ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE
Tecnología del estudio de ADN
Permite el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en otro. Entre sus aplicaciones se encuentra la producción de grandes cantidades de la proteína codificada por dicho gen, como por ejemplo proteínas humanas en cantidad suficiente para que puedan ser utilizadas como fármacos. Las proteínas obtenidas por esta técnica se denominan proteínas recombinantes.

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ADN RECOMBINANTE

INDICE
ADN Recombinante ..................................................................... 1 Aislamiento de segmentos específicos de ADN ........................... 2 Vectores ........................................................................................ 4 Enzimas de Restricción ................................................................ 5 Células Huésped ........................................................................... 5 Clonación ± clones ....................................................................... 6 Hibridación de ácidos nucleicos .................................................. 7 - Métodos de laboratorio (hibridación)....................................... 9 --Uso de Sondas radioactivas ....................................................... 10 Secuenciación de ADN ................................................................. 11 -Técnicas de Secuenciación ......................................................... 12 Biotecnología ............................................................................... 15 Obtención de ADN ....................................................................... 16 Genética molecular de los eucariotas ± Expresión Génica ........................................................................................... 17 El cromosoma eucariótico ± la regulación ................................. 19 Regulación de la expresión génica ± metilación ......................... 20 El genoma eucariótico .................................................................. 22 Clases de ADN .............................................................................. 23 Intrones ......................................................................................... 24 Repeticiones y No repeticiones .................................................... 26 Familias genéticas ± transcripción .............................................. 28 Procesamiento de ARNen eucariotas ......................................... 30 ADN de los organelos energéticos. .............................................. 32 Bibliografía ................................................................................... 33 Anexos

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ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE
La tecnología del ADN recombinante permite el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en otro. Entre sus aplicaciones se encuentra la producción de grandes cantidades de la proteína codificada por dicho gen, como por ejemplo proteínas humanas en cantidad suficiente para que puedan ser utilizadas como fármacos. Las proteínas obtenidas por esta técnica se denominan proteínas recombinantes. Antes de la tecnología del ADN recombinante también se utilizaban como medicamentos algunas proteínas, sin embargo la manera de obtenerlas era o bien por síntesis química, o bien mediante el aislamiento de la proteína a partir de su fuente natural (tejido o fluido animal, humano o de plantas). No obstante, ambas técnicas tienen sus limitaciones. La síntesis química debido a su complejidad y elevado coste sólo es aplicable cuando la proteína de interés es muy pequeña. Por su parte, el aislamiento de las proteínas a partir de la fuente natural a menudo se encuentra con el problema de que el rendimiento de la extracción es muy bajo. Por ejemplo hasta hace relativamente poco tiempo la única manera de obtener factores de coagulación para personas hemofílicas era mediante la manipulación de litros de sangre, y era necesario procesar cientos de hipófisis de cadáveres humanos para sacar una pequeña cantidad de hormona del crecimiento, imprescindible para tratar algunos problemas de enanismo. Mediante la aplicación de las técnicas de ADN recombinante es posible solventar estos problemas y obtener proteínas que no se podrían conseguir con los métodos tradicionales. La tecnología de ADN recombinante se desarrolla en tres pasos: el aislamiento del gen de interés, la clonación y expresión de dicho gen, y la producción a gran escala de la proteína codificada por el gen. Cada uno de estos procesos precisa de unas herramientas la mayoría de las cuales son ofrecidas por la propia naturaleza. El aislamiento de un gen no es fácil. Originariamente lo que se hacía era aislar la proteína de la que se quería obtener el gen e intentar determinar por medios químicos la secuencia de aminoácidos que la componían. Este proceso se denomina secuenciación de proteínas y a diferencia de la secuenciación de ADN es técnicamente muy complicado. Si la proteína es suficientemente pequeña puede ser secuenciada en su totalidad y esta información, gracias al código genético, era utilizada para sintetizar químicamente el gen. Para proteínas de tamaño medio o grande lo que se hacía era secuenciar solamente una pequeña parte de la proteína y, utilizando también el código genético, fabricar una cadena de ADN de 15 ó 20 nucleótidos que era complementaria a una de las cadenas del gen o al ARNm correspondiente. Esta corta cadena de nucleótidos se marcaba radiactivamente o por fluorescencia y se utilizaba como sonda para identificar el gen completo o el ARNm completo que llevan la información para sintetizar la proteína de interés. En el caso de que hayamos localizado el ARNm tenemos

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que convertirlo en ADN. Este proceso se hace mediante la enzima llamada transcriptasa inversa. La cadena de ADN obtenida utilizando la información de un ARNm se llama ADN complementario o abreviadamente ADNc. Actualmente gracias a la existencia de genotecas y a la secuencia de muchos genomas, entre ellos el humano, el aislamiento de cualquier gen es una tarea mucho más simple. Los cromosomas, incluso los de las células eucariotas más simples, contienen una enorme cantidad de DNA, por lo que localizar un segmento específico es como tratar de encontrar una aguja en un pajar. Para localizar fragmentos específicos se utiliza la técnica de hibridación de ácidos nucleicos En los comienzos de la investigación del DNA recombinante, los biólogos se dieron cuenta de que los segmentos de DNA que codifican ciertas proteínas (particularmente las de importancia médica o agrícola) pueden transferirse a bacterias y ser expresados por ellos se las usa como ³fábricas´ para suministrar ilimitadamente proteínas. Estofue el inicio de la biotecnología.

AISLAMIENTO DE SEGMENTOS ESPECÍFICOS DE DNA
Una de las formas de obtener los fragmentos específicos de DNA es cortando moléculas de DNA con enzimas de restricción, transcribiendo el mRNA a DNA con la enzima transcriptasa inversa, o por medio de la síntesis de oligonucleótidos en el laboratorio. Las enzimas de restricción se encuentran en la naturaleza en las células bacterianas y en algunos bacteriófagos. Escinden las moléculas de DNA en secuencias de reconocimiento específicas, que típicamente tienen de 4 a 8 nucleótidos de longitud. Su función en las células bacterianas es degradar moléculas de DNA extrañas. El DNA de la bacteria se protege de sus propias enzimas de restricción por la metilación de nucleótidos en las secuencias de reconocimiento. Algunas enzimas de restricción producen cortes de la molécula de DNA que dejan extremos rectos. Otras cortan de manera escalonada, dejando extremos ³pegajosos´ que luego pueden unirse, por apareamiento de bases complementarias, con otros fragmentos producidos por la misma enzima. Esto hace posible combinar segmentos de DNA de

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Las enzimas de restricción generalmente se obtienen de bacterias y su nombre deriva del nombre científico de esas bacterias: HpaI es de Hemophilus parainfluenzae. -3- . si es tratada o digerida con diferentes enzimas de restricción. las dos cadenas complementarias de la secuencia son idénticas. cuando se leen en la misma dirección (por ejemplo 5' a 3'). EcoRI es de E. Una misma molécula de DNA producirá distintos fragmentos. Cuando estos virus infectan una célula hospedadora. Algunas enzimas como EcoRI y HindIII escinden el DNA dando como resultado extremos "pegajosos". como también el RNA viral que será empaquetado en nuevas partículas virales. El gran número de enzimas de restricción y de secuencias de reconocimiento diferentes hace posible que se las utilice para empalmar segmentos de DNA genómico de una variedad ilimitada de fuentes. el mRNA viral. que codifica proteínas virales. o cDNA. la transcriptasa inversa puede utilizarse para sintetizar DNA a partir de un molde de RNA. Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción frecuentemente tienen seis pares de bases de longitud y. En el laboratorio. llamados fragmentos de restricción. segmentos que se conocen como DNA complementario. los retrovirus.ADN RECOMBINANTE fuentes diferentes. la transcriptasa inversa cataliza la síntesis de DNA a partir del molde de RNA viral. Otra herramienta para obtener fragmentos específicos de DNA la transcriptasa inversa que fue aislada de ciertos virus que contienen genoma de RNA. Esta enzima es capaz de sintetizar DNA a partir de un molde de mRNA. se transcribe a partir de este DNA. coli y HindIII es de Hemophilus influenzae. estas secuencias se denominan secuencias palindrómicas.

