Nombre: Maoly Toapanta Ayala P1

Historia de la Secuenciación del ADN

Secuenciar una molécula de ADN que contiene la información hereditaria y bioquímica
de cada ser vivo consiste en identificar el orden en el que se encuentran los cuatro
nucleótidos que componen la molécula (Arginina, Timina, Citosina y Guanina) utilizando
distintos métodos que han sido estudiados través de los años.

Secuenciación de ADN de primera generación

Los primeros en descubrir la estructura química del ADN fueron Watson y Crick en 1953.
El modelo de ADN que propusieron fue el de la doble hélice del ADN, se encargaron de
recolectar y analizar fragmentos existentes y los juntaron de forma no común, logrando
secuenciar especies de ARN puro como el ARN ribosómico de transferencia. Sin embrago
no siguieron con los estudios de la secuenciación de ADN ya que se les hacía difícil
distinguir el orden de las moléculas de ADN. En 1965, Holley y sus colegas combinaron
las técnicas anteriores con tratamientos de ribonucleasas y lograron producir la primera
secuencia completa de ácidos nucleicos, la de ARNt de alanina de Saccharomyces
cerevisiae. Seguido Fred Sanger y sus colegas mostraron una técnica que se basaba en
detectar fragmentos de digestión parcial radiomarcados despues del fraccionamiento
bidimensional. En 1972, Fiers mediante el fraccionamiento 2-D produjo la primera
secuencia de genes codificantes de proteínas. (Bautista, 2010)
Wu y Kuiser adaptaron sus métodos haciendo uso del fago λ de Enterobacteria para llenar
los extremos 'cohesivos' colgantes en 5 ' con nucleótidos radiactivos y así poder inferir el
orden de los nucleótidos en cualquier lugar. En 1975 se reemplazó el fraccionamiento 2-
D con una sola separación por longitud de polinucleótidos mediante electroforesis a través
de geles de poliacrilamida. Este sistema se lo llamo “más o menos” y fue descubierto por
Coulson y Sanger y consistía en sintetizar a partir de un cebador, incorporando
nucleótidos radiomarcados, antes de realizar dos segundas polimerizaciones. Utilizando
esta técnica Sanger y sus colegas secuenciaron el primer genoma de ADN, el del
bacteriófago ϕ X174. Sin embargo la técnica de Maxam y Gilbert tenía otro enfoque, se
decía que el ADN radiomarcado se trata con sustancias químicas que rompen la cadena
en bases específicas y que después de pasar por un gel de poliacrilamida, se puede
determinar la longitud de los fragmentos escindidos y, por lo tanto, inferir la secuencia.
Esta fue la primera técnica que se considera como el nacimiento real de la secuenciación
del ADN de "primera generación". (Heather y Chain, 2015)
El gran avance de la secuenciación del ADN se produjo en 1977, con el desarrollo de la
técnica de "terminación de cadena" o didesoxi de Sanger. Este método enzimático, se
basa en sintetizar, de forma secuencial, una hebra de ADN complementaria a una hebra
de cadena simple en presencia de ADN polimerasa, los cuatro 2’-deoxinucleótidos que
componen la secuencia del ADN y cuatro dideoxinucleótidos. La secuenciación es
llevada a cabo en cuatro tubos, en cada tubo, cuando el ADN polimerasa incorpora
aleatoriamente un ddNTP la reacción se detiene, de manera que se generan fragmentos
de distinta longitud, todos ellos con el mismo ddNTP terminal. Los diversos fragmentos
se separan en función de su tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. A
partir del gel se puede reconstruir la secuencia que se ha sintetizado, que es
Nombre: Maoly Toapanta Ayala P1

complementaria a la secuencia del molde. Mediante esta tecnología, se puede determinar

la secuencia de moléculas de ADN de hasta 800 nucleótidos de longitud.
Los años siguientes se efectuaron mejoras en este último gran avance, aumentando así su
eficiencia, lo que se incorporó fueron de las técnicas fluorescentes, el diseño de
fluoróforos, el avance en enzimología y la introducción de la electroforesis capilar. El
método de Sanger automatizado mejoro la técnica en tres principales aspectos: El uso de
ddNTPs marcados con cuatro fluoróforos distintos favoreciendo la reacción del proceso
en un solo tubo, la utilización de la técnica de PCR para llevar a cabo la reacción de
polimerización y la incorporación de la electroforesis capilar en un gel de poliacrilamida
permitiendo que cada fragmento que acababa de ser secuenciado, tras ser interrumpido
por un ddNTP marcado por el correspondiente fluoróforo, avanzara por el gel a través de
un tubo capilar. Cuando dicho fragmento pasaba a través de la cámara detectora, el
fluoróforo era excitado con un láser, emitiendo una fluorescencia de un color
determinado. De esta manera la determinación del color permitía asignar el nombre de la
base correspondiente y el orden de las emisiones revelaba la secuencia del ADN. (Heather
y Chain, 2015)
Finalmente, los secuenciadores didesoxi más nuevos desarrollados por Hood, como la
gama ABI PRISM permitían la secuenciación simultánea de cientos de muestras.

