UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA

BIOLOGIA MOLECULAR

INTRODUCCION A LA INGENIERIA
GENETICA: LOS VECTORES DE ADN Y
LAS ENZIMAS DE RESTRICCION

LA TECNOLOGÍA DE ADN
RECOMBINANTE

Esta presentación se ha elaborado con el aportes de Dr. Juan C. Tantaleán

diversos autores y no tiene fines de lucro. Se agradece su
contribución a la enseñanza de la Biología Molecular
 HERRAMIENTAS EN INGENIERIA GENETICA

A. VECTORES DE ADN

Un vector
Cualquier vehículo, a menudo un virus o un plásmido que se utiliza para
transportar una secuencia de ADN hacia una célula huésped deseada,
como parte de un procedimiento de clonación molecular. Dependiendo
de la finalidad, el vector puede ayudar a multiplicar, aislar, o expresar el
inserto de ADN extraño.

Son “vehículos” para conducir o transportar secuencias de DNA hacia el

interior de una célula.
Entre ellos: plasmidios, bacteriófagos, cosmidios, cromosomas artificiales.

https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Vector
I. PLASMIDIOS:
· Moléculas circulares de DNA extracromosomal de 1 a 250
kb, se autorreplican.
· Se encuentran en bacterias (1 a varios cientos) y en
levaduras.
· Algunos codifican genes de resistencia a metales a antibióticos,
toxinas, rutas metabólicas, .
· Pueden transportar insertos de 5 kb en promedio.
 GRUPOS DE INCOMPATIBILIDAD EN LOS PLASMIDIOS (Inc)

Dos plasmidios son INCOMPATIBLES y no pueden coexistir

de manera estable en una misma célula porque comparten
el mismo mecanismo de control de la replicación
Dos plasmidos son COMPATIBLES si tienen diferente
mecanismo de control de replicación

NUMERO DE PLASMIDIOS EN UNA CELULA

 Alto número de copias: 300 hasta 500

 Bajo número de copias: 1 o 2

Origen de replicación: ejerce un control sobre el número de copias

del plásmido en la célula:
- control relajado (alto número de copias, se regula por ARN y ARN
antisentido)
- control astringente (bajo número, interviene la proteína del gen
repA)
 LOS PLASMIDIOS COMO VECTORES
 Tamaño pequeño de 3 Kb.
 Carecer del gen mob (conjugación)
 Origen de replicación: OriC
 Deben expresar marcadores fenotípicos o de selección (genes
de resistencia a antibióticos: Amp, Tet, Kan).
 Secuencias de DNA que pueden ser sustituidas por DNA
exógeno.
 Llevar sitios de restricción o policlonaje (MCS, polilinker).
 TIPOS DE PLÁSMIDOS

a. P. Vectores:
- Poseen sitios simples de corte por ER.
- Marcadores de selección.
- Son utilizados para un amplio rango de huéspedes.
Vectores de clonamiento: pBR322, pSK+, pUC18.
Vectores de expresión: pET21.
b. P. Movilizables:
- Se trasladan utilizando el aparato conjugativo de otros plásmidos.
Ejm: RP1, RP2, RP4

c. P. Conjugativos:
- Tienen capacidad de transferirse de una célula donadora a
otra
receptora.
Ejem: pF (K-12), pTi
- Parecidos a F : Poseen resistencia a fármacos.
Ejm: R 100.

d. P. Replicativos:
- Plásmidos naturales.
- Bajo número de copias.
- Baja capacidad de clonamiento.
Ejm: pRK290.
 II.BACTERIOFAGOS O FAGOS

El fago Lambda .
• DNA de doble cadena, lineal.
• Tamaño de 48.5 kb.
• Recibe tamaños de insertos de 18 a 25 kb.
• Poseen sitios de reconocimiento donde
se inserta el DNA exógeno.
• El empaquetamiento se realiza in vitro.
• F Fago  + DNA foráneo
Bacteriófago M13. su replicación no produce lisis a la bacteria.
- inconveniente que sólo permiten la secuenciación en una única
dirección.
III. LOS COSMIDOS.