produciéndose una molécula de cDNA de doble cadena. tanto el nuevo RNA genómico viral como el mRNA para la síntesis de proteínas virales. Esta envoltura puede fusionarse con la membrana celular de un nuevo hospedador. son catalizadas por la enzima transcriptasa inversa. El tamaño de poro de este gel permite separar moléculas cuyo tamaño difiere en un solo nucleótido. VECTORES DE TRANSFERENCIA: PLASMIDOS Los primeros experimentos destinados a conseguir producir proteínas humanas en microorganismos fallaron porque. así como la de degradación de la molécula original del RNA viral. Posteriormente se transcriben. c) Comienza de inmediato la síntesis de la segunda cadena de DNA (complementaria a la primera). sólo una de las hijas recibía copia del gen humano por lo que dicho gen iba diluyéndose. a partir del DNA viral integrado. -4- . por ejemplo. como los geles de agarosa. El cDNA de doble cadena puede integrarse al cromosoma de la célula hospedadora. a pesar de que se conseguía introducir el gen en la célula huésped que debía fabricar la proteína humana. mediante el uso de técnicas de tinción. se utilizan matrices con poros mayores. permitiendo que el virus entre en la célula. Los fragmentos de DNA separados no pueden ser visualizados directamente.ADN RECOMBINANTE a) La cápside de un retrovirus está rodeada típicamente por una envoltura externa de lipoproteína formada por elementos de la membrana celular de su hospedador anterior y por proteínas virales. o bien a medida que la célula se dividía. Para separar fragmentos de DNA menores de 500 nucleótidos se utiliza como matriz un gel de poliacrilamida. ésta en lugar de llevar a cabo este proceso. b) Una vez que el retrovirus ha entrado en la célula. o bien degradaba el gen que se le había introducido. un polisacárido aislado de ciertas algas. Para separar moléculas de DNA de mayor tamaño. Estas reacciones. Estos problemas fueron soslayados cuando se descubrió que se podían emplear unas herramientas que también están en la naturaleza: los plásmidos y los virus. el RNA viral se libera de la cápside y se transcribe a una única cadena de DNA complementaria (cDNA).

se podrán unir debido a la complementariedad de sus bases. los virus son entidades que están especializadas precisamente en insertar su material genético en células y utilizar la maquinaria de éstas para multiplicarse. Un buen organismo huésped debe caracterizarse por: 1. 2. Los plásmidos y virus permiten introducir el gen de interés en la célula huésped. Hacerlo de manera barata. Después. 3. independientemente del genoma de la célula. CÉLULAS HUÉSPED Una vez que el vector presente el gen de interés. ENZIMAS DE RESTRICCION En general para introducir el gen de interés en el genoma de estos vectores se utilizan las enzimas de restricción. Estas enzimas cortan los genomas en unas secuencias específicas. Que sea fácilmente manipulable. gracias a otra enzima denominada ligasa. Por su parte. Esto es. especialmente cepas de Escherichia coli. Poder crecer rápidamente. se transfiere a la célula huésped. Muchos de ellos contienen genes de resistencia a antibióticos. de las demás. y que se caracterizan porque pueden replicarse. y que por consiguiente son capaces de crecer en un medio con el antibiótico. por lo que se denominan moléculas transportadoras o vectores. es decir "reproducirse". Hay tres tipos de células huésped: bacterias. se vuelven a unir las cadenas de los ácidos nucleicos quedando insertado nuestro gen de interés en el lugar del genoma del vector que nos interese. levaduras y ciertas células eucariotas como las líneas celulares derivadas de algún -5- . Cortando el genoma huésped y el gen a insertar con las mismas enzimas los extremos de ambos se vuelven "cohesivos". lo que permite distinguir las células que han incorporado el plásmido.ADN RECOMBINANTE Los plásmidos son moléculas de ADN circular que se encuentran en muchas bacterias y levaduras.

la ventaja es que ambos sistemas pueden llevar a cabo modificaciones como las descritas anteriormente. CLONACIÓN Una vez escogida la célula huésped se pone en contacto con el vector al que se ha incorporado el gen de interés.ADN RECOMBINANTE mamífero. Cada uno de estos tipos celulares tiene sus ventajas e inconvenientes. nutrientes y otras moléculas presentes en el medio de cultivo es una tarea cuya puesta a punto puede ser -6- . Las levaduras y las líneas celulares son más complicadas. Las bacterias se caracterizan porque su material genético es muy simple. Las células hijas fabricarán todas sub-proteínas más la proteína extraña que se le ha introducido. etc. A continuación hay que separar las células que han incorporado el vector del resto. nutrientes. Cuantas más células huésped estén fabricando la proteína de interés. Mediante diferentes técnicas se facilita la entrada del vector en las células. ésta se aísla a partir del medio de cultivo en el que crecen las células o del interior de las propias células dependiendo del tipo de células que se utilizan como sistema de expresión y de cómo se haya diseñado el gene dicha proteína.y se permite que las células crezcan ofreciéndoles las condiciones más favorables de temperatura. Su principal inconveniente es que no llevan a cabo algunas de las modificaciones que sí realizan las células eucariotas en las proteínas. Una de las células modificadas se hace crecer obteniéndose así múltiples células hijas que contienen el gen y que proceden de una única célula inicial. El aislamiento de una proteína a partir de la mezcla de células. humedad. se inocula a un fermentador o a botellas de cultivo. por ejemplo la glicosilación. La síntesis de la proteína deseada por la célula huésped es lo que se conoce como expresión del gen de dicha proteína. mayor cantidad de dicha proteína se podrá obtener. Tras obtener suficiente cantidad de proteína de interés. Este proceso de seleccionar y hacer crecer una única célula se denomina clonación. no crecen tan rápido y suelen ser más difíciles de tratar.en función del tipo de célula huésped. suelen crecer muy rápido y las condiciones de crecimiento son bastante sencillas. Para ello el clon de células huésped que mejor expresa el gen de la proteína de interés se selecciona. especialmente estas últimas. No obstante.

-7- . En biología molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridación: Tipo Southern. El %GC no es igual para todas las especies. que toma la estructura de doble hélice. en una única molécula de doble cadena. G C. el %GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN mitocondrial. debido a las diferentes geometrías de los nucleótidos.ADN RECOMBINANTE compleja y que requiere la aplicación de variadas técnicas bioquímicas de separación como las cromatografías. C G. Por el contrario. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260 nm). la absorción de energía será mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla. que son las que captan la energía. para uniones ADN-ADN y tipo Northern. para uniones ADNARN. el paso siguiente es la formulación de la proteína purificada. ya que en esta última los dobles enlaces de las bases nitrogenadas. El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la solución que contiene a la molécula. según qué tipo vamos a estudiar y esto es importante. dicha energía se traduce en una mayor temperatura. entre otros motivos porque existen enfermedades genéticas debidas a mutaciones en el ADN mitocondrial. están totalmente expuestos a la fuente emisora de energía. Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ± SONDAS RADIOACTIVAS La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos anti-paralelas y con secuencia de bases complementarias. y dado que se requiere más energía para romper tres enlaces que para romper dos. una simple variación de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultará la unión. T=A o U=A Así que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán la una a la otra rápidamente. donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. por tanto. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de desnaturalización ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrógeno. lo que nos da bastante juego en los protocolos de extracción de ADN. que es el proceso por el cual la proteína se preparará en su forma farmacéutica definitiva que será la que le dará la máxima estabilidad y eficacia. En caso de que la proteína recombinante se vaya a utilizar como medicamento. es más. A=U.

