TEMA 5.8.

Técnicas de la Biología Molecular

1. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
2. CLONAJE. VECTORES
-Plásmidos
-Fagos
-YAC, PAC y BAC
3. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
-Southern y Northern blot
-Hibridación “in situ”
-Microarray de DNA
4. LIBRERIAS DE DNA
-Genotecas
-Librerías de cDNA
5. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) y RT-PCR
6. EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS
-Producción de animales genéticamente modificados
7. MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
8. SECUENCIACIÓN DEL DNA
-Método de Sanger
-Secuenciación automática
9. INTERACCIONES PROTEÍNA-PROTEÍNA
-Doble híbrido en levadura
El flujo de la información genética y las técnicas del DNA recombinante

Década 1970: Paul Berg, Herbert Boyer, Stanley Cohen…

Técnicas para la localización, aislamiento, preparación y estudio de pequeños fragmentos
de DNA procedentes de cromosomas. También gracias a estudio virus y plásmidos.
Técnicas basadas en la enzimología de los Ac Nucleicos y el lenguaje de apareamiento
entre bases que permite reconocimiento y unión de secuencias complementarias
Estas técnicas han hecho posibles la genómica y proteómica modernas, el estudio de los genes y las
proteínas a nivel de células y organismo entero (importantes avances en el campo Biomedicina)
Metodología del DNA recombinante permite
Aislar genes, Analizar genes, Modificar genes
Los enzimas de restricción cortan el DNA en fragmentos específicos
Endonucleasas de restricción que cortan, en lugares concretos, ambas hebras de DNA dúplex que
contiene las secuencias reconocidas.
Se han encontrado en gran variedad de procariotas (Sistema de modificación-restricción para destruir moléculas DNA ajeno).
Reconocen secuencias 4-8 pb e hidrolizan un enlace fosfodiester en cada hebra (generan extremos
romos o cohesivos). Sitios de corte que casi siempre poseen simetría rotacional binaria

Separación y
visualización
fragmentos de
restricción
Por electroforesis en gel
Clases de enzimas Poliacrilamida: hasta pocos
de restricción miles pb
Caracterizados + de 100 Agarosa: hasta ~20kb
Nomenclatura:
3 letras (hospedador) El conjunto de fragmentos puede servir como
+indicación cepa huella digital de una molécula de DNA
+número romano

En el laboratorio
Enzimas retricción se usan para hidrolizar moléculas DNA
en fragmentos específicos que se pueden analizar y
manipular con más facilidad
 Los enzimas de restricción y DNA ligasa: recombinación DNA
DNA ligasa cataliza la formación de nuevos enlaces fosfodiester
Extremos cohesivos complementarios (extremos romos también pero con menor eficiencia)
**Se pueden ‘generar’ extremos cohesivos mediante un adaptador o linker de DNA sintetizado químicamente y
susceptible de ruptura por determinado enzima de restricción

Dos moléculas de DNA hidrolizadas por

mismo enzima de restricción pueden
soldarse (LIGASAS) dando lugar a
moléculas recombinantes

Un fragmento de DNA se une covalentemente a un DNA vector

(introduce en un vector)
Vector: molécula de DNA que se replica autónomamente en una cel huésped a la que se
puede cortar y empalmar un segmento de DNA para permitir su replicación
por ej. plásmido
Clonaje de un fragmento de
DNA en un plásmido
Los vectores de clonación permiten la amplificación de fragmentos
de DNA insertados
Plásmidos: moléculas de DNA circulares (bacterianos) que se replican con independencia del
cromosoma huesped.
Tamaño 5.000-400.000 pb
Se introducen mediante transformación o electroporación
Sólo unas pocas cél captan el DNA plasmídico: se
necesita un marcador (= gen) de selección tal como
resistencia a antibiótico. Muchos también gen marcador
adicional, inserto en mitad gen de selección para ≠ entre Gen eucar
transformadas con y sin inserto (ej. Selcc blanco/azul gen lac Z) +promotor
bacteriano

