gen se conocen como secuencias interpuestas o intrones. sino que están interrumpidas por secuencias no codificadoras. fue que las secuencias de genes eucarióticos que codifican para proteínas habitualmente no son continuas. Se cree que las familias génicas tienen sus orígenes en duplicaciones génicas que ocurrieron como resultado de ³errores´ de recombinación. Además. dispuestas característicamente en tándem. El DNA de repetición intermedia incluye múltiples copias de los genes que codifican para los RNA ribosómico. estas secuencias de DNA se conocen como pseudogenes. Las repeticiones múltiples de secuencias de nucleótidos cortas. el DNA de copia única. no están presentes en el mRNA en el citoplasma y. La cuarta sorpresa. no en una multitud de copias. supuestamente a raíz de mutaciones deletéreas. este hallazgo fue sorprendente porque. se conocen como DNA de secuencia simple. de acuerdo con la genética mendeliana.22 - . pero también existe en pequeña cantidad en las mitocondrias y . constituye hasta el 70% del DNA cromosómico en los seres humanos y dentro de esta fracción se encuentra el DNA que codifica para la mayor parte de las proteínas. Algunos miembros de las familias génicas no se expresan. como los que codifican para las cadenas polipeptídicas de las moléculas de hemoglobina. un gen está presente solamente dos veces por cada célula eucariótica diploide. RNA de transferencia e histonas. Aunque los intrones se transcriben a RNA en el núcleo. Los genes individuales de la familia difieren ligeramente en sus secuencias de nucleótidos. Los datos actuales indican que sólo un 1% del genoma humano puede traducirse a proteína. La tercera clase. las proteínas que ellos codifican difieren ligeramente en estructura y en propiedades biológicas. se conocen como DNA de repetición intermedia.ADN RECOMBINANTE copia de cualquier gen dado. no se traducen a proteínas. son llamadas exones. aquellas que se expresan. seguidos por diferentes mutaciones en diferentes copias del gen. habitualmente dispersas en el cromosoma. Los exones son los segmentos que están presentes en el mRNA citoplásmico y que se traducen a proteína. Algunos genes estructurales. así. y las secuencias codificadoras. las principales excepciones son los genes que codifican los RNA ribosómicos. El DNA de secuencia simple está asociado con la heterocromatina fuertemente condensada en la región del centrómero. Las repeticiones más largas. CLASES ADN El ADN es por lo común el constituyente básico de la cromatina (cromosoma) nuclear en las células eucarióticas. en consecuencia. Los estudios de hibridación y secuenciación han mostrado tres clases de DNA eucariótico. forman familias génicas.

Este ADN tiene la particularidad de presentar zonas metiladas por lo cual no puede ser transcrito a ARN mensajero. a diferencia de los exones que . y las proporciones serían las mismas en otras especies.  ADN repetitivo(20 %)son unidades de aproximadamente 300 pares de nucleótidos* que se repiten en el genoma unas 105 veces(unidades de repetición). Son característicos en cada especie y pueden ser separados por centrifugación. Tiene una estructura molecular más distendida y por lo tanto relativamente "débil" porque la distancia entre las bases y el eje de la hélice es mayor. sólo una pequeña parte del ADN constituye genes (menos del 10 %). Z-ADN: Es de tipo Levógiro. B-ADN: es Dextrogiro también y es la forma más abundante del ADN. Está formado no por 1 par de bases como unidad sino por 2 pares de bases. Existen diferentes tipos que los podemos dividiren:  ADN de copia única(el 57 % del total) formados por segmentos de aproximadamente 1000 pares de nucleótidos del longitud. Por cada vuelta de la hélice hay 11pb. Acorde a lasevidencias. Es la estructura más estable de las 3. y se cree se forma durante la transcripsion.  ADN satélite(altamente repetitivo: 28 %)son unidades cortas de pares de nucleótidos que se repiten en el genomio. Por cada vuelta de la hélice hay 10pb. Las bases nitrogenadas se colocan casi exactamente perpendiculares al eje de la doble cadena (eje azúcar ± fosfato). A-ADN: es ADN de tipo Dextrogiro (la hélice está enrollada hacia la derecha). En los procariontes forma el nucloide (que a diferencia de los eucariontes no va asociado a proteínas. INTRONES Unaregión del ADN que debe ser eliminada del transcrito primario de ARN es un intrónpor el hecho que son segmentos no codificados. Los porcentajes indicados son del hombre y el ratón. Constituyen la heterocromatina y no se le conoce función. es desnudo) y en los virus (DNA virus) que lo poseen constituyen el virión o elemento infestante. una pequeña parte de este ADN contiene los genes. Al parecer se presenta cuando intracelularmente no hay agua o en muestras de ADN deshidratadas (por ejemplo en las usadas para cristalografía).23 - . Se intercalan con el ADN de copia única. todo eso provoca que la molécula adquiera una forma de zig ± zag.ADN RECOMBINANTE cloroplastos.