Luego del revelado de la película. -8- .ADN RECOMBINANTE a. Las moléculas de doble cadena que se hayan formado permanecen en su lugar en el filtro y su visualización se realiza por medio de autorradiografía. e. Los plásmidos contienen. Algunas bacterias de cada colonia son transferidas (blotting) a un filtro especial obteniéndose una réplica. cada filtro es cubierto con una película fotográfica y dejado en la oscuridad. el radioisótopo libera energía que impacta la emulsión fotográfica. producida por un depósito de plata de la emulsión. Durante el período de exposición. El filtro con el DNA desnaturalizado es incubado en una solución que contiene una sonda radioactiva que consiste en una molécula de DNA o RNA de cadena simple. b. Sólo las bacterias que hayan adquirido el plásmido recombinante crecerán formando colonias aisladas. c. Las bacterias competentes se transforman con plásmidos que contienen distintos fragmentos de DNA obtenidos por digestión de un DNA genómico con una enzima de restricción. La réplica es tratada con una solución de alto pH para romper las células y desnaturalizar el DNA del plásmido. identifican las colonias originales que contenían vectores con el segmento de DNA que se deseaba estudiar. Se permite que la sonda se hibride. la posición del fragmento radioactivo se observa como una marca oscura. Las réplicas de las colonias que estén marcadas con la sonda radiactiva después de este tratamiento. Cada colonia se origina por divisiones sucesivas de una única bacteria inicial y todas las células de una colonia contienen el mismo plásmido recombinante. técnica en la cual primero. Se lava del filtro el exceso de solución que contiene las sondas que no han hibridado. además. Las bacterias transformadas son distribuidas en una placa de Petri con un medio de cultivo sólido que contiene el antibiótico de selección. complementaria al segmento de DNA de interés. un gen de resistencia a un antibiótico que se usará para la selección de las colonias que hayan incorporado el plásmido. El DNA se une químicamente al filtro d.

La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz. se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda. el método northern sirve para identificar ARN. Posteriormente.  Southern El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN. para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué condiciones. El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas. M. el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa.ADN RECOMBINANTE Métodos de Laboratorio Existen dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan frecuentemente en los laboratorios que utilizan técnicas de biología molecular. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida. Southern para la detección de genes específicos en el ADN celular. para el caso de sondas  Northern El segundo método. con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. -9- . durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físicoquímico. tipo northern o northern blot. A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo). en qué tejidos o tipos celulares.

. En la hibridación in situ. junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo northern ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material orgánico. violeta. Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección. con la capacidad de transportar información. se lava el exceso de sonda no unido. de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana. blanco.10 - . técnica de hibridación in situ. un gen que codifica una proteína de membrana de los glóbulos blancos. También en esta categoría destaca el FISH. de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern.ADN RECOMBINANTE  Hibridación in situ (uso de sondas radioactivas) Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su observación al microscopio. verde. El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único. Tras producirse ésta. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. las sondas están marcadas con colorantes fluorescentes. un oncogén en el cromosoma 8. región del cromosoma 21 donde se encuentra el gen responsable del Síndrome de Down. Utilizando técnicas inmuno-histoquímicas se puede conocer la localización precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas. localización en el cromosoma X del gen de la distrofia muscular infantil más común. donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma. amarillo. una secuencia sin determinar en el cromosoma 5. bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que favorezcan la hibridación. SECUENCIACION DE ADN Una secuencia de ADN o secuencia genética es una sucesión de letras representando la estructura primaria de una molécula real o hipotética de ADN o banda. Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir. con la que comparte un alto grado de similitud y que podemos observar con un microscopio electrónico. Cada color indica la localización de una secuencia de DNA diferente: rojo.

las secuencias se presentan pegadas unas a las otras. Técnicas de Secuenciación Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad. sin espacios. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular. que simbolizan las cuatro subunidades de nucleótidos de una banda ADN . los plásmidos. G y T) en un oligonucleótido de ADN. C. plantas y microorganismos. De todas las moléculas muestreadas. C. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología. T. Esas letras representan ambigüedad. En algunos casos especiales.adenina. timina. como la investigación forense. a derecha. citosina. lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano.11 - . en ocasiones fruto de la colaboración de científicos a escala mundial. la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. que son bases covalentemente ligadas a cadenas fosfóricas. Otros proyectos relacionados. yendo de 5' a 3' de izq. y T. las letras seguidas de A. guanina. . como en la secuencia AAAGTCTGAC. Las reglas de laUnión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) son las que siguen:                A = adenina C = citosina G = guanina T = timina R = G A (purina) Y = T C (pirimidina) K = G T (keto) M = A C (amino) S = G C (enlaces fuertes) W = A T (enlaces débiles) B = G T C (todos y A) D = G A T (todos y C) H = A C T (todos y G) V = G C A (todos y T) N = A G C T (cualquiera) La Secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A. y G se presentan en una secuencia. G. han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales. C. Así pues.ADN RECOMBINANTE Las posibles letras son A. En el típico caso. hay más de una clase de nucleótidos en esa posición. así como en campos aplicados. determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales.

el segmento de cadena simple (presente en múltiples copias) se marca radiactivamente en el extremo 5'. cada uno de los cuales contiene. Esta técnica se vale de oligonucleótidos sintéticos y de una DNA polimerasa termoestable. Estos son dideoxinucleótidos que carecen del OH.en la posición 3¶. Combinando la información obtenida con cada reacción. en el que se separan fragmentos que difieren incluso en un nucleótido de longitud. uno de los nucleótidos terminadores (ddATP. . obtenidas por clonado de un segmento producido por digestión con enzimas de restricción o por la técnica de PCR. se procede en varias etapas: 2. En la secuenciación de un segmento de una molécula de DNA por el método de Maxam y Gilbert. no pueden reaccionar con ningún otro nucleótido y se transforman. Con los fragmentos resultantes se realiza una electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. ddGTP o ddTTP). 2. La solución que contiene al DNA marcado se divide en cuatro porciones. La mezcla en la que se producirá la reacción de síntesis se separa en 4 tubos.ADN RECOMBINANTE Se usan tres técnicas principales de secuenciación: una implica métodos enzimáticos y la otra usa métodos químicos y la última es una modificación de la anterior. así. por lo que. 1.1 En una primera etapa.12 - . el oligonucleótido iniciador marcado radiactivamente se aparea con el DNA de simple cadena a secuenciar y se inicia la síntesis de la cadena complementaria por parte de la DNA polimerasa. ddCTP. se puede inferir la secuencia del segmento completo. en el último nucleótido de la cadena. además. La secuenciación depende de la disponibilidad de copias múltiples de un fragmento de DNA. En la secuenciación por el método enzimático. cada una de las cuales se somete a un tratamiento químico diferente para romper las moléculas en una sola de las cuatro bases nitrogenadas. una vez que son agregados a la cadena que se está sintetizando.

se realiza la autorradiografía del gel que permite leer la secuencia complementaria del DNA original. En este caso los fragmentos generados a partir del cebador se van a diferenciar porque el ddNTP terminal va a emitir un color característico que se capta en el aparato. . en ³calles´ separadas. Método automático Se trata de una modificación del método automático de Sanger que ha permitido secuenciar de manera más rápida y reproducible fragmentos de ADN de hasta 500pb. si el fragmento de un solo nucleótido. se señalan las posiciones de los fragmentos de DNA de una porción aumentada del gel.13 - .2 En una segunda etapa. que se ubica en la primera posición en la calle correspondiente a la guanina indica que el primer nucleótido de la secuencia contiene. Luego de la corrida electroforética.ADN RECOMBINANTE 2. En el recuadro que se encuentra a la izquierda de la fotografía del gel. La modificación consiste en que cada uno de los dideoxirribonucleótidos (ddNTP) está unido a un fluorocromo distinto que va a excitarse con la luz emitiendo luz de un color determinado. como base nitrogenada. 3. que esquematiza la cuba electroforética. Las posiciones de los fragmentos de DNA permiten leer la secuencia de nucleótidos incógnita de la siguiente manera: por ejemplo. los productos de reacción son sembrados en la parte superior de un gel. una guanina.

