UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

Departamento De Ciencias Biológicas

Complementaria de Biología Molecular

TALLER 9
Diseño de primers

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Respondan las siguientes preguntas:

1. (0.6 puntos) ¿Qué es un primer universal y un primer degenerado?

2. (0.6 puntos)¿Qué es la Tm?

a. ¿Cuál es la importancia de conocer esta temperatura para hacer una PCR?

b. ¿Cómo se calcula la Tm?

3. (0.8 puntos) Diseño manual de primers: De acuerdo con los criterios vistos en clase,
propongan un par de primers para amplificar la siguiente secuencia (que corresponde a una
región del gen ERG11 de Candida albicans). Tengan en cuenta todas las sugerencias vistas
hasta el momento, pero garanticen que, en este caso, la longitud de cada primer sea solo
de 10 pb. Resalten los primers sobre la secuencia (tanto el forward como el reverse) y luego
escriban la secuencia de cada uno, de 5´a 3´.

5’GATAGATGAGGCCTAGACAGTTAAATCATTTTCTTAAGTGGTAGATGCAACACTAGAATCCTGTTC
CAGGTTTTAACTTTTATGGCTCATTCTGTAACCTTCAAAAAGCTAATTCTAAAATACAGTAGTATGCC
ACACAATGGCATTTCTGTCAAGGATGGACCACATATATGACAGAGGTCCCACACTACTATAATGGA
GCTGAAAAATTCCTGTCACCCAGTGACATCATAGCAGTCATAATATTATACACAATGCATTACTCAT
GTCTTCGTGGTGATGCTGGTGTAAACCTACTGAAATCCCACTTGTATAAAAGTCTAGCACATAGCAT
TATGTACACTACATAATACTTGATAATGATAATAAACAACTATGTTACTGGTTTATGTATTTACTATC
TATATTTTATCATTATTTGTGGAGGTGGAAGACAATG-3’

Secuencia del primer forward (5´a 3´):

Secuencia del primer reverse (5´a 3´):
4. (1.5 puntos) Diseño de primers con software especializado: Diseñen un par primers que
permitan amplificar la región del punto anterior, que codifica para un gen de resistencia en
Candida albicans. Para hacerlo, sigan estos pasos:

a. Ingresen a NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y descarguen, en formato FASTA,

la secuencia de ERG11. El número de acceso es AY856351.1 (adjunten a continuación
el pantallazo de este paso):

b. Usando el programa primer3plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-

bin/primer3plus/primer3plus.cgi/), diseñen una pareja de primers que abarque los
últimos 400 a 500pb de la secuencia que obtuvieron en el punto anterior y que no
sea más grande de 550pb. (adjunten a continuación el pantallazo de este paso):

c. Para cada primer obtenido analice su longitud, la Tm y el porcentaje de GC.

Apoyándose de alguna referencia confiable (ej: libro, artículo científico) justifique si
dichos parámetros son los deseados para una pareja de primers. (Las referencias
deben ser diferentes a las diapositivas de la clase):

d. Utilicen el programa OligoAnalyzer para determinar y analizar los valores ANY,

SELF, Pair Any y Pair End, los cuales permiten evaluar la posible formación de
homodímeros y/o heterodímeros de la pareja de primers. Es necesario crear un
usuario en la página (https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer).
Justifiquen si, de acuerdo con estos parámetros, la pareja de primers es adecuada:
 e. Teniendo en cuenta lo explicado en clase, respondan ¿por qué es de particular
interés la amplificación y secuenciación de estos últimos 400‐500pb en la secuencia
de ERG11 de C. albicans? Para apoyar su respuesta busque y referencie un artículo
científico relacionado con el tema:

5. (1.5 puntos) Haga un primer Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) de las

siguientes secuencias de primers:

F´ AAGTCGAGCGAGTACGCAAGTACT
R´ CCAACTTAATGATGGCAAATATAG

¿A qué organismo y gen corresponde esta secuencia?

¿Cuál es el tamaño del fragmento a amplificar?

Para cada primer obtenido analice su longitud, la Tm y el porcentaje de GC.

Utilicen el programa OligoAnalyzer para determinar y analizar los valores ANY, SELF, Pair
Any y Pair End.