ADN RECOMBINANTE son regiones que codifican para una determinada proteína. en lo que constituye un proceso más eficiente que construir los nuevos genes a razón de un nucleótido a la vez. el pez globo. y la mayoría requiere de la ayuda de proteínas que reconocen secuencias específicas en el pre-ARN. Takifugu rubripees. motiva la formación de nuevos genes a partir de sub-unidades estructurales y funcionales de los genes existentes. De acuerdo a esta teoría. especialmente en los ARN mensajeros (ARNm). Esta teoría nos lleva hacia la "hipótesis de barajeo de exones". . mientras que los mamíferos y las angiospermas (plantas con flores) suelen presentar numerosos intrones. El número y longitud de los intrones varía enormemente entre especies. La denominada "teoría exótica de los genes" sugiere que los exones son los bloques constructores de las proteínas y que los genes se crean a partir de las combinaciones de estos bloques constructores. la estructura intrón-exón de los genes eucarióticos. la primera es la que tiene la respuesta más satisfactoria.24 - . la cual afirma que los intrones incrementan el porcentaje de recombinación de los exones. La segunda pregunta sigue siendo tema de estudio. tiene pocos intrones en su genoma. Existen diferentes métodos de empalme del ARN. así como entre los genes de una misma especie. es un proceso de remoción de intrones). haciendo más fácil moverlos y crear nuevos genes. Por ejemplo. Se sabe que los intrones son removidos del ARN mediante un proceso denominado empalme del ARN. además pueden encontrarse en algunos ARNt y ARNr de procariotas. Existen 3 preguntas que los científicos estan tratando de resolver acerca de los intrones: ¿Cómo se remueven los intrones del ADN? ¿Qué hacen los intrones? ¿Cuál es el origen de los intrones? De estas 3 preguntas. Los Intrones son comunes en todos los tipos de ARN eucariota. el cual es una especie de "edición" del contenido del ARN (es decir. que ocurre dentro del núcleo de una célula.

II y III son intrones que sufren de autosplicing mediante reacciones de transesterificación. Los del grupo II y III se eliminan mediante un proceso auto-catalítico que requiere de una adenina o de un spliceosoma.ADN RECOMBINANTE Ante esta teoría. existen dos teorías comúnmente aceptadas: la teoría de los "intrones tempranos" y la de los "intrones tardíos". entonces ¿por qué sólo aparecen en los organismos eucariotas y no en los procariotas? Respecto a la tercera pregunta. De hecho a veces los intrones del grupo III son identificados como intrones del grupo II debido a su similitud funcional y estructural. spliceosomales o intrones del grupo IV Los intrones del grupo I. se forma una estructura en lazo característica denominada lariat. De acuerdo con la segunda teoría. pero éstos últimos los perdieron durante su proceso evolutivo. estos ancestros no poseían intrones y los eucariotas los obtuvieron durante el proceso evolutivo. durante el proceso de empalme de los exones. Los intrones del grupo II y III son muy similares y presentan una estructura secundaria altamente conservada. Se caracterizan por eliminarse mediante un proceso auto-catalítico que requiere de una guanosina o un nucleótido de guanosina libre. los ancestros de los eucariotas y los procariotas poseían intrones.25 - . aunque pueden tenerlas en su interior. Los del grupo IV están presentes en los ARNt de los eucariotas y se caracterizan por ser los únicos que se eliminan mediante un corte endonucleótido seguido de un ligamiento en lugar de la reacción de transesterificación . En ambos grupos. Según la primera. Actualmente se reconocen cuatro clases de intrones: Intrones del grupo I Intrones del grupo II Intrones del grupo III Intrones nucleares. así como por carecer de secuencias consenso en los puntos de empalme. respectivamente. la pregunta que resulta más obvia es: si los intrones son útiles para la recombinación. Los intrones del grupo I están presentes en los genes de ARNr de algunos eucariotas inferiores y en los genes mitocondriales de hongos. La frecuencia con la que encontramos estos intrones en el genoma es relativamente rara si la comparamos con la frecuencia de los intrones spliceosomales.