Hay muchas definiciones para describir la biotecnología. Una vez desarrollada la electroforesis de la primera muestra. el láser detecta la fluorescencia emitida por cada cadena sencilla de ADN fluorescente y traduce esta emisión de fluorescencia en la secuencia correspondiente. medicina y veterinaria entre otras).14 - . A una altura determinada del capilar. y la rapidez en el análisis de cada muestra. genética. leyendo orden de 450 nucleótidos en el plazo de una hora en lugar de las 2-4 horas que se necesitan en un gel En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación. Las muestras se colocan en pocillos para ser inyectadas automáticamente a un capilar previamente cargado con un polímero que funciona como lo hace el gel desnaturalizante de acrilamida. Las principales ventajas de estos equipos son la automatización completa de todo el proceso. inyectando las muestras que se preparan exactamente igual que para la secuenciación en geles de acrilamida. una ciencia. En términos generales biotecnología es el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de valor para el hombre. ingeniería. el capilar se vacía rellenándose nuevamente con polímero fresco y nueva muestra y así sucesivamente. BIOTECNOLOGÍA La biotecnología no es. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia. virología. . bioquímica. es un enfoque multidisciplinario que involucra varias disciplinas y ciencias (biología. agronomía. en sí misma. química.ADN RECOMBINANTE Los equipos funcionan de forma completamente automática.

La primera síntesis de una proteína de mamífero en una célula bacteriana fue realizada usando el gen para la hormona somatostatina. las cuales sintetizan las proteínas codificadas por los genes. fue la pista que orientó hacia el momento en que se podían recombinar los genes en el laboratorio.g. largamente establecidas y ampliamente conocidas y utilizadas (e. Otro es el gen para la somatotropina u hormona de crecimiento. los anticuerpos monoclonales y los nuevos métodos de cultivo de células y tejidos.15 - . que se utiliza para tratar cierta forma de enanismo en los niños. y la transformación en una célula procariota o eucariota. fermentación de alimentos. . unión de este a un ADN vector. Más recientemente. que han funcionado correctamente para la síntesis de las proteínas codificadas. El descubrimiento de las enzimas llamadas endonucleasas de restricción. Un ejemplo es el gen para la insulina humana. Los plásmidos utilizados para la expresión de proteínas foráneas se conocen con el nombre de vectores de expresión. se ha logrado introducir en células bacterianas genes para otras proteínas útiles en medicina. hasta la biotecnología moderna.ADN RECOMBINANTE La biotecnología consiste en un gradiente de tecnologías que van desde las técnicas de la biotecnología "tradicional". OBTENCIÓN DEL ADN Comprende las siguientes etapas: obtención del inserto de ADN que interese.. mediante la utilización de las enzimas de restricción. que son introducidos en células bacterianas. Las técnicas de DNA recombinante permiten la construcción de vectores. capaces de reconocer y cortar el ADN en puntos determinados. control biológico). una proteína pequeña de sólo 14 aminoácidos que podía ser detectada en cantidades muy pequeñas. basada en la utilización de las nuevas técnicas del DNA recombinante (llamadas de ingeniería genética). portadores de genes específicos.

una condición que tiene que tener los dos ADNs que se quiere unir es que tengan un pequeño fragmento igualen sus secuencias. coli. con uniones no covalentes. pero simultáneamente en el tiempo. Las uniones covalentes se consiguen añadiendo ADN ligasa y una fuente energética para formar los enlaces (forma A). Es otro vector que puede ser utilizado para introducir genes en bacterias. Cada plásmido contiene varios genes que se replican. Se pueden unir genes extraños a los plásmidos con mucha facilidad. cada uno de los cuales procede de una especie diferente podemos utilizar dichas enzimas como herramientas. se mezcla con la cubierta del virus lambda. y después ser transportados como pasajeros al interior de las células de E. Los dos DNAs así cortados se mezclan. ADN del fago lambda. Los extremos escalonados del ADN1 y el ADN2 son complementarios. si el tamaño del ADN recombinado no es muy distinto del ADN natural del virus lambda. Como estas colas son complementarias. que se encuentran en el citoplasma de la mayoría de las bacterias. se producen partículas fágicas infecciosas. Éstas están formadas por todas las . con lo cual. Posteriormente. De este modo pueden construirse colas de poli G (nucleótico de guanina) en los extremos 3 de las dos hebras de ADN dúplex y colas de poli C (nucleótico de citosina) en los extremos del otro ADN. permitirán que los dos ADNs se unan por complementariedad. con su gen pasajero. ya que transporta el inserto de ADN a una molécula hospedadora.ADN RECOMBINANTE Si se quieren unir dos ADNs. transcriben y traducen independientemente de los genes del cromóforo bacteriano. se forman los enlaces covalentes por el ADN ligasa (forma B). Plásmidos Estos son pequeños ADNs de cadena doble y circular. Sus extremos cohesivos se aparearán dando lugar a un nuevo ADN recombinado. que puede adicionar muchos residuos de desoxirribonucleótidos sucesivos al extremo 3 de las hebras del ADN. Los procesos de clonaje y de aislamiento de estos fragmentos se inician con la construcción de una biblioteca de ADN o un banco de ADN. El ADN vector es el vehículo de clonaje. se calientan y sé enfrían suavemente.16 - . Cuando el ADN recombinado del fago lambda. Los vectores o transportadores más utilizados son los plásmidos y el ADN del fago lambda. Otra enzima clave para unir ADNs es la transferencia terminal. donde pueden ser replicados. Cada ADN se trata con una endonucleasa de restricción que origina en este caso un corte escalonado en las dos hebras dobles de ADN.

Sin embargo. Un organismo multicelular usualmente inicia su vida en forma de huevo fecundado.17 - . un mismo tipo celular puede producir variantes de las proteínas que sintetiza en distintas etapas del desarrollo del organismo. Las investigaciones realizadas sobre estos organismos a nivel molecular develaron también muchas diferencias importantes entre el genoma de los eucariotas y de los procariotas. el cigoto. A su vez. En primer lugar. en vez de disminuir. Las bibliotecas deben cumplir la característica de poder introducirse en células donde cada recombinante pueda aplicarse in vivo. Resulta claro que la diferenciación de las . GENÉTICA MOLECULAR DE LOS EUCARIOTAS ± EXPRESIÓN GÉNICA Con la ayuda creciente de las herramientas de la tecnología del DNA recombinante. La regulación génica en los eucariotas. en respuesta a cambios en los nutrientes en el ambiente. toda la información genética originalmente presente en el cigoto también está presente en cada célula diploide del organismo. y es llevada a cabo activando o reprimiendo la expresión de ciertos genes. especialmente en los multicelulares. La regulación de la expresión génica en los procariotas está relacionada fundamentalmente con el ajuste fino de la maquinaria metabólica de la célula. El cigoto se divide repetidamente produciendo muchas células que se diferencian y cada tipo celular comienza a producir proteínas característicamente diferentes que lo distinguen de otros tipos de células. es muy diferente. el cromosoma eucariótico difiere en muchos aspectos del cromosoma procariótico. se fue ampliando.ADN RECOMBINANTE moléculas de plásmidos o fagos recombinantes originados al unir un ADN a un vector. progresaron los estudios de genética molecular de los eucariotas y la distancia entre los eucariotas y los procariotas.