• Plasmidio + secuencia cos del Fago  =

COSMIDO
• Tamaño de 5 kb.
• Creados para clonar fragmentos largos de DNA.
• Recibe tamaño de insertos entre 40 y 45 kb.
 IV. VECTORES DE ALTA CAPACIDAD

Llevan insertos grandes de DNA ( > 50 kb).

Entre ellos:
 Cromosomas artificiales de levaduras ( YAC)
(llevan insertos de > 200 kb).
 Cromosomas artificiales de bacterias
( BAC), (> 300 kb)
 Cromosomas artificiales de P1 (PACs), (>
350 kb). Puede producir deleciones en el DNA
exógeno.
B. LAS ENZIMAS (ENDONUCLEASAS) DE RESTRICCIÓN (ER)

Corte del ADN en secuencias especificas.

Endodesoxiribonucleasas.
 Reconocen y cortan el DNA en secuencias específicas (4 a 8 pb).
 Se encuentra en bacterias (eubacterias y arqueobacterias).
 Se nombran de acuerdo a la especie de donde proviene y Nº romano para
distinguir enzimas diferentes.
 CLASIFICACIÓN DE LAS ER

CLASE I:
- no cortan en los sitios de reconocimiento, sino a una distancia de
varios nucleótidos.
- Expresadas por tres genes.
- Funciones: cortar el DNA y modificar el DNA.
- Requiere de iones de Mg, ATP y SAM

CLASE III : Expresados por dos genes y sus funciones son

semejantes a la
clase I.
 ENZIMAS DE RESTRICCION DE LA CLASE II:
- Reconocen y cortan el DNA en secuencias específicas.
- El sistema de restricción- modificación es expresado por dos genes diferentes y expresan
dos enzimas.
a. Las ER clase II:
Cortan ambas tiras del DNA.
Requiere de iones de Mg.
b. Metiltransferasa clase II: produce modificación del DNA en forma
independiente.
 RECONOCIMIENTO DE SECUENCIAS DE ADN POR LAS
ER.

PALINDROMO: secuencia de caracteres que se lee lo mismo de derecha a izquierda y al

contrario.

Secuencias palindrómicas: secuencias del DNA con un eje de simetría repetitivo:

Ejm:
Eco RI CORTE ESCALONADO 5’ .............G AA T T C.........3’
Y EXTREMOS COHESIVOS 3’ ........... C T T A A G........5’

CORTE
Hpa I CON EXTREMOS ROMOS 5’ .............GTT AA C ..........3’
3’ ............. CAA TTG ...…...5’
 ACTIVIDAD DE LAS ER DE LA CLASE II

a. UNIDAD DE ENZIMA:
Cantidad de enzima que digiere 1 ug de DNA en 1 hora a 37 ºC.
b. PARÁMETROS DE REACCIÓN:
Temperatura (el óptimo corresponde a la Tº del organismo), pH y fuerza
iónica.

FACTORES QUE AFECTAN LA ESPECIFICIDAD DE LAS ER DE LA CLASE II.

1. Secuencia de reconocimiento en el ADN.

3. Influencia de la metilación en las secuencias de reconocimiento.
4. Contenido de Guanina/Citosina y distribución de las bases.
5. Tamaño del DNA y ubicación de la secuencia de corte.
6. Estructura terciaria del DNA.
7. Ataque por enzimas.
 Mapas de restricción
Ubicación de los sitios de corte con ER

Mapa de restricción
de pBR322
 UNION DE FRAGMENTOS
DE RESTRICCION

Extremos compatibles se generan

cuando se corta con la misma enzima.
Union de fragmentos cortados con la enzima EcoRI
 USOS DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCION

1. Preparación de ADN recombinante.

2. Uso en marcadores moleculares o variabilidad genética: RFLP, AFLP .
3. Evidenciar defectos genéticos o alteraciones de secuencias.
FIN