Secuenciación de ADN de segunda generación

Simultamente a este último avance de los secuenciadores didesoxi apareció una técnica
iniciada por Nyren y sus colegas denominada la pirosecuenciación, el cual es un método
enzimático de síntesis porque la secuencia del molde es determinada a medida que se
sintetiza la hebra complementaria. Este consiste en un proceso de dos enzimas en el que
se usa ATP sulfurilasa para convertir el pirofosfato en ATP, que luego se usa como
sustrato para la luciferasa., produciendo así luz proporcional a la cantidad de pirofosfato.
Los beneficios de esta técnica es que se pueden utilizar nucleótidos naturales y pueden
ser observados en tiempo real. Las mejores siguientes fueron unir el ADN a perlas
paramagnéticas y degradar enzimáticamente los dNTP no incorporados para eliminar la
necesidad de largos pasos de lavado. Este método obtuvo más tarde la licencia de 454
Life Sciences y se convirtió en la primera tecnología comercial exitosa de "secuenciación
de próxima generación" (NGS). (Vasquez, 2016)
La secuenciación masiva en paralelo aumento la cantidad de ADN que se puede
secuenciar en cualquier ejecución. La primera máquina de secuenciación de alto
rendimiento (HTS) fue la máquina 454 original, llamada GS 20, que luego fue
reemplazada por la 454 GS FLX, que ofrecía un mayor número de lecturas así como datos
de mejor calidad. La técnica 454-pirosecuenciación se produce cuando se lavan sobre la
placa enzimas unidas a perlas más pequeñas y los dNTP, y se mide la liberación de
pirofosfato usando un sensor de dispositivo de par cargado (CCD) debajo de los pocillos.
Esta configuración fue capaz de producir lecturas de alrededor de 400-500 pares de bases
(pb) de largo, para el millón de pocillos que se esperaría que contuvieran perlas con
recubrimiento clonal adecuado. Tras el éxito de esta técnica surgieron otros métodos,
entre estos están el método de secuenciación Solexa denominado tambien la
'amplificación en puente'. Para la secuenciación se utilizan cuatro nucleótidos con
terminadores reversibles y cada ciclo tiene lugar con los cuatro nucleótidos
Nombre: Maoly Toapanta Ayala P1

simultáneamente. Se realiza en un sistema conocido como Genome Sequencer FLX y se

lleva a cabo de la siguiente manera: utilizando dNTP fluorescentes de "terminación
reversible", luego estos dNTP modificados y ADN polimerasase lavan en ciclos sobre los
grupos unidos a celdas de flujo de una sola hebra cebados. En cada ciclo, la identidad del
nucleótido incorporado se puede controlar con un CCD excitando los fluoróforos con
láseres apropiados, antes de la eliminación enzimática de los restos fluorescentes de
bloqueo y la continuación a la siguiente posición. Invertida la orientación de las cadenas
de ADN con respecto a la celda de flujo, se obtiene una segunda lectura desde el extremo
opuesto de las moléculas al primero. Como las moléculas de entrada tienen una longitud
conocida aproximada, tener datos de PE proporciona una mayor cantidad de información.
La versión estándar del analizador de genomas (GAIIx) fue seguida más tarde por HiSeq,
una máquina de menor rendimiento (pero de menor costo) con un tiempo de respuesta
más rápido y longitudes de lectura más largas. (Heather y Chain, 2015)
Una de las empresas de secuenciación que tuvo impacto en lograr la secuenciación fue
SOLID de Applied Biosystems, el cual era un sistema de secuenciación por ligación y
detección de oligonucleótidos, utilizando una ligasa de ADN. Sin embargo este método
no es capaz de producir la longitud y profundidad de lectura de las máquinas Illumina, lo
que dificulto su montaje. Otra tecnología notable basada en la ligación secuencia por
ligadura fue la técnica de 'nanobolas de ADN' de Complete Genomic, donde las
secuencias se obtienen de manera similar a partir de la ligadura de la sonda, pero la
generación de la población de ADN clonal es nueva, donde se utiliza la amplificación de
círculo rodante para generar largas cadenas de ADN que consisten en unidades repetidas
de la secuencia de la plantilla bordeadas por adaptadores, que luego se autoensamblan en
nanobolas, que se fijan a un portaobjetos para secuenciarlas. Una última secuenciación
notable de segunda generación es la desarrollada por Rothburg y fue llamada
"secuenciación posterior a la luz", ya que no utiliza ni fluorescencia ni luminiscencia. En
este método las perlas que llevan poblaciones clonales de fragmentos de ADN se lavan
sobre una placa de picopozos, seguidas de cada nucleótido sucesivamente; luego la
incorporación de nucleótidos se mide por la diferencia de pH causado por la liberación
de protones (iones H + ) durante la polimerización, que fue posible gracias a los chips de
microprocesador. Esta tecnología permite una secuenciación muy rápida durante la fase
de detección real sin embargo es menos capaz de interpretar fácilmente las secuencias de
homopolímeros. Por ello la plataforma más exitosa en la segunda generación de
secuenciadores de ADN fue la secuenciación de Illumina por su gran contribución.
(Vasquez, 2016)