El descubrimiento del papel de la transcriptasa inversa forjó el eslabón crucial entre los retrovirus y los cromosomas de las células eucarióticas. Requiere primero la preparación de un gen que será captado por una célula eucariótica. El análisis del cromosoma eucariótico ha revelado que éste también está sujeto a reordenamientos. como en el caso de los procariotas. En consecuencia.18 - .ADN RECOMBINANTE células de un organismo multicelular depende de la inactivación de ciertos grupos de genes y de la activación de otros. y todavía grandemente desconocidos. pero esto es sólo el comienzo. El nuevo gen debe establecerse en un gran número de células del tipo apropiado y quedar sujeto a los complicados. En ocasiones. controles del gen normal. La expresión de los genes puede ser regulada en distintas etapas del camino que conduce desde el DNA a las proteínas. y luego expresado. de una regulación de la expresión. Las células se hacen crecer en cultivo en tubos de ensayo y se transfieren a óvulos fecundados de ratón y de otras especies de mamíferos y a embriones de Drosophila. Hay varias evidencias que han relacionado el desarrollo del cáncer con cambios en el material genético. todos los virus conocidos causantes de cáncer son virus que introducen información en los cromosomas de las células hospedadoras. las células se multiplican sin control. Se han desarrollado técnicas que permiten la transferencia de genes a células eucarióticas. invadiendo y destruyendo otros tejidos. En cada uno de estos casos. las células escapan a los factores que regulan el crecimiento celular normal. incorporado a un cromosoma. Los virus pueden provocar cambios en la constitución genética de la célula y algunos pueden causar cáncer. Más aun. Estos incluyen tanto virus con genoma de DNA como retrovirus con genoma de RNA. los clones. El mayor anhelo relativo a las aplicaciones basadas en la tecnología del DNA recombinante es que en algún tiempo futuro sea posible corregir defectos genéticos sustituyendo genes ³malos´ ³por genes´ ³buenos´. CROMOSOMA EUCARIÓTICO . Esta es una tarea enormemente compleja. amontonándose. genes extraños han sido incorporados y expresados en el nuevo hospedador. el genoma eucariótico contiene un sorprendente arreglo de elementos genéticos móviles. Las investigaciones en eucariotas han demostrado que. es decir. deleciones y adiciones. En los últimos años también se desarrollaron técnicas que permiten obtener copias idénticas de organismos. En estos casos se produce el cáncer.

las DNA polimerasas operan solamente en una . La mayoría de estas proteínas son histonas. las unidades de empaquetamiento básico del DNA de los eucariotas. a la replicación del DNA de los procariotas. A-DNA (una hélice dextrógira menos fuertemente enrollada) o Z-DNA (una hélice levógira). moléculas relativamente pequeñas con carga positiva. con distintas funciones biológicas.ADN RECOMBINANTE El DNA eucariótico siempre está asociado con proteínas. Los nucleótidos en la forma de trifosfatos se acoplan a lo largo de una cadena molde de DNA en la forma semiconservativa. La cadena que une los núcleos de los nucleosomas contiene otros 30 ó 60 pares de bases. Las distintas formas del DNA podrían coexistir in vivo. La molécula de DNA se envuelve alrededor de núcleos formados por ocho moléculas de histonas. Como en los procariotas. La distancia entre los nucleosomas es entre 10 y 11 nanómetros y el diámetro de cada cuenta es aproximadamente de 7 nanómetros.19 - . El DNA puede tomar in vitro la forma de B-DNA (la hélice dextrógira descrita por Watson y Crick). en la síntesis de las cadenas complementarias. en principio. Los nucleosomas se empaquetan unos sobre otros formando una estructura más condensada ±la fibra de 30 nanómetros± que se encuentra tanto en la cromatina en la etapa de interfase como en los cromosomas que entran en mitosis. que constituyen más de la mitad del peso del cromosoma. El centro de cada nucleosoma está compuesto por alrededor de 140 pares de bases de DNA y un conjunto de ocho moléculas de histona. para formar nucleosomas. La replicación del DNA en los eucariotas es igual.

El DNA recién sintetizado hereda parte de las viejas histonas pero requiere también de nuevas histonas para empaquetarse y formar la cromatina. que se observa mediante la tinción de la cromatina. algunas de las cuales tienden a activar el gen y otras a desactivarlo. Muchas evidencias indican que el grado de condensación del DNA del cromosoma. un gen parece responder a la suma de muchas proteínas regulatorias diferentes. la replicación comienza en un único origen y procede bidireccionalmente a lo largo de dos horquillas de replicación. Si bien en los procariotas también se da una regulación a este nivel. a medida que la horquilla de replicación avanza debe. se cuentan las secuencias denominadas enhancers. LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN LOS EUCARIOTAS METILACIÓN Los biólogos están comenzando a comprender algunos aspectos de la regulación de la expresión génica en eucariotas. Las histonas ensambladas en los nucleosomas raramente se separan del DNA. Entre estas secuencias regulatorias. a las que se unen las proteínas que activan la transcripción. en particular. llamadas factores generales de transcripción. que luego se unen por la acción de la enzima DNA ligasa. se ensamblen en la región promotora del gen que se va a transcribir. Una variedad de proteínas reguladoras específicas desempeñan papeles centrales en la regulación de la expresión génica. En un organismo multicelular. en los multicelulares. Para poder iniciar la transcripción. por lo tanto. se hace cada vez más claro que este nivel de control de la transcripción es mucho más complejo en los eucariotas. desempeña un papel principal en la regulación de la expresión génica en las células eucarióticas. pasar a través de los nucleosomas parentales.ADN RECOMBINANTE dirección¶¶. Esto permite la unión de la RNA polimerasa y la posterior transcripción. la cadena complementaria a la otra hebra madre ¶¶se sintetiza como una serie de fragmentos de Okazaki. Durante el desarrollo embrionario. En cuanto se sintetiza.20 - . Se cree que cada nucleosoma se desenrolla transitoriamente. permitiendo que la DNA polimerasa copie el DNA nucleosomal desenrollado. La tinción revela dos tipos de . diferentes grupos de genes se activan o inactivan en diferentes tipos de células. comparativamente pequeño. el DNA eucariótico forma los nucleosomas y se asocia también con otras proteínas compactándose en los niveles superiores de condensación. la RNA polimerasa requiere que un grupo de proteínas. de alguna manera. Los sitios en los cuales se unen esas proteínas regulatorias pueden estar a centenares o miles de pares de bases de distancia de la secuencia promotora en la que se une la RNA polimerasa. En el cromosoma procariótico circular.

La transcripción del DNA a RNA ocurre solamente durante la interfase. esta cifra puede disminuir hasta el 1%. En E. cuando las células se diferencian durante el desarrollo embrionario. Además.21 - . cada molécula de DNA cromosómico contiene típicamente sólo una . En primer lugar. la impronta genómica. Un ejemplo es la cromatina altamente condensada. o hasta millones de veces.ADN RECOMBINANTE cromatina: la eucromatina y la heterocromatina. Este tipo de heterocromatina se denomina heterocromatina constitutiva. desempeña un papel en el desarrollo temprano del embrión. virtualmente todo el DNA se expresa. varían de un tipo de célula a otro dentro del mismo organismo. excepto por las secuencias reguladoras o secuencias señal. en cada célula eucariótica parece haber un gran exceso de DNA. Algunas regiones heterocromáticas son constantes de célula a célula y nunca se expresan. reflejando la biosíntesis de diferentes proteínas por diferentes tipos de células. casi la mitad del DNA de la célula eucariótica consiste en secuencias de nucleótidos que se repiten centenas. que ocurre después de la replicación. que ocurre durante la gametogénesis. localizada en la región del centrómero del cromosoma. cuando la eucromatina está laxa. pero la eucromatina se vuelve más laxa. Otras regiones de cromatina condensada. coli. Durante la interfase. que no codifica para proteínas. Se estima que en las células eucarióticas menos del 10% de todo el DNA codifica para proteínas. por el contrario. Otro factor que está involucrado en la regulación génica es la metilación de las bases nitrogenadas citosinas. la heterocromatina permanece condensada. Esto fue un descubrimiento particularmente sorprendente. desempeña un papel estructural en el movimiento de los cromosomas durante la mitosis y la meiosis. los individuos tienen la misma cantidad de DNA en cada una de sus células diploides (lo cual no es sorprendente). Por contraste en los procariotas y más aún en los virus. pero las variaciones entre las diferentes especies son enormes. o por lo menos de DNA cuyas funciones son desconocidas. Esta región. en los seres humanos. en una misma especie. En tercer lugar. La metilación diferencial de ciertos genes en ambos sexos. METILACION GENOMA EUCARIÓTICO El examen del DNA de las células eucarióticas reveló cuatro sorpresas principales. con algunas pocas excepciones. En segundo lugar. la proporción de heterocromatina aumenta respecto de la de eucromatina a medida que la célula se vuelve más especializada. que ha sido por largo tiempo el modelo para los genetistas moleculares.

