1UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA EN INGENIERÍA EN ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGIA

INGENIERÍA GENÉTICA
DATOS INFORMATIVOS:

Integrantes: Solis Juan Carrera: Ingeniería Bioquímica

Asignatura: Ingeniería Bioquímica
Profesor: Doc. Daniel García
Fecha de Presentación: (27/ 05/ 2020)
TEMA:

“Diseño de primers y simulación del proceso de PCR utilizando herramientas

tecnológicas.”
I. OBJETIVO GENERAL
 Aplicar herramientas tecnológicas como Praxilabs, NEB Tm Calculator y otra
afín para el diseño de primers y su lectura en PCR.
II. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Demostrar que el instrumento tecnológico NCBI es adecuado para la
producción de primers.
 Explicar el uso de praxilabs para correr un PCR en tiempo real, como
herramienta tecnológica eficiente.
III. INTRODUCCIÓN

La reacción en cadena de la polimerasa está en auge en los últimos años y en

especial en el actual 2020 ya que permite la síntesis de millones de copias de
segmentos específicos del ADN. Por lo cual es importante saber lo principios de
funcionamiento de esta técnica para la especificidad y sensibilidad que
requieren los ácidos nucleicos para poder caracterizarlos y su posterior
amplificación de la secuencia de ADN con ayuda de cofactores como el Mg y un
tipo de ADN polimerasa (Taq polimerasa). Es importante el diseño minucioso de
primers para tener una amplificación del ADN correcta. Para esto se debe
considerar varios aspectos:
- Porcentaje de GC
- Longitud de su cadena
- Temperatura de Annealing.

IV. MATERIALES Y MÉTODO

Diseño de Primers:
1. Buscar el gen a fin de estudio.

2. Obtención de las características del gen.

3. Damos click en “Prick Primers”.
4. Anotamos todas las especificaciones del primers que deseamos crear.

En forward primer añadimos el número de nucleótidos que deseamos que

nuestro primer tenga. Cabe recalcar que lo recomendable es entre 18-25. Lo
mismo hacemos en reverse primer que es el primer al final de la cadena.
5. No sale el cuadro de dialogo que mostramos a continuación y damos click
en “Check”.

Nuestra secuencia del primers realizado coincide con anteriores secuencias que otros
investigadores han hecho.
6. Seleccionamos una opción de las que aparecen en el anterior gráfico y
procedemos a verificar los primers disponibles para una cuantificación.

7. Siguiendo con el proceso, entramos a la página NEB Tm Calculator. Y

calculamos el tiempo de annealing.
8. Escogemos un primer de los 10 disponibles para su estudio.

Primer escogido el número 9.

9. Calculamos el Tm en NEB Tm Calculator

Aquí se demuestra el tipo de polimerasa que se va a usar. Ya que hay polimerasas que
tienen inicios en caliente por eso son hot start. Por ejemplo, la polimerasa fushion
logra hacer estrategias de clonación súper complicadas.

10. Comparamos los resultados con los que nos brinda “Thermo Fisher
Scientific”.

En este caso el programa Thermofisher me da una temperatura de annealing de 64.5

grados centígrados.
Procedimiento para PCR

1. Añadir cantidades específicas de cada reactivo al tubo de master mix para lograr hacer
6 reacciones en total
2. Anadir los siguientes reactivos en el tubo master mix:
 243 ul de agua desionizada, en donde cada reacción tiene 40,5 ul, como en
total son 6 entonces es 243ul.
 30ul del buffer 10X con MgCl2, es decir 5ul por cada reacción.
 6ul de NTPs 10mM es decir 1ul para cada reacción.
 6ul del forward primer
 6ul del reverse primer
 3ul de la Taq polimerasa
3. Añadir 49ul del master mix preparado anteriormente a cada tubo. En donde hay 4
muestras. Un control positivo, un control negativo en cambio serio no añadir la Taq
polimerasa o no añadir el primer o NTPs. Por lo común no se añade polimerasa por lo
tanto no va a existir amplificación.

Ahora si procedemos a realizar nuestro PCR

4. Procedemos a poner nuestros tubos con las muestras y con los controles positivos y
negativos en nuestro Termiciclador.
5. Una vez colocados los tubos procesamos un archivo para leer las muestras que
tenemos
6. Procedemos a una desnaturalización inicial del ADN de un 1 ciclo a 94 grados
centígrados por 5minutos.
7. Ingresar las condiciones de temperatura, tiempo y numero de ciclos.
8. El ADN polimerasa sintetiza nuevas cadenas de ADN complementarias a la nueva
cadena de ADN añadiendo los di nucleótidos dNTPs complementarios a la muestra de
ADN.
9. En el siguiente paso debemos realizar los 3 ciclos consecutivos. Primero la
desnaturalización (94 grados en 30 ciclos por 30s), posteriormente el annealing (60
grados por 30s) y por último la elongación (72 grados por 1min) por 30 ciclos
10. Ahora debemos programas las condiciones para un tercer paso para que todas las
cadenas de ADN amplificadas completen dicho proceso. Por lo tanto, insertamos 1
ciclo de un paso, a 72 grados centígrados por 10 minutos por 1 ciclo.
11. Por último, ingresar las condiciones para que la PCR finalice el proceso. Programamos
un cuarto paso de 1 ciclo a 4 grados por un tiempo indefinido (se pone 00:00)
Ya está listo para la lectura.