tanto en la secuencia codificante como en los intrones y las 3' y 5' UTR (untranslated terminal region: región no traducida terminal. además. Parece que. por lo que probablemente modulen la unión a ese elemento. sobre todo. Expansión de trinucleótidos: En ciertos genes hay repeticiones de un trinucleótido entre 10 y 100 veces. se han encontrado elementos conocidos de regulación solapando con ellas (cajas).ADN RECOMBINANTE REPETICIONES Y NO REPETICIONES ADN repetido. ADN telomérico: Consta de secuencias altamente repetidas (cientos de veces) de 4 a 8 nt. que sintetiza ADN independientemente de molde. La enzima que añade este polinucleótido (diferente para cada especie) es la telomerasa.26 - . Repeticiones de CA en el ADN centromérico. Las repeticiones suelen ser de decenas. hacen suponer una misión reguladora a estas secuencias. con un patrón de distribución del dinucleótido característico. antes del promotor. que abundan en el ADN espaciador entre genes. hay dos presentes en todos los ARNm y que se encuentran antes y después de los codones y y y y . que no se da en otras partes del genoma. De hecho. Agrupaciones de AT y de CA. y Islas CG: Se encuentran aproximadamente 1 Kpb a 5' de muchos genes. ayuda a estabilizar los cromosomas y evitar su degradación por esos extremos. pero también parece limitar el número de potenciales divisiones celulares. Tanto la rareza como esta especial distribución y concentración. Favorecen la replicación del ADN en el extremo lineal del cromosoma.

y la enfermedad se desarrolla cuando se sobrepasa cualquiera de los dos límites. Se sabe que estos elementos son capaces de incluirse en otro sitio del genoma porque se han detectado casos de mutaciones en las que un exón quedaba interrumpido por una de estas secuencias que antes no estaba ahí. Lo que es evidente es que juegan un papel importante en la construcción de genomas y que. LINE (secuencias largas dispersas entre genes): Son secuencias de unos 7000 pb que se encuentran flanqueando genes. respectivamente. porque la proteína pierde su función.27 - . posee entre 10 y 30 repeticiones del trinucleótido CAG cuando es funcional. cada una con 300 pb y distribuidas en 500000 copias. presentes en un muy elevado número de copias. cuando no parecen tener ninguna función. lo han hecho a lo largo de la evolución generando una gran variabilidad. la huntingtina. pero en cualquier caso no se sabe qué son ni porqué permanecen en el genoma. No se conoce el mecanismo de replicación de estas secuencias. Este fenómeno se conoce muy bien en la enfermedad de la corea de Huntington. en la que el gen que codifica para la proteína responsable. Estructura de ADN en cuádruplex formada por repeticiones Repeticiones de secuencias largas. y la gravedad es proporcional al número de repeticiones de más.ADN RECOMBINANTE de inicio y terminación. y SINE (secuencias cortas dispersas entre genes): Son secuencias de unos cientos de pb. con las secuencias de adhesión y disociación del ribosoma y con implicaciones en la expresión génica). traducirse (no se sabe si con un promotor propio o con otro cercano) para después retro-transcribirse (como los retrovirus. probablemente. pero se supone que deben. Las que mejor se conocen son las de la familia Alu. Por su tamaño forman parte del ADN y . posibles implicaciones evolutivas) en ADNds y posteriormente incluirse al azar en el genoma. en algún momento. Se dice entonces que la mutación es knockin (mutación por inclusión de material genético).

y los genes que las constituyen distan unos pocos Kpb unos de otros. denominados LCR (locus controlling regions: regiones controladoras del locus).28 - . Este gen nunca transcrito se llama pseudogén. es parte activa en procesos de recombinación genética porque su secuencia es altamente homóloga con la de los genes funcionales de su alrededor. durante la evolución de una copia de un gen determinado. diversificación y evolución independiente. poseen un parentesco evolutivo que es consistente con un proceso de copia. por lo que se selecciona negativamente y se inactiva permanentemente. como es el caso de la mayoría de las talasemias que conciernen al locus de la hemoglobina. pero no se sabe cómo actúan. A pesar de que es un gen inútil. la de las hemoglobinas. a veces. sobre él pueden desarrollarse fenómenos de mutación al azar que deriven en un gen funcional y reviertan la inactivación o. . a corto plazo.ADN RECOMBINANTE moderadamente repetido. porque tiene todos los elementos necesarios para poder llegar a sintetizarse. También tiene importantes implicaciones evolutivas. se conoce desde hace mucho tiempo que familias génicas como. posee una regulación conjunta de todos los genes durante el desarrollo. de modo que se puede considerar la existencia de un elemento de regulación de la familia entera. excepto alguno esencial (el promotor. por ejemplo. actúan de manera totalmente independiente. Sin embargo. ya que alguna vez la recombinación puede no ser homóloga y provocar. la unión o separación de cromosomas. sin llegar a ser alelos (variantes de un mismo gen) porque codifican para productos distintos. cada uno con sus propios elementos de regulación que. Se han descubierto elementos de ese tipo a 5' del locus de la hemoglobina. el producto no es funcional. aun constando de proteínas independientes. Se cree que favorecen la recombinación y el sobrecruzamiento. FAMILIAS GENÉTICAS -TRANSCRIPCIÓN Y PROCESAMIENTO DE ARN EN EUCARIOTES Una familia génica es un conjunto de genes con un alto grado de homología que. sobre todo porque controlan la expresión de genes que están a Mpb de distancia. Muchas veces. Generalmente las familias génicas se encuentran agrupadas.). pero son independientes. etc. por ejemplo. Es importante no confundirlo con ADN repetido. o impide el buen funcionamiento en uno u otro sentido. Este hecho permite la aparición de mutantes híbridos. por lo que su principal misión sería favorecer la diversificación genética. el codón de iniciación.