fue que las secuencias de genes eucarióticos que codifican para proteínas habitualmente no son continuas. Además. pero también existe en pequeña cantidad en las mitocondrias y . Los estudios de hibridación y secuenciación han mostrado tres clases de DNA eucariótico. Los genes individuales de la familia difieren ligeramente en sus secuencias de nucleótidos. Las secuencias no codificadoras que producen interrupciones dentro de un gen se conocen como secuencias interpuestas o intrones. y las secuencias codificadoras. supuestamente a raíz de mutaciones deletéreas. de acuerdo con la genética mendeliana. La cuarta sorpresa. las proteínas que ellos codifican difieren ligeramente en estructura y en propiedades biológicas. Aunque los intrones se transcriben a RNA en el núcleo. Algunos genes estructurales. no en una multitud de copias. no se traducen a proteínas. son llamadas exones. Los exones son los segmentos que están presentes en el mRNA citoplásmico y que se traducen a proteína. y tal vez la más inesperada de todas. CLASES ADN El ADN es por lo común el constituyente básico de la cromatina (cromosoma) nuclear en las células eucarióticas.ADN RECOMBINANTE copia de cualquier gen dado. constituye hasta el 70% del DNA cromosómico en los seres humanos y dentro de esta fracción se encuentra el DNA que codifica para la mayor parte de las proteínas. estas secuencias de DNA se conocen como pseudogenes. no están presentes en el mRNA en el citoplasma y. Las repeticiones más largas. en consecuencia. aquellas que se expresan. este hallazgo fue sorprendente porque. La tercera clase. RNA de transferencia e histonas. se conocen como DNA de repetición intermedia. El DNA de secuencia simple está asociado con la heterocromatina fuertemente condensada en la región del centrómero. como los que codifican para las cadenas polipeptídicas de las moléculas de hemoglobina. un gen está presente solamente dos veces por cada célula eucariótica diploide. Los datos actuales indican que sólo un 1% del genoma humano puede traducirse a proteína. seguidos por diferentes mutaciones en diferentes copias del gen. forman familias génicas. Algunos miembros de las familias génicas no se expresan. sino que están interrumpidas por secuencias no codificadoras.22 - . dispuestas característicamente en tándem. el DNA de copia única. las principales excepciones son los genes que codifican los RNA ribosómicos. se conocen como DNA de secuencia simple. Se cree que las familias génicas tienen sus orígenes en duplicaciones génicas que ocurrieron como resultado de ³errores´ de recombinación. Las repeticiones múltiples de secuencias de nucleótidos cortas. habitualmente dispersas en el cromosoma. así. El DNA de repetición intermedia incluye múltiples copias de los genes que codifican para los RNA ribosómico.

Las bases nitrogenadas se colocan casi exactamente perpendiculares al eje de la doble cadena (eje azúcar ± fosfato). Por cada vuelta de la hélice hay 10pb. A-ADN: es ADN de tipo Dextrogiro (la hélice está enrollada hacia la derecha). a diferencia de los exones que . y se cree se forma durante la transcripsion. Constituyen la heterocromatina y no se le conoce función. y las proporciones serían las mismas en otras especies. Es la estructura más estable de las 3.  ADN repetitivo(20 %)son unidades de aproximadamente 300 pares de nucleótidos* que se repiten en el genoma unas 105 veces(unidades de repetición). Existen diferentes tipos que los podemos dividiren:  ADN de copia única(el 57 % del total) formados por segmentos de aproximadamente 1000 pares de nucleótidos del longitud. sólo una pequeña parte del ADN constituye genes (menos del 10 %). INTRONES Unaregión del ADN que debe ser eliminada del transcrito primario de ARN es un intrónpor el hecho que son segmentos no codificados. En los procariontes forma el nucloide (que a diferencia de los eucariontes no va asociado a proteínas. Este ADN tiene la particularidad de presentar zonas metiladas por lo cual no puede ser transcrito a ARN mensajero.ADN RECOMBINANTE cloroplastos. Z-ADN: Es de tipo Levógiro. una pequeña parte de este ADN contiene los genes. Al parecer se presenta cuando intracelularmente no hay agua o en muestras de ADN deshidratadas (por ejemplo en las usadas para cristalografía). Los porcentajes indicados son del hombre y el ratón. Acorde a lasevidencias. Se intercalan con el ADN de copia única. B-ADN: es Dextrogiro también y es la forma más abundante del ADN.  ADN satélite(altamente repetitivo: 28 %)son unidades cortas de pares de nucleótidos que se repiten en el genomio. es desnudo) y en los virus (DNA virus) que lo poseen constituyen el virión o elemento infestante. Tiene una estructura molecular más distendida y por lo tanto relativamente "débil" porque la distancia entre las bases y el eje de la hélice es mayor. Por cada vuelta de la hélice hay 11pb. Está formado no por 1 par de bases como unidad sino por 2 pares de bases. todo eso provoca que la molécula adquiera una forma de zig ± zag.23 - . Son característicos en cada especie y pueden ser separados por centrifugación.

El número y longitud de los intrones varía enormemente entre especies. en lo que constituye un proceso más eficiente que construir los nuevos genes a razón de un nucleótido a la vez. que ocurre dentro del núcleo de una célula. la primera es la que tiene la respuesta más satisfactoria. Takifugu rubripees. . haciendo más fácil moverlos y crear nuevos genes. Los Intrones son comunes en todos los tipos de ARN eucariota. Por ejemplo. Existen 3 preguntas que los científicos estan tratando de resolver acerca de los intrones: ¿Cómo se remueven los intrones del ADN? ¿Qué hacen los intrones? ¿Cuál es el origen de los intrones? De estas 3 preguntas. La denominada "teoría exótica de los genes" sugiere que los exones son los bloques constructores de las proteínas y que los genes se crean a partir de las combinaciones de estos bloques constructores. La segunda pregunta sigue siendo tema de estudio. es un proceso de remoción de intrones). tiene pocos intrones en su genoma. Esta teoría nos lleva hacia la "hipótesis de barajeo de exones". la cual afirma que los intrones incrementan el porcentaje de recombinación de los exones. especialmente en los ARN mensajeros (ARNm).24 - . Se sabe que los intrones son removidos del ARN mediante un proceso denominado empalme del ARN. el cual es una especie de "edición" del contenido del ARN (es decir. así como entre los genes de una misma especie. el pez globo. motiva la formación de nuevos genes a partir de sub-unidades estructurales y funcionales de los genes existentes. mientras que los mamíferos y las angiospermas (plantas con flores) suelen presentar numerosos intrones. De acuerdo a esta teoría. Existen diferentes métodos de empalme del ARN. y la mayoría requiere de la ayuda de proteínas que reconocen secuencias específicas en el pre-ARN. además pueden encontrarse en algunos ARNt y ARNr de procariotas. la estructura intrón-exón de los genes eucarióticos.ADN RECOMBINANTE son regiones que codifican para una determinada proteína.

Los intrones del grupo I están presentes en los genes de ARNr de algunos eucariotas inferiores y en los genes mitocondriales de hongos. II y III son intrones que sufren de autosplicing mediante reacciones de transesterificación. los ancestros de los eucariotas y los procariotas poseían intrones. Los del grupo IV están presentes en los ARNt de los eucariotas y se caracterizan por ser los únicos que se eliminan mediante un corte endonucleótido seguido de un ligamiento en lugar de la reacción de transesterificación . Los intrones del grupo II y III son muy similares y presentan una estructura secundaria altamente conservada. entonces ¿por qué sólo aparecen en los organismos eucariotas y no en los procariotas? Respecto a la tercera pregunta.ADN RECOMBINANTE Ante esta teoría. En ambos grupos. Se caracterizan por eliminarse mediante un proceso auto-catalítico que requiere de una guanosina o un nucleótido de guanosina libre. respectivamente. se forma una estructura en lazo característica denominada lariat. aunque pueden tenerlas en su interior.25 - . Actualmente se reconocen cuatro clases de intrones: Intrones del grupo I Intrones del grupo II Intrones del grupo III Intrones nucleares. La frecuencia con la que encontramos estos intrones en el genoma es relativamente rara si la comparamos con la frecuencia de los intrones spliceosomales. existen dos teorías comúnmente aceptadas: la teoría de los "intrones tempranos" y la de los "intrones tardíos". la pregunta que resulta más obvia es: si los intrones son útiles para la recombinación. Los del grupo II y III se eliminan mediante un proceso auto-catalítico que requiere de una adenina o de un spliceosoma. pero éstos últimos los perdieron durante su proceso evolutivo. spliceosomales o intrones del grupo IV Los intrones del grupo I. estos ancestros no poseían intrones y los eucariotas los obtuvieron durante el proceso evolutivo. Según la primera. De acuerdo con la segunda teoría. durante el proceso de empalme de los exones. De hecho a veces los intrones del grupo III son identificados como intrones del grupo II debido a su similitud funcional y estructural. así como por carecer de secuencias consenso en los puntos de empalme.