Ej.: plásmido pBR322

Con origen replicación (ori), genes resistencia a antibióticos, secuencias corte enzimas restricción

Bacteriófagos: Como el λ. Podemos sustituir parte de su genoma por DNA foráneo (40.000-50.00 pb)
Cósmido: plásmido al cual se han adicionado segmentos del genoma de un bacteriófago, como el fago λ.
Cromosomas bacterianos artificiales (BAC): diseñados para clonación fragmentos DNA muy
largos (100.000-300.000 pb)
Cromosomas artificiales de levaduras (YAC): como Saccharomyces cerevisiae, fáciles de
mantener y cultivar a gran escala en el lab (vectores de gran tamaño)
 HIBRIDACIÓN: La transferencia (blot) de Southern

Un fragmento de DNA que contiene determinada secuencia puede identificarse si se separan por
electroforesis (ácidos nucleicos tienen carga negativa) una mezcla de fragmentos, se transfieren a
nitrocelulosa y se hibridan con una sonda marcada (ej. con 32P) complementaria de la que se busca.
Edward M. Southern, 1975
Luego se utilizó el mismo sistema para detectar RNA y se lo denominó Northern Blot
 Hibridación “in situ”

La hibridación in situ es la hibridación

de fragmentos marcados de DNA de
una hebra o de RNA con secuencias
complementarias (sondas) a
DNA/RNA celular, en cortes de tejido
o preparaciones celulares (in situ).
 Microarray (Chip) de DNA
Un chip de DNA (del inglés DNA microarrays) es
una superficie sólida a la cual se unen una serie
de fragmentos de DNA.
Las superficies empleadas son muy variables y
pueden ser vidrio, plástico e incluso chips de
silicio.
En los últimos años, los biochips o microarrays
de DNA se han convertido en las herramientas
que más universalmente se utilizan para el
análisis comparado de la expresión génica.

Con esta tecnología podemos observar de forma casi

instantánea la expresión de todos los genes del genoma de un
organismo. De tal forma que suelen ser utilizados para
identificar genes que producen ciertas enfermedades mediante
la comparación de los niveles de expresión entre células sanas
y células que están desarrollando ciertos tipos de
enfermedades.
 Librerías de DNA:
Construcción de una genoteca genómica
Una genoteca es un banco de genes que almacena una
colección de genes clasificados y preparados para su
utilización en experimentación.
Las genotecas permiten disponer en cualquier momento
de secuencias de DNA de posible interés biomédico.

Para hacer una genoteca el DNA a estudiar se divide en

fragmentos utilizando enzimas de restricción.
Los virus son a menudo utilizados como vehículo de
transporte de los fragmentos obtenidos, insertando en el
genoma del virus los fragmentos del DNA del organismo de
interés.
Diferentes partículas del virus portarán fragmentos ≠ de DNA pero la
población viral contendrá en su conjunto todo el genoma del organismo.
Cada clon procedente de la división de una bacteria
contendrá el mismo fragmento de DNA, que será a su vez
distinto del fragmento incorporado en otros clones.
Construcción de una genoteca
de cDNA a partir de mRNA
Además de genotecas de DNA genómico, se
El mRNA molde se hibrida con un
oilgonucleótido (oligodT) sintético
(cebador)

pueden construir genotecas con cDNA

(obtenido del mRNA por acción de la
trascriptasa inversa)
La transcriptasa inversa y los
dNTP generan una cadena de DNA
Así se pueden estudiar las secuencias que se complementaria (cDNA)
expresan selectivamente en un estado
concreto, ya que se seleccionan las
secuencias que se en ese momento se están
transcribiendo.
El mRNA se degrada
con alcali