29 - . La función de esta "cola" de poli A no se conoce. Una para el mARN. mientras que en eucariotas tenemos dos procesos separados en tiempo y localización (recordar la existencia de una envoltura nuclear). Se le agrega 7-metilguanina (una base inusual) al extremo 5' del mARN.ADN RECOMBINANTE Los ARNr son un ejemplo de familia génica. Si bien los procariotas tienen un solo tipo de ARN polimerasa para todos los tipos de ARN. existen sin embargo algunas diferencias. pero puede usarse para capturar mARN para estudios. Una ristra de adeninas (tanto como 200 nucleótidos conocido como poli-A) se agrega al extremo 3' del mARN luego de la transcripción. y esto resulta esencial para el pegado del mARN al ribosoma. Luego que en el núcleo de la célula eucariota se transcribe un ARN. claro. los eucariotas tienen una para cada tipo. Los genes eucariotas no se agrupan en operones como los de los procariotas. pero en todas es el mismo. el ARN transcripto es extensamente modificado antes de ser exportado al citoplasma. Cada gen eucariota se transcribe separadamente. una para los rARN largos y una tercera para los rARN cortos y los tARN. no por las posibles analogías entre cada uno de ellos. Existen muchos ejemplos de mensajes idénticos procesados por diferentes métodos (ver El ACTH y su . En el humano son unas 200 copias repartidas en cinco cromosomas. Transcripción El proceso de transcripción en los eucariotas es similar a los de los procariota. Los intrones se cortan y los exones se colocan juntos antes que el mARN deje el núcleo. Cada una de estas copias tiene su propio promotor. con un control transcripcional independiente para cada gen. En procariotas la traducción comienza inclusive antes que la transcripción haya terminado. sino en que en una célula eucariota suele haber cientos de repeticiones en tándem del conjunto de genes que los codifican.

Moléculas de proteínas se pegan al mARN y luego se exportan del núcleo formando partículas llamadas ribonucleoproteínas (mRNPs) que parecen ayudar en el transporte por los poros nucleares y también en el pegado a los ribosomas. al contrario que el ADN que es bicatenario. ya que estas no poseen intrones en su ADN. El proceso de retirada de los intrones y . que se añade al extremo 5' de la cadena del ARNm transcrito primario (ubicado aún en el núcleo celular) mediante un enlace 5'-fosfato 5'1 fosfato en lugar del habitual enlace 3'. que en la mayoría de los casos no se libera del complejo de transcripción en forma totalmente activa. 2. Todos los ARNm eucarióticos son monocistrónicos.ADN RECOMBINANTE familia de péptidos). Esta cola protege al ARNm frente a la degradación. Esto no ocurre en células procariontes. es decir. no codificantes. un tramo de RNA cuyas bases son todas adenina. es decir.30 - . es decir. aumentando su vida media en el citosol. la 7metilguanosina. En la mayoría de los casos. contienen información para una sola cadena polipeptídica. Poliadenilación: es la adición al extremo 3' de una cola poli-A. mientras que en los procariotas los ARNm son con frecuencia policistrónicos. situada unos 20-30 nucleótidos antes del extremo 3' original. El ARN mensajero es un ácido nucleico monocatenario. el ARN mensajero sufre la eliminación de secuencias internas. determina el orden en que se unirán los aminoácidos. Su adición está mediada por una secuencia o señal de poliadenilación (AAUAAA). Entre esas modificaciones se encuentran la eliminación de fragmentos (splicing). 3. una secuencia larga de poliadenilato. el procesamiento del ARN en eucariotas comprende diferentes fases: 1. sino que ha de sufrir modificaciones antes de ejercer su función (procesamiento o maduración del ARN). es decir. de modo que se puede sintetizar mayor cantidad de proteína. codifican más de una proteína.5'-fosfodiéster. su nombre en inglés) que es un nucleótido modificado de guanina. El ARN mensajero (ARNm. Esta caperuza es necesaria para el proceso normal de traducción del ARN y para mantener su estabilidad. esto es crítico para el reconocimiento y el acceso apropiado del ribosoma. llamadas intrones. Procesamiento de ARN El ARN mensajero obtenido después de la transcripción se conoce como transcrito primario o ARN precursor (pre-ARN). o mRNA de su nombre en inglés) es el ácido ribonucleico que contiene la información genética procedente del ADN para utilizarse en la síntesis de proteínas. la adición de otros no codificados en el ADN y la modificación covalente de ciertas bases nitrogenadas. Adición al extremo 5' de la estructura denominada caperuza o casquete (o CAP. a veces los intrones se tornan exones y viceversa. Concretamente.