Repeticiones de CA en el ADN centromérico. Parece que. se han encontrado elementos conocidos de regulación solapando con ellas (cajas). por lo que probablemente modulen la unión a ese elemento.ADN RECOMBINANTE REPETICIONES Y NO REPETICIONES ADN repetido. antes del promotor. que abundan en el ADN espaciador entre genes. pero también parece limitar el número de potenciales divisiones celulares. hacen suponer una misión reguladora a estas secuencias. Favorecen la replicación del ADN en el extremo lineal del cromosoma. Las repeticiones suelen ser de decenas. hay dos presentes en todos los ARNm y que se encuentran antes y después de los codones y y y y . Agrupaciones de AT y de CA. que sintetiza ADN independientemente de molde. ADN telomérico: Consta de secuencias altamente repetidas (cientos de veces) de 4 a 8 nt. que no se da en otras partes del genoma. ayuda a estabilizar los cromosomas y evitar su degradación por esos extremos. Expansión de trinucleótidos: En ciertos genes hay repeticiones de un trinucleótido entre 10 y 100 veces. De hecho. y Islas CG: Se encuentran aproximadamente 1 Kpb a 5' de muchos genes. sobre todo. tanto en la secuencia codificante como en los intrones y las 3' y 5' UTR (untranslated terminal region: región no traducida terminal. además. Tanto la rareza como esta especial distribución y concentración. La enzima que añade este polinucleótido (diferente para cada especie) es la telomerasa.26 - . con un patrón de distribución del dinucleótido característico.

pero en cualquier caso no se sabe qué son ni porqué permanecen en el genoma. probablemente. y SINE (secuencias cortas dispersas entre genes): Son secuencias de unos cientos de pb. lo han hecho a lo largo de la evolución generando una gran variabilidad. traducirse (no se sabe si con un promotor propio o con otro cercano) para después retro-transcribirse (como los retrovirus. Se dice entonces que la mutación es knockin (mutación por inclusión de material genético). porque la proteína pierde su función.27 - . posee entre 10 y 30 repeticiones del trinucleótido CAG cuando es funcional. y la enfermedad se desarrolla cuando se sobrepasa cualquiera de los dos límites. cuando no parecen tener ninguna función. posibles implicaciones evolutivas) en ADNds y posteriormente incluirse al azar en el genoma. LINE (secuencias largas dispersas entre genes): Son secuencias de unos 7000 pb que se encuentran flanqueando genes. Estructura de ADN en cuádruplex formada por repeticiones Repeticiones de secuencias largas. Las que mejor se conocen son las de la familia Alu. pero se supone que deben. en la que el gen que codifica para la proteína responsable. en algún momento. No se conoce el mecanismo de replicación de estas secuencias. y la gravedad es proporcional al número de repeticiones de más. respectivamente. la huntingtina. Por su tamaño forman parte del ADN y . con las secuencias de adhesión y disociación del ribosoma y con implicaciones en la expresión génica). Se sabe que estos elementos son capaces de incluirse en otro sitio del genoma porque se han detectado casos de mutaciones en las que un exón quedaba interrumpido por una de estas secuencias que antes no estaba ahí. Lo que es evidente es que juegan un papel importante en la construcción de genomas y que.ADN RECOMBINANTE de inicio y terminación. cada una con 300 pb y distribuidas en 500000 copias. Este fenómeno se conoce muy bien en la enfermedad de la corea de Huntington. presentes en un muy elevado número de copias.

porque tiene todos los elementos necesarios para poder llegar a sintetizarse. como es el caso de la mayoría de las talasemias que conciernen al locus de la hemoglobina. por ejemplo. Se han descubierto elementos de ese tipo a 5' del locus de la hemoglobina. el codón de iniciación. También tiene importantes implicaciones evolutivas.). sobre todo porque controlan la expresión de genes que están a Mpb de distancia. por lo que se selecciona negativamente y se inactiva permanentemente. a veces.ADN RECOMBINANTE moderadamente repetido. la de las hemoglobinas. Muchas veces. Sin embargo. ya que alguna vez la recombinación puede no ser homóloga y provocar. poseen un parentesco evolutivo que es consistente con un proceso de copia. aun constando de proteínas independientes. es parte activa en procesos de recombinación genética porque su secuencia es altamente homóloga con la de los genes funcionales de su alrededor. Generalmente las familias génicas se encuentran agrupadas. la unión o separación de cromosomas. y los genes que las constituyen distan unos pocos Kpb unos de otros. a corto plazo. sin llegar a ser alelos (variantes de un mismo gen) porque codifican para productos distintos. posee una regulación conjunta de todos los genes durante el desarrollo. Este gen nunca transcrito se llama pseudogén. por lo que su principal misión sería favorecer la diversificación genética. Es importante no confundirlo con ADN repetido. etc. cada uno con sus propios elementos de regulación que. A pesar de que es un gen inútil. sobre él pueden desarrollarse fenómenos de mutación al azar que deriven en un gen funcional y reviertan la inactivación o. de modo que se puede considerar la existencia de un elemento de regulación de la familia entera. el producto no es funcional. Este hecho permite la aparición de mutantes híbridos. FAMILIAS GENÉTICAS -TRANSCRIPCIÓN Y PROCESAMIENTO DE ARN EN EUCARIOTES Una familia génica es un conjunto de genes con un alto grado de homología que.28 - . durante la evolución de una copia de un gen determinado. pero no se sabe cómo actúan. o impide el buen funcionamiento en uno u otro sentido. excepto alguno esencial (el promotor. diversificación y evolución independiente. se conoce desde hace mucho tiempo que familias génicas como. . por ejemplo. pero son independientes. denominados LCR (locus controlling regions: regiones controladoras del locus). Se cree que favorecen la recombinación y el sobrecruzamiento. actúan de manera totalmente independiente.

En el humano son unas 200 copias repartidas en cinco cromosomas. Cada una de estas copias tiene su propio promotor. Se le agrega 7-metilguanina (una base inusual) al extremo 5' del mARN. pero en todas es el mismo. pero puede usarse para capturar mARN para estudios. el ARN transcripto es extensamente modificado antes de ser exportado al citoplasma. no por las posibles analogías entre cada uno de ellos. claro. y esto resulta esencial para el pegado del mARN al ribosoma. Una ristra de adeninas (tanto como 200 nucleótidos conocido como poli-A) se agrega al extremo 3' del mARN luego de la transcripción. mientras que en eucariotas tenemos dos procesos separados en tiempo y localización (recordar la existencia de una envoltura nuclear). una para los rARN largos y una tercera para los rARN cortos y los tARN. Existen muchos ejemplos de mensajes idénticos procesados por diferentes métodos (ver El ACTH y su . La función de esta "cola" de poli A no se conoce. Cada gen eucariota se transcribe separadamente. Si bien los procariotas tienen un solo tipo de ARN polimerasa para todos los tipos de ARN. sino en que en una célula eucariota suele haber cientos de repeticiones en tándem del conjunto de genes que los codifican. los eucariotas tienen una para cada tipo. Transcripción El proceso de transcripción en los eucariotas es similar a los de los procariota. Luego que en el núcleo de la célula eucariota se transcribe un ARN. Una para el mARN.ADN RECOMBINANTE Los ARNr son un ejemplo de familia génica. existen sin embargo algunas diferencias. con un control transcripcional independiente para cada gen. Los intrones se cortan y los exones se colocan juntos antes que el mARN deje el núcleo. Los genes eucariotas no se agrupan en operones como los de los procariotas. En procariotas la traducción comienza inclusive antes que la transcripción haya terminado.29 - .