V. DISCUSIÓN

Diseño de Primers

En la actualidad existen diferentes herramientas tecnológicas para el diseño de

primers, entre la cual tenemos la NCBI que nos es la más eficaz, pero nos brinda una
ayuda adecuada. Para el diseño de primers se debe tener en cuenta varios parámetros
como la temperatura de Malting o Tm que debe estar en un rango de 55 a 60°C ya que
es la temperatura a la cual el plásmido va a pegarse a la cadena molde de ADNc. Esto
se lo hace con el fin de minimizar la interacción inespecífica del primer. En esto
agregamos que, si la temperatura es mayor a 55°C, existe una menos especificidad o la
afinidad de primer se reduce. En cambio, si la temperatura es menor a 55 °C los
productos de ADN van hacer inespecíficos. También es recomendable diseñar los
primers con cadenas no mayores a 25 pb para así evitar la probabilidad de que existan
nucleótidos inespecíficos. Otra manera de e rendimiento del proceso sea mayor es
adecuando el porcentaje de G y C (guanina y citosina) sea menos al 60%, ya que estas
bases nitrogenadas tienden a unirse por 3 puentes de hidrogeno lo que las hace
mucho más resistentes al momento de desnaturalizar el ADN de nuevo.

Por consiguiente, escogí el primer, con un GC% para el forward primer de 47.62% y el
reverse primer con 57.89%. Teniendo en cuenta que la base de GC% no debe
sobrepasar el 60%. Por lo tanto, en NEB Tm Calculator me dio un Tm de 67°C, a
diferencia del ThermoFisher que fue de 64.5°C. Haciendo hincapié en esto se dice que
el primer no se va a pegar porque el Tm es muy alto, y en teoría tocaría modificar los
primers ya sea añadiendo bases nitrogenadas o quitándolas para que el Tm disminuya.

PCR

Los reactivos utilizados en este proceso ya sea por internet o en práctica en laboratorio
cumplen funciones específicas. Varios aspectos, como la base de la obtención de la Taq
polimerasa, que es aislada de una Archea, “Pyrococcus furiosus” que es
termoresistente a temperaturas de mayores a 100°C. El Mg es el principal cofactor de
la Taq polimerasa ya que permite cuantificar la reacción y además le da una mayor
eficiencia a este tipo de ADN polimerasa.

Al momento de realizar la cuantificación de las muestras en el Termciclador es

necesario tener un control positivo y negativos. El control positivo se basa en agregar
otro set de primers que estemos seguros que se van a amplificar. En cambio, el control
negativo, no añadir Taq polimerasa para que la amplificación no se dé. También se
inmiscuye a los dNTPs.

En este proceso hay que tener mucho cuidado ya que es análogo a algo muy sensible
que a menor descuido se puede contaminar los materiales o reactivos. Por lo tanto,
existen varias causas de falsos negativos que se pueden dar al finalizar la reacción:

 La extracción de ADN es defectuosa

 Pueden existir inhibidores de la PCR en la muestra que pueden ser
contaminantes orgánicos o inorgánicos.
 Mutación en el sitio de hibridación del primer.
 Concentración incorrecta del Mg+2.
 Concentración incorrecta de los primers.
VI. CONCLUSIONES
En términos generales, debido a la situación que estamos viviendo hoy en día es
necesario utilizar herramientas tecnológicas para la aplicación de la teoría aprendida
en clases. De esta forma, trabajamos con NCBI para el diseño de nuestro propio
primer, con lo que no es recomendable ya que la lectura y cálculo del Tm no fueron los
adecuados para una correcta lectura de PCR por su alto valor (65 aprox). Cabe recalcar
que el principio de funcionamiento de estos programas es el mismo el cual lo
aplicaríamos en la práctica de un laboratorio en la universidad.
Como consecuencia de lo expuesto en el informe, refutamos la hipótesis inicial acerca
del funcionamiento correcto del programa NCBI ya que nos dio resultados, como el GC
% de entre los 57% y una temperatura promedio de annealing de 65°C a la cual va
hacer imposible que el primer se pegue de forma eficaz, lo que hace que la
amplificación no se dé correctamente.
En relación a lo antes expuesto, podemos concluir que Praxilabs es una herramienta
muy interactiva en el procedimiento de PCR como herramienta tecnológica eficiente.
Esto indica que, en este instrumento de aprendizaje online podemos trabajar de una
forma eficiente ya que nos permite tener el control total de los materiales a utilizar y
las cantidades requeridas al momento de preparar el Master Mix que es la solución
principal para una lectura eficiente. En este sentido, consideramos detalles mínimos
como el desecho de las puntas de micropipeta en su lugar, un orden dado al agregar
los reactivos, es decir, nos enseña a un manejo de calidad dentro de un laboratorio.

VII. RECOMENDACIONES

 Es recomendable agregar los forwards y reverse primers en mayor cantidad

para no tener falsos negativos.
 Para el control negativo es recomendable no agregar Taq polimerasa.
 Para el control positivo también se puede omitir el buffer.

VIII. BIBLIOGRAFÍA

Comb, D. New England Biolabs. NEB Tm Calculator. Recuperado de:

https://tmcalculator.neb.com/#!/main

J. D., Baker T. A., Bell S. P., Gann A., Levine M. and Losick R. Molecular Biology of the
Gene. Séptima Edición. CSHL Press.

PraxiLabs. 3D Simulations. https://praxilabs.com/DASHBOARD/main/lab-experiments.aspx#

Hatsopoulos, G. ThermoFisher Scientific. Tm Calculator. Recuperado de:

https://www.thermofisher.com/ec/en/home.html