31 - . porque en las células procariotas no hay un núcleo definido.ADN RECOMBINANTE conexión o empalme de los exones se llama ayuste. generalmente con la ayuda de ribonucleasas. A veces un mismo transcrito primario o pre-ARNm se puede ayustar de diversas maneras. a este fenómeno se le llama ayuste alternativo. la unión de los ribosomas ocurre mientras la cadena de ARNm está siendo sintetizada. que son la maquinaria encargada de la síntesis proteica. Ciertas enzimas parecen estar involucrados en editar el RNA antes de su exportación fuera del núcleo. ni se le quitan intrones. estos dos organelos tienen su propia información genética y se replican de manera independiente del DNA nuclear. a través de poros de la membrana nuclear. El proceso de transcripción y el de traducción se realizan de manera similar que en las células eucariotas. intercambiando o eliminando nucleótidos erróneos. Una vez en el citoplasma. por lo cual su DNA presenta muchas mutaciones. Después de cierta cantidad de tiempo el ARNm se degrada en sus nucleótidos componentes. splicing). por lo tanto. no se le añade caperuza ni cola. . En procariontes. 6. 4. el ARN mensajero no pasa por un proceso de maduración y. o corte y empalme (en inglés. La diferencia fundamental está en que. Aquí ocurren diversas reacciones de fosforilación oxidativa. ADN DE LOS ORGANELOS ENERGÉTICOS Existen dentro de la célula dos organelos que aportan energía la mitocondria y el cloroplasto. el ARNm se acoplan los ribosomas. permitiendo que con un solo gen se obtengan varias proteínas diferentes. en el caso de los seres eucariontes. en las procariotas. 5. El ARN mensajero maduro es trasladado al citosol de la célula. Además no tiene que salir del núcleo como en las eucariotas.

fmedic.uam.ADN RECOMBINANTE El por qué estos dos organelos tienen DNA está basado en una teoría llamada "endosimbiótica" en donde menciona que la mitocondria y el cloroplastos.wikipedia.unam.cobach-elr. se convirtieron en una sola célula.htm Trabajos y Páginas web consultadas http://es.. BIBLIOGRAFÍA Molecular CellBiologyfiftheditionLodish BiologíaCelulardelosMicroorganismos-Brock 10ma Edición Biología de Curtis H.org/wiki/ADN_recombinante http://www.es/personal_pdi/ciencias/bolarios/BiologiaCCAA/resumenes/tema14. Al crearse ese vínculo fuerte.com/academias/quimicas/biologia/biologia/curtis/inicio. ya no pudieron dejar de ser diferentes organismos y al evolucionar.mx/~evazquez/0403/dna%20recombinante. Las células eucariotes primitivas no eran capaces de fotosintetizar (cloroplastos) o de realizar fosforilizaciones (mitocondria).32 - . N. haciendo que unos dependieran de otro.html . y 6ta edición versión online http://www. así que estos tres organismos comenzaron a convivir. Sue Barnes 5ta. eran organismos procariotes capaces de realizar dichas funciones antes mencionadas y que aportan a la célula energía.htm http://laguna.

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ADN RECOMBINANTE CUADROS DE RESUMEN I .

ADN RECOMBINANTE II .

ADN RECOMBINANTE III .

ADN RECOMBINANTE IV .

ADN RECOMBINANTE V .

ADN RECOMBINANTE VI .