Secuenciación de ADN de tercera generación

Las tecnologías de tercera generación son aquellas capaces de secuenciar moléculas
individuales, negando el requisito de amplificación del ADN compartido por todas las
tecnologías anteriores.
El primer secuenciador de tercera generación SMS lo comercializo Helicos BioSciences
y se basa en la secuenciación a tiempo real de miles de millones de pequeñas moléculas
únicas de ADN adheridas a una superficie sólida. Permite generar de forma confiable
fragmentos de entre 25 y 45 bases. Dada la pequeñez de las lecturas generadas, esta
tecnología está recomendada para la resecuenciación de genomas y no para la
Nombre: Maoly Toapanta Ayala P1

secuenciación nueva. Luego de quebrar Helicos surgió la tecnología de la plataforma de

tiempo real de una sola molécula (SMRT) desarrollada por la empresa Pacific Biosciences
la cual es capaz de leer hasta 1000 nucleótidos. Esta técnica está anclada a una superficie
sólida de la ADN polimerasa produciendo así datos cinéticos, lo que permite la detección
de bases modificadas. La deposición de moléculas de ADN polimerasa individuales
dentro de las ZMW las coloca dentro de la región iluminada, lavando la biblioteca de
ADN de interés y dNTP fluorescentes, la extensión de las cadenas de ADN por
nucleótidos individuales se puede monitorear en tiempo real, ya que el nucleótido
fluorescente que se incorpora, y solo esos nucleótidos, proporcionará fluorescencia
detectable, después de lo cual el tinte se escinde, terminando la señal para ese posición.
Otra tecnología, encuadrada en los secuenciadores de tercera generación, es la
desarrollada por ZS Genetics, que utiliza la microscopia electrónica y permite leer la
secuencia del ADN directamente sobre una imagen electrónica. La lectura de la secuencia
requiere de la replicación previa de una hebra molde de ADN para poder marcarla con
bases modificadas con yodo, bromo o triclorometilo antes de analizarlas.(Bautista, 2010)
Gracias al avance de la nanotecnología y la microscopia electrónica se ha podido reducir
la cantidad de reactivos necesarios para efectuar las reacciones de secuenciación.
Probablemente con los estudios efectuados por el Covid-19 muy pronto se pueda hacer
real la capacidad de secuenciar de forma confiable el genoma humano en un tiempo
récord a bajo costo.(Bautista, 2010)

Referencias Bibliográficas
▪ Bautista R, (2010). Les tres generaciones de la secuenciación. Obtenido de:
https://www.researchgate.net/publication/44708460_Las_tres_generaciones_de_
la_secuenciacion
▪ Heather J., Chain B.(2015) The sequence of sequencers: The history of
sequencing DNA. Obtenido de:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0888754315300410
▪ Vasquez A. (2016) Técnicas de secuenciación de nueva generación para el estudio
del microbioma humano. Obtenido de:
http://147.96.70.122/Web/TFG/TFG/Memoria/ANDREA%20VAZQUEZ%20E
SCRIBANO.pdf
▪ Universidad de País Vasco. Obtenido de:
http://www.ehu.eus/biofisica/juanma/bioinf/pdf/tema_2a.pdf