ADN y sus aplicaciones

biotecnológicas
Flujo de la información
Aplicaciones del ADN
recombinante.

William J. Thieman, Michael A. Palladino (2010). Introducción a la Biotecnología. 2ª Edición.

 Técnicas de Ingeniería genética

El desarrollo de estas
técnicas ha tenido como
objetivo fundamental el
aislamiento de genes
discretos a partir de los
genomas de los seres vivos,
unicelulares o pluricelulares,
tanto procariontes como
eucariontes, para su estudio
en el laboratorio. http://profedenaturales.blogspot.com/2012/06/experime
nto-o-proyecto-clasico-de.html
 ¿Para qué estudiar y manipular el ADN?

La identificación de marcadores
genéticos o fragmentos
específicos nos permiten
detectar alteraciones o
mutaciones de ciertos genes,
así como aislar un gen de
interés.

Marcadores moleculares por Gabriela Iglesias

 Una biblioteca de ADNc
representa una colección
de solo los genes que un
Librerías de ADNc
organismo codifica en
proteínas. El ADN
complementario, o ADNc,
se crea mediante la
transcripción inversa del
ARN mensajero y se
genera una biblioteca de
ADNc utilizando tecnología
de clonación de ADN.
Enciclopedia Británica (2002)
www.britannica.com
 Metodología general

1) Aislar y purificar el ADN del gen de interés.

2) Cortar y unir a otro tipo de molécula de ADN
(vector) para la transferencia al organismo de
producción.
3) Introducir el vector dentro de la célula hospedera.
4) Verificar, en la célula hospedera, la correcta
adquisición del ADN y la expresión del gen de
interés.
5) Cultivar la célula en grandes cantidades para su
producción.
Extracción de ADN
 Restricción y modificación

• Los sistemas de restricción

permiten a las bacterias
monitorear el ADN entrante y
destruirlo en su caso.

• Las endonucleasas realizan

esta acción reconociendo
secuencias especificas y
cortando el ADN en
fragmentos.
Tipos de sistemas de Restricción – Modificación
 Endonucleasas de restricción
• Las endonucleasas de tipo II son las útiles para la manipulación de
los genes.
• La ventaja de estas enzimas es que cortan en un sitio especifico y
no requieren cofactores.

William J. Thieman, Michael A. Palladino (2010). Introducción a la Biotecnología. 2ª Edición.

 Sitios de reconocimiento

• Estas enzimas reconocen y dividen el ADN dentro de

secuencias particulares de cuatro a ocho nucleótidos
que tienen un doble eje de simetría rotacional. Tales
secuencias se denominan a menudo palíndromos.
• Algunas enzimas de restricción realizan cortes en el eje
de simetría en ambas cadenas generando extremos
romos y otras cortan en zigzag creando extremos
cohesivos o pegajosos.
Enzimas de restricción
 Ligación de moléculas de ADN

Para unir fragmentos de ADN

se pueden tener tres opciones:
• Utilizar la capacidad de la
ADN ligasa para unir
covalentemente los
extremos cohesivos
alineados.
• Utilizar la ligasa del fago
T4 para catalizar la
formación del enlace
fosfodiéster entre los
extremos romos.
Ligación de moléculas de ADN

• El tercero utiliza la enzima terminal

desoxinucleotidiltransferasa para
sintetizar colas monocatenarias 3‘
homopoliméricas en los extremos de
los fragmentos.
 Amplificación de ADN

Requiere de cantidades extremadamente pequeñas de ADN

genómico para la experimentación, pero la amplificación se
limita a pequeños fragmentos y algún conocimiento previo
de la secuencia.
 Amplificación de ADN

La amplificación de ADN
se basa en la replicación
natural del ADN, por lo
cual se necesita
forzosamente un primer o
cebador para que la DNA
polimerasa empiece a
trabajar.
Amplificación de ADN
Reacción en cadena de la polimerasa

