TÉCNICAS DE PCR

(Reacción en Cadena de la Polimerasa)

I. Objetivos:
• Comprender el principio de la PCR, la función de cada reactivo y las diferentes etapas a
nivel experimental.
• Realizar un acercamiento al diseño de oligonucleótidos mediante herramientas de uso
libre.
• Analizar e interpretar resultados de casos de estudios que se resuelven mediante la
técnica de PCR.

II. Material Audiovisual:

Para ilustrar de manera práctica el proceso de un montaje de PCR en el laboratorio revise el

siguiente material:

Video 1: https://www.youtube.com/watch?v=mslMRgxbdOA (7.46 min)

Video 2: https://www.youtube.com/watch?v=whJTMyyV7gU (4.46 min)

Interactivo PCR: https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/

Interactivo electroforesis (opcional): https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/

Tome nota de dudas o inquietudes para socializarlas con los compañeros y docente a cargo.

III. PROCEDIMIENTO

Diseño de oligonucleótidos (primers o cebadores)

1
Caso de estudio: Un ganadero le interesa conocer si en su hato cuenta con ejemplares que
puedan poseer la variante alélica B para el gen kappa-caseína (CSN3), la cual está asociada a
la calidad de la leche. Después de una revisión de las publicaciones sobre el tema usted
encuentra que no existe reporte de primers específicos para este gen, por lo tanto, mediante
recursos bioinformáticos gratuitos usted debe diseñar una pareja de primers para amplificar
una región del gen CSN3. Posteriormente, en el laboratorio usted debe identificar las
condiciones óptimas de amplificación de los primers (temperatura de alineamiento,
concentración de MgCl2 y tamaño específico del fragmento amplificado). Es así como debe
realizar los cálculos necesarios para realizar una PCR y determinar la temperatura de
alineamiento de los primers diseñados.

Contexto general del gen kappa-caseína: La caseína representa el 80% de las proteínas de la
leche, conformada por 169 aminoácidos que contiene regiones variables (11 variantes
alélicas), las cuales presentan diferencias nucleotídicas que llevan a la expresión de
aminoácidos diferentes dentro de la proteína. De las 11 variantes alélicas, los alelos Ay B son
los más frecuentes, pero la variante B se ha asociado con un aumento en el rendimiento y
calidad de los quesos en comparación con la variante A. Los productos elaborados con la
variante B poseen mayor contenido proteico, menor tiempo de coagulación (de 60 a 53 min)
y cerca del 5 al 10% más rendimiento (Barrientos et al., 2011; Gutiérrez et al., 2011). Por
consiguiente, las técnicas moleculares son una herramienta útil para realizar estudios de
polimorfismo genético en bovinos que poseen características productivas.

Tenga presente los siguientes aspectos durante el diseño de los primers (Giorgio, 2020;
Lorenz, 2012):

1. Los primers deben tener una longitud de 15-30pb. Óptimo 20 pb.

2. El contenido de G-C debe estar alrededor del 40-60%.
3. La temperatura de fusión (Tm) de los primers debe estar idealmente entre 52 y 58°C,
pero puede expandirse en un rango de 45 a 65°C. El Tm final de ambos primers (forward
y reverse) deben ser cercanos, no diferir por más que 5 °C, ya que estos deben alinear
simultáneamente durante la fase de alineamiento con el ADN molde.
4. Se deben evitar secuencias de tres o más C’s o G’s en las regiones terminales 3'.

2
5. Las terminaciones 3' no deben ser complementarias, ya que esto puede llevar a la
formación de dímeros.
6. Minimizar o evitar la presencia de poli-X (repeticiones de un mismo nucleótido).
7. Deben evitarse los primers que formen secuencias auto-complementarias (hairpins), es
decir que formen estructuras secundarias internas (ej. AGGT-ACCT).
8. Se pueden agregar degeneraciones en algunas posiciones del primer, pero se incrementa
el riesgo de amplificar fragmentos inespecíficos.

1. Diseño de primers con Primer3:

Esta herramienta permite detallar el rango de tamaños del producto y especificar

parámetros mínimos de los primers deseados como temperatura de alineamiento (Tm),
porcentaje de GC, máxima auto-complementariedad, entre otros. Ingrese a Primer3
https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm

Figura 1. Visualización de Primer3

Nota: cuando deslice la ventana del navegador hacia abajo, no se sienta abrumado por la
cantidad de parámetros que se encuentran, la mayoría de estos parámetros rara vez se
modifican. En caso de que tengas dudas sobre algún parámetro, haz clic sobre el parámetro
mientras presiona simultáneamente la tecla Ctrl, y este desplegará una nueva ventana con
información al respecto.