La DNApol I y los dNTP

generan DNA de doble
cadena
 PCR (Polymerase Chain Reaction
Reacción en Cadena de la Polimerasa)
Con la técnica de la PCR es posible obtener millones de
copias de un fragmento del DNA (por ej., un gen de interés).
El uso de esta técnica es muy amplio en el campo de la
medicina
Requiere dos oligonucleótidos complementarios de los extremos
opuestos de ambas hebras de DNA de una región de interés.
-Estos dos "oligos" hacen las veces de "Cebadores o primers", a
partir de los cuales la DNApolimerasa extiende la cadena.
-La DNApol procede de un organismo "Termófilo", una de las más
usadas es la Taq (de Thermus aquaticus que trabaja a Tª > 70ºC,
resistiendo Tª >100ºC).
La muestra de DNA a amplificar , junto con los “2 oligos", la
DNApolim, y los 4 dNTPs precursores se introduce en un
"Termociclador" (aparato de PCR) que permite programar el
procedimiento

RT-PCR (reverse transcriptase PCR)

El molde inicial es RNA (mRNA) y se requiere de una
transcriptasa inversa, para la conversión del RNA a cDNA
Fases PCR en Termociclador:

I.Desnaturalización Inicial: separación de las dos hebras

del DNA bicatenario.
5 minutos Tª 95ºC .

II.Ciclos de PCR: se realizan entre 20-30 ciclos,

Cada ciclo consta de 3 fases esenciales:
II.1. Desnaturalización: separación de las dos hebras del
DNA doble cadena a amplificar. 1 minuto Tª~ 95ºC.
Tras esta fase, un enfriamiento lento a razón de 1ºC/seg.
II.2. Hibridación "Anhealing" de cebadores: es la fase
más crítica del proceso, ya que en ella se produce la
interacción entre los oligonucleótidos cebadores y el DNA
molde a amplificar. Las condiciones óptimas dependen de
los Oligos usados. 1 min Tª 45-a 55ºC.
Tras esta fase,calentamiento rápido a una razón de 0,3ºC/seg.
II.3. Elongación: es la fase en que actúa la polimerasa
replicando el DNA molde a partir del oligonucleótido
cebador. Suele emplearse para la Taq 2 min, 72ºC.
Tras esta fase, nuevo calentamiento rápido (0,3ºC/seg), excepto en el
último ciclo en que se mantiene la temperatura.

III.Terminación: terminación de las síntesis de las cadenas

de DNA iniciadas durante los ciclos. 15 min, 72ºC
 PCR en tiempo real (PCR cuantitativa)
Surgió para resolver el problema de la cuantificación de la técnica de la (RT)PCR.
Se emplean sondas marcadas con fluorocromos.
Las sondas de hidrólisis, frecuentemente empleadas en esta técnica, son oligonucleótidos que
presentan fluorocromos en ambos extremos y tienen una secuencia complementaria a parte del
fragmento de DNA que se quiere amplificar.
Expresión de proteínas eucariotas en cels procariotas y eucariotas

Se pueden introducir genes de eucariotas (y procariotas) en bacterias y se pueden usar

estas como ‘fábricas’ para producir una proteína determinada
Para conseguir un máximo de transcripción, el cDNA se inserta en el vector en el orden correcto de
lectura y cerca de un promotor bacteriano muy activo

Las bacteria NO pueden llevar a cabo modificaciones post-traduccionales como la hidrólisis

de polipéptidos específicos, adición de carbohidratos, etc.

Se requiere expresión en cels hospedadoras eucariotas

 Silenciamiento de expresión de proteínas por interferencia
del RNA (siRNA)
Derivados sintéticos basados en el descubrimiento de los micro-RNA o miRNA: tipo de RNA interferente
con una longitud de 20 -25 nucleótidos altamente específico para la secuencia de nucleótidos de su
RNAm diana, interfiriendo por ello con la expresión del gen respectivo

En células en cultivo se transfectan (plásmido o vector viral) o inyectar moléculas de siRNA sintéticos.
Cuando se transfectan se habla más propiamente de expresión de "shRNAs" (siglas en inglés de short
hairpin RNA “RNA de horquilla corta”),que son procesados para generar siRNAs funcionales.