o mRNA de su nombre en inglés) es el ácido ribonucleico que contiene la información genética procedente del ADN para utilizarse en la síntesis de proteínas. llamadas intrones. la adición de otros no codificados en el ADN y la modificación covalente de ciertas bases nitrogenadas. es decir. Poliadenilación: es la adición al extremo 3' de una cola poli-A.30 - . un tramo de RNA cuyas bases son todas adenina.5'-fosfodiéster. mientras que en los procariotas los ARNm son con frecuencia policistrónicos. 3. Esto no ocurre en células procariontes. ya que estas no poseen intrones en su ADN. de modo que se puede sintetizar mayor cantidad de proteína. a veces los intrones se tornan exones y viceversa. Entre esas modificaciones se encuentran la eliminación de fragmentos (splicing). el procesamiento del ARN en eucariotas comprende diferentes fases: 1. El ARN mensajero es un ácido nucleico monocatenario. Adición al extremo 5' de la estructura denominada caperuza o casquete (o CAP. codifican más de una proteína. contienen información para una sola cadena polipeptídica. Esta cola protege al ARNm frente a la degradación. que se añade al extremo 5' de la cadena del ARNm transcrito primario (ubicado aún en el núcleo celular) mediante un enlace 5'-fosfato 5'1 fosfato en lugar del habitual enlace 3'. Esta caperuza es necesaria para el proceso normal de traducción del ARN y para mantener su estabilidad. Moléculas de proteínas se pegan al mARN y luego se exportan del núcleo formando partículas llamadas ribonucleoproteínas (mRNPs) que parecen ayudar en el transporte por los poros nucleares y también en el pegado a los ribosomas. El ARN mensajero (ARNm. es decir. el ARN mensajero sufre la eliminación de secuencias internas. sino que ha de sufrir modificaciones antes de ejercer su función (procesamiento o maduración del ARN). Procesamiento de ARN El ARN mensajero obtenido después de la transcripción se conoce como transcrito primario o ARN precursor (pre-ARN). es decir. su nombre en inglés) que es un nucleótido modificado de guanina. En la mayoría de los casos. El proceso de retirada de los intrones y .ADN RECOMBINANTE familia de péptidos). una secuencia larga de poliadenilato. no codificantes. que en la mayoría de los casos no se libera del complejo de transcripción en forma totalmente activa. la 7metilguanosina. Su adición está mediada por una secuencia o señal de poliadenilación (AAUAAA). Concretamente. Todos los ARNm eucarióticos son monocistrónicos. esto es crítico para el reconocimiento y el acceso apropiado del ribosoma. es decir. determina el orden en que se unirán los aminoácidos. al contrario que el ADN que es bicatenario. 2. situada unos 20-30 nucleótidos antes del extremo 3' original. aumentando su vida media en el citosol.

intercambiando o eliminando nucleótidos erróneos. generalmente con la ayuda de ribonucleasas. el ARN mensajero no pasa por un proceso de maduración y. A veces un mismo transcrito primario o pre-ARNm se puede ayustar de diversas maneras. En procariontes.ADN RECOMBINANTE conexión o empalme de los exones se llama ayuste. en el caso de los seres eucariontes. por lo tanto. permitiendo que con un solo gen se obtengan varias proteínas diferentes. La diferencia fundamental está en que. splicing). 5.31 - . porque en las células procariotas no hay un núcleo definido. en las procariotas. Además no tiene que salir del núcleo como en las eucariotas. 4. . que son la maquinaria encargada de la síntesis proteica. El proceso de transcripción y el de traducción se realizan de manera similar que en las células eucariotas. estos dos organelos tienen su propia información genética y se replican de manera independiente del DNA nuclear. Ciertas enzimas parecen estar involucrados en editar el RNA antes de su exportación fuera del núcleo. o corte y empalme (en inglés. no se le añade caperuza ni cola. ADN DE LOS ORGANELOS ENERGÉTICOS Existen dentro de la célula dos organelos que aportan energía la mitocondria y el cloroplasto. Aquí ocurren diversas reacciones de fosforilación oxidativa. la unión de los ribosomas ocurre mientras la cadena de ARNm está siendo sintetizada. por lo cual su DNA presenta muchas mutaciones. El ARN mensajero maduro es trasladado al citosol de la célula. Una vez en el citoplasma. a través de poros de la membrana nuclear. 6. el ARNm se acoplan los ribosomas. ni se le quitan intrones. a este fenómeno se le llama ayuste alternativo. Después de cierta cantidad de tiempo el ARNm se degrada en sus nucleótidos componentes.

32 - .es/personal_pdi/ciencias/bolarios/BiologiaCCAA/resumenes/tema14.htm http://laguna..fmedic. así que estos tres organismos comenzaron a convivir. eran organismos procariotes capaces de realizar dichas funciones antes mencionadas y que aportan a la célula energía. Sue Barnes 5ta.cobach-elr.htm Trabajos y Páginas web consultadas http://es. BIBLIOGRAFÍA Molecular CellBiologyfiftheditionLodish BiologíaCelulardelosMicroorganismos-Brock 10ma Edición Biología de Curtis H. N. Las células eucariotes primitivas no eran capaces de fotosintetizar (cloroplastos) o de realizar fosforilizaciones (mitocondria). haciendo que unos dependieran de otro. y 6ta edición versión online http://www. se convirtieron en una sola célula. Al crearse ese vínculo fuerte.unam.com/academias/quimicas/biologia/biologia/curtis/inicio. ya no pudieron dejar de ser diferentes organismos y al evolucionar.wikipedia.mx/~evazquez/0403/dna%20recombinante.html .ADN RECOMBINANTE El por qué estos dos organelos tienen DNA está basado en una teoría llamada "endosimbiótica" en donde menciona que la mitocondria y el cloroplastos.org/wiki/ADN_recombinante http://www.uam.

edu.uam.revista.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.com/organulos-energeticos.com/question/index?qid=20090603133537AAhr4SR http://html.uncor.iespana.htm http://es.html http://www.yahoo.com/adn-y-arn.htm#Transcription and processing of http://www.wikipedia.biologia.efn.biologia.2/num3/art1/index.org/wiki/Secuenciaci%C3%B3n_de_ADN http://es.es/~ecampins/Treballs%202n/Biotecnologia/OBTENCION%20DEL%20A DN%20RECOMBINANTE.edu/human/problem_sets/DNA_forensics_2/03t.shtml http://biotec.biblioteca.html http://es.com/trabajos14/biotecnologia/biotecnologia.html http://www.33 - .com/trabajos12/desox/desox.html http://es.amgen.shtml#cla http://html.htm http://www.ADN RECOMBINANTE http://www2.wikipedia.org/wiki/Secuencia_de_ADN http://www.org/wiki/Hibridaci%C3%B3n_(biolog%C3%ADa_molecular) http://www.es/servicios/seq/otros/SecuenciaADN/maxam.es/adn.edu/dep/biologia/intrbiol/adntema3.rincondelvago.ucm.es/html/adn_reco.htm http://www.infotelecom.org.htm http://es.ar/adn/adntema4.ar/libros/hipertextos%20de%20biologia/adntema3.unam.htm http://www.arizona.wikipedia.htm http://html.com/genetica-molecular_2.com/doc/15795726/Genetica-Molecular-Esquema http://www.answers.iib.htm http://www.rincondelvago.monografias.ar/libros/hipertextos%20de%20biologia/adntema3.html .org/wiki/ARN_mensajero http://www.monografias.org.biblioteca.html http://revistaplaneta.wikipedia.mx/vol.scribd.rincondelvago.

34 - .ADN RECOMBINANTE .

ADN RECOMBINANTE CUADROS DE RESUMEN I .

ADN RECOMBINANTE II .

ADN RECOMBINANTE III .

ADN RECOMBINANTE IV .

ADN RECOMBINANTE V .

ADN RECOMBINANTE VI .

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