En el espacio en blanco pegue la secuencia en formato FASTA o adjunte un archivo (Figura

1). Esta secuencia nos servirá de referencia para diseñar los primers con el fin de amplificar

3
un fragmento del gen de la kapa-caseína en Bos taurus (número de acceso en el Genbank:
AY380229) para el alelo B.
TTAGTTTTATTTTACTCCTGTTCACACACAAAAACAGTAAAATACAGTGTCAACTCATGATTTTTCTTATCTCAAAAATATG
TTTTCTTAGAAAAAAATCATATAGGATATGAGTTTAAATATATTTTAATTGTATACCAGTGTTGTTGCACTCTACTTTTGGT
AAGAATAGAATGAAAGGAAACAATGTTTCACTCATAGCATTTTATCTCAGGCATCACTTCTGAAAGGATGTATAAGGTTA
GGCACCCAAATTTCTCCTATTGTAAGGTAATCCCACAGAAAAATTCTAATTTTTAACTTGAAAAGCACCTACTTATTAAGA
GGAAACTTTCAGAACTTTAAATATAATGTAAAATATGTCTATTTATTATTTGAATCAATGGATAATGGCAGAGTCCAAAAT
AATTTAAAACACATGAAGAGGTTAAACAGAAAGATCAATAAGATAGAAAATAACTAAAGATTGTGAAATAATTTAGGAA
GAAAGTGACAACATTTTGAGATGCTAGGCAACAAATACTTTCATCACACTGTCTACATGATTTTTGGTCTAAAATGAACTC
AGCATGATATAATGGTAATAGCAATAGATCAGAGAAGCCTGGTTCTTCTGTTGTGTGACTTTAAGCAATTCATTACTCTCT
CTAAAGAGTCATCACTCTCATTTTCTCATAATTTTGGTTGCTATGAGATTCAAGTGAGAAAGCATATTGTGAATGAGGTGT
AAAAAGCAATCAATCTGTGAAATATAATGCTCTAGAAAAGAAGTATAATTAGTAAATATTAAAATTTACTTTCAACTAAAA
TATCAAGTCCTTACTAAATTATCAAAACTACATAACAATCTCAGTTTAATCCTGTAGCAGCCATATGGAATGGATTATATT
ACCATCTTAAATCCACAAATGAAAGCTATGGATGCAAATTGCTACAGCTGAAAGTTCAAAACTGGAAACCAAATCAAACT
TGCTTGATTTCAGATAGTAAGGCTTAATTAGTACGTCTGCTATTTCCATATGGGCTATTTGTTAAAAAAAATAAAAATAAA
AACAGAAAACATACTCTAATTTTCCAAGATCAGCATATGTGTAAATTTTATTACTGAGATTGTGTTTAATAGGACATCTGG
TAAGAAAGAGAAGACAATAAGCTGATAAATCTTTGACTCATTAAAATTTCAAAAAGAAAATGAAAAAATTAATGGACACA
AAATGAAAACAAGTAATTGAGTATGCAACTATCTATTTTATTGATATGAAATACATTATATTTACATGATTGTTTTTAATAA
AATAATCATTATCTCAATAGTCAACATTTGTTCAAAACTCAAGAACCTAGATTCCTAAGTTAAAACCACACAGTATAAGAT
CACTTATAAAAAAAGAATGTATAGGACTGTGTCTTTCTGTGAATATTAGATGAAGACAATTGTATCAGTTCACTATGTGGT
GAATTTAAATATTTAAATTTATATATTTAGTTAGATAAACTACTTGGATACAGACATGAAGCAAATCACGGAAGCTAAATA
AAATACATATCATGAGAACTGTTAGCACATTGTGAACTAAATCTCTAAACTGTCATTTTTATAGGTTTAGCTGAAACTGAA
TGACTACTTCAAACTTTCCTTTGGCCAGTTGTCTGCCTTCAGTGAACAGAGAATATGATTTTCACAGATCCGGCTCCTTTCT
CGTCTCCTCTTACATTTTACTTTTATGCCAGATTTAGTTTTTTGATTCCTGCATAATAAAGCCAATCAAATGCAATGGATCT
CTTTTCTTTTTTAATTTATTTATTTTAATTGGAGGCTAATTACTTTACAATATTGTATTGGTTCTACCACACATCAACATGAA
TCTGCCACGGGATACACGTGTTCCCCATCCTGAACC

Para nuestro acercamiento al diseño de primers mediante esta herramienta utilizaremos un

conjunto de condiciones mínimas, solo elija un tamaño esperado del producto de PCR de
600-900pb (Product Size Range) y presione “Pick Primers”.

Figura 2. Parámetros Primer3

4
Primer3 por defecto arroja como resultado una opción principal de primers y cuatro opciones
más que se visualizan en la parte inferior de los resultados. Para cada par de oligonucleótidos
encontrará la siguiente información: la posición (start), el tamaño (len), la temperatura de
melting o alineamiento (Tm) y el porcentaje de GC (GC%) están presentes. Adicionalmente,
any indica la tendencia de los primers a hibridar entre ellos o máxima Complementariedad
(auto-complementariedad), y 3’ es un puntaje máximo permisible cuando se testea la
complementariedad entre los primers indicando la probabilidad de generación de dímeros
de primers durante la reacción de PCR.

