Informe Laboratorio de Genética Molecular

Diseño de partidores para amplificar un gen específico con sitios de enzimas

de restricción en sus extremos

Profesora : Marcela Bravo

Alumna : Karen Esteves Zúñiga
Fecha : 27/08/15

INTRODUCCIÓN
En el presente práctico de laboratorio, se realizó una búsqueda de la secuencia del gen GAPDH
humano , para el diseño de primers o partidores específicos ,a partir de un fragmento del gen en
mención, se utilizó dos formas para diseñarlos ,una manualmente y la otra a través de herramientas
bioinformáticas ,además se señalan Tm(temperatura de apareamiento) para cada primers, longitud en
pares de beses , intrones ,exones, que se describirá con mayor detalle en materiales y métodos.

El ADN está en forma de doble hélice. Para que se pueda amplificar una secuencia específica de DNA
es necesario realizarlo en 3 etapas ,que comprende :Desnaturalización o separación de la
doble hebra,, hibridación de los cebadores y extensión de los fragmentos .

“La separación de la doble hebra de ADN puede conseguirse aumentando la temperatura del medio
hasta unos valores de( 90-95)°C”[ CITATION Pil03 \l 13322 ].

Posteriormente se enfría la hebra por debajo de la temperatura de fusión entre 40-65°C,para se

produzca la hibridación y los primers(que son secuencias de ADN monocaterio de pequeño tamaño
,de entre 15 y 30