Los siRNAs son moléculas de alrededor de 22 nucleótidos,

con un grupo fosfato (P) en el extremo 5' y
un grupo hidroxilo (-OH) en el extremo 3'.
Un ratón transgénico es un ratón al que se le ha Producción de animales
modificado su DNA y por tanto su información genéticamente modificados
genética. Estas modificaciones consisten en la
introducción de un gen nuevo o en la eliminación
de un gen propio: ratones knockout

La obtención de ratones transgénicos facilita el

estudio de la función básica de un gen
determinado.

Los genes se introducen en la línea germinal

Por microinyección se introducen copias de plásmido
que contiene un promotor y el gen que queremos
estudiar, normalmente en el pronúcleo macho de un
óvulo fertilizado; después el óvulo se implanta en el
útero de una hembra ‘adoptiva’
 Mutagénesis dirigida

La tecnología del DNA recombinante permite generar

mutaciones específicas in vitro.
Se pueden generar por:
*Delecciones
*Sustituciones: mutagénesis dirigida con oligonucleótidos: se
utiliza un cebador que contiene un nucleótido desaparejado

*Inserciones: cassete de mutagénesis

*Genes diseñadores: si se sueldan fragmentos de genes que
codifican dominios proteicos no asociados en la naturaleza
Secuenciación del DNA.
Método de Sanger
Se basa en la utilización de un precursor
2’,3’didesoxi-NTP, este precursor lleva un
H en vez de un OH en el C3’ de la Ribosa.
-Método enzimático que requiere:
1. Una DNApolim
2. Precisa un "Cebador o primer"
Funciona mejor con DNA simple cadena.
-Proceso con 4 reacciones
una por cada ddNTP añadido.

-Requiere que el DNA sintetizado se marque

(radiactividad o fluorescencia)
-Cada reacción por separado, se resuelve
electroforéticamente en geles de acrilamida
de alta resolución, y se revela, permitiendo
leer paralelamente la secuencia
desde el extremo 5´ (parte inferior del gel, fragmentos pequeños),
al 3´(parte superior del gel, fragmentos mayores).
Cada vez que uno de estos
nucleótidos modificados se
incorpore al azar en el
proceso de síntesis que
dirige la DNApol la
elongación se interrumpirá
Secuenciación
automática de DNA
 Estudios de interacciones proteína-proteína mediante técnicas de
biología molecular
La determinación de las interacciones de una proteína es clave para definir sus funciones
Técnicas muy variadas, incluyendo el uso de la BIOLOGÍA MOLECULAR:
Comparaciones de la composición de los genomas:
NO es una prueba de asociación directa.

En proteínas ya vimos el uso de la Co-inmunoprecipitación:

Al inmunoprecipitar una proteína mediante anticuerpos específicos, otras proteínas que se
unen a la misma pueden precipitar con ella
…y otras tecnicas de bioquímica de proteínas y de imagen (confocal, FRET, etc)

Por Biología Molecular usamos el Análisis del doble híbrido en levaduras

Correlaciones siempre útiles si se conoce la función de al menos una de las proteínas

 Sistema del doble híbrido en levadura
Escrutinio a gran escala de interacciones
(encontrar las proteínas Y capaces de unirse a la proteína X)

Identificar una interacción proteína-proteína in vivo

mediante la reconstitución de un activador de la
actividad transcripcional (GAL4p de la levadura
S. cerevisiae ) y consiste en la separación del dominio
responsable de la unión al DNA y del dominio interacc
prot. el de la activ. transcripcional (activación RNApol).
Se construyen 2 tipos de plásmidos codificantes:
El primer tipo sólo contiene un plásmido: gen que codifica el
dominio de unión al DNA de GAL4 fusionado al gen de la
proteina X. (prot cebo, usada para encontrar compañeros
celulares)
El segundo tipo contiene un gran número de plásmidos, que
contienen el dominio del activador de GAL4, fusionado a uno
de los genes que codifican las proteinas Y (prot presa).
Un plásmido de cada tipo se introduce al interior de la
levadura.
La interacción entre las dos proteínas X y Y conducen a la
reconstitución de una proteína GAL4 funcional y por tanto a la
activación de la transcripción del gene reportero que contiene
un sitio de unión a GAL4.