 La amplificación debe de ser

selectiva. Para poder realizarla
se hace uso de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR
por sus siglas en inglés). Kary B.
Mullis fue galardonado con el
premio Nobel en 1993 por este
invento.
 Reacción en cadena de la polimerasa
La amplificación por PCR usa la DNA polimerasa y un par de
oligonucleótidos sintéticos de tamaño pequeño (primers),
usualmente de 18–22 nucleótidos de longitud que son
complementarios al final de la secuencia de ADN que se
quiere amplificar.
Reacción en cadena de la polimerasa
 Electroforesis en gel
El movimiento de moléculas cargadas en un campo
eléctrico es llamado electroforesis.
 Electroforesis en gel

William J. Thieman, Michael A. Palladino (2010). Introducción a la Biotecnología. 2ª Edición.

Electroforesis en gel
 Hibridación

Requieren una gran

cantidad de ADN genómico
para la experimentación,
pero se pueden identificar
fragmentos relativamente
grandes y no se necesita
conocer previamente la
secuencia.
Hibridación del ADN

Para poder hibridar el

ADN, este requiere ser
desnaturalizado para
permitir abrir la doble
cadena.
 Hibridación del ADN

Un fragmento de ADN
puede unirse a fragmentos
similares de otros genes en
el mismo genoma.
Hibridación del ADN

Un fragmento de
ADN puede unirse
con secuencias
similares
provenientes de otras
especies.
Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)
 Southern Blot

La técnica de cortar el ADN,

realizar una electroforesis,
transferirlo a nitrocelulosa e
hibridizar contra una prueba, todo
combinado se conoce como
Southern blot, nombrado en
honor a su inventor Edwin
Southern.
Southern Blot
Blotting
 Vectores

• Un vector se define como una

molécula de ADN de doble
cadena (DNAds), con capacidad
de albergar un fragmento de
ADN exógeno (de otro origen).

Clasificación de vectores
• De acuerdo con su uso, los
vectores se clasifican en
vectores de clonación y
vectores de expresión.
 Ligación de moléculas de ADN

William J. Thieman, Michael A. Palladino (2010). Introducción a la Biotecnología. 2ª Edición.

Inserción del ADN en
un vector

William J. Thieman, Michael A. Palladino (2010). Introducción a la Biotecnología. 2ª Edición.

Inserción de ADN en la célula
Inserción de ADN en la célula
Title

William J. Thieman, Michael A. Palladino (2010). Introducción a la Biotecnología. 2ª Edición.

William J. Thieman, Michael A. Palladino (2010). Introducción a la Biotecnología. 2ª Edición.
 Características de un vector

• Tamaño: deberían ser lo suficientemente pequeños como para que

se puedan separar fácilmente del DNA cromosómico de la bacteria
hospedadora.
• Origen de la replicación (ori) y no. de plásmidos: Deben de
tener un ori. Muchos de los plásmidos de clonación más deseables
se conocen como plásmidos de alto número de copias porque se
replican para crear cientos de miles de copias de plásmidos por
célula.
 Características de un vector

• Sitio de clonación múltiple

(MCS): el MCS, también
llamado polylinker, es un
fragmento de DNA con
secuencias de
reconocimiento para muchas
enzimas de restricción
comunes diferentes.
 Características de un vector

• Genes marcadores que se puedan seleccionar: estos genes

permiten la selección e identificación de bacterias transformadas
mediante un plásmido recombinante en comparación con las
células no transformadas. Algunos de los marcadores más
comunes que se pueden seleccionar son genes de resistencia a la
ampicilina (ampR) y a la tetraciclina (tetR) y el gen lacZ utilizado
para la selección azul-blanca.
 Características de un vector

• Secuencias del promotor de RNA polimerasa: se utilizan estas

secuencias para la transcripción del RNA in vivo e in vitro por la
RNA polimerasa.
• Secuencias de cebadores (primers u oligonucleótidos) para
la secuenciación del DNA: estos cebadores permiten la
secuenciación de nucleótidos de fragmentos de DNA clonado que
hayan sido insertados en el plásmido.
Operon Lactosa
Gen eucariota