Registre y guarde los resultados de la primera opción de pareja de primers que el programa
le haya arrojado.

2. Diseño de primers con Primer Blast:

Ingrese a Primer Blast https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/.

Figura 3. Visualización Primer-Blast

Nota: En el espacio en blanco pegue la secuencia en formato FASTA o adjunte un archivo
proporcionada en la sección A.

Cuando deslice la ventana hacia abajo encontrará los diferentes parámetros generales que
emplea la herramienta para generar los primer, y en la parte final podrá desplegar la opción
“Advanced parameters” (Figura 4) para visualizar los parámetros de los primers.

5
 Figura 4. Parámetros Primer-Blast

Para nuestro acercamiento al diseño de primers mediante esta herramienta utilizaremos un

conjunto de condiciones mínimas. Solo necesita ajustar el tamaño esperado del producto de
PCR a 600-900pb y presionar “Get Primers”. Podrá visualizar los resultados en una ventana
adicional si activa la opción “Show results in a new window”.

Registre y guarde los resultados de la primera opción de pareja de primers que el programa
le ha generado.

Nota: No olvide aplicar los diferentes aspectos que debe tener en cuenta para el diseño de
primers que se encuentran al comienzo de esta guía.

3. Comparación entre Primer3 y Primer-Blast.

Responda las siguientes preguntas:

6
a. ¿Los primers generados cumplen con las características principales de %GC, Tm,
autocomplementariedad?
b. ¿Los fragmentos generados presentan el mismo tamaño? ¿Qué tanto difieren?
c. ¿Los primers amplifican fragmentos similares o parcialmente iguales? Observe las
posiciones en las que alinean los primers.

4. Cálculos de Master Mix y perfil térmico.

a. Cálculos máster mix.

A partir de los primer diseñados durante el desarrollo de la segunda parte de la práctica,
usted requiere realizar una PCR para verificar de forma experimental la especificidad de
los primers junto con un gradiente de temperatura de alineamiento. Realizar los cálculos
para los componentes de una reacción de PCR con un volumen final de 10l. Las
concentraciones finales sugeridas por el fabricante del kit de Taq polimerasa (Thermo
scientific #EP0401) sugiere las siguientes concentraciones finales para cada uno de los
componentes: Buffer 1X, MgCl2 1.5 mM, dNTPs 0.2 mM, primer 0.2 μM (cada uno) y
1.0U de Taq polimerasa. Adicionar 1ul de ADN con una concentración de
aproximadamente 20–50 ng/µl. Emplear la fórmula C1V1=C2V2 para realizar los cálculos.
Inicialmente realice los cálculos para una reacción y luego estime el cálculo final para el
total de las reacciones que requiere realizar: 5 temperaturas (50, 52, 54, 56 y 58 °C), y
control negativo de PCR (agrega agua en lugar de ADN).
[I] 1 rxn (µl) ___ rxn (µl)
Buffer 10X
MgCl2 25mM
dNTPs 10mM
Primer f 10uM
Primer r 10uM
Taq Pol 5U/µl
H 2O
ADN 1
Mix 9
TOTAL 10.0 µl

7
 b. Perfil térmico.
Indique qué sucede en cada paso del perfil térmico. Con la ayuda de la figura 5,
determine la temperatura de alineamiento óptima, si el tamaño esperado del fragmento
amplificado es de aproximadamente 400 pb.
Temp. Número
Paso Tiempo ¿Qué sucede en cada paso?
(°C ) de ciclos
1 94 5 min
2 94 30s
3 45s 35
4 72°C 50s
5 72°C 10min

Figura 5. Gel de agarosa 2% con un gradiente de temperatura

Temperatura óptima: ________. Explique su respuesta: _________________________

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

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REFERENCIAS

Barrientos S, Echeverri J, Ospina D, Lopez A. 2011. Marcadores moleculares asociados a

características de calidad de los productos lácteos y cárnicos. En: Marcadores
moleculares en producción bovina. Edición Julián Echeverri y Albeiro López. pag 85.

Giorgio E. 2020. Introducción al diseño de primers. aulavirtual-exactas.dyndns.org.

http://www.aulavirtual-
exactas.dyndns.org/claroline/backends/download.php?url=L0Z1bmRhbWVudG9zX3
Rl83JpY29zX2RlX2xhX3JlYWNjafNuLnBkZg%3D%3D&cidReset=true&cidReq=BIOINF
O

Gutiérrez C, Echeverri J, López A. 2011. Marcadores moleculares asociados a la producción

lechera. En: Marcadores moleculares en producción bovina. Edición Julián Echeverri
y Albeiro López. pag 85.

Lorenz, T. C. 2012. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and
optimization strategies. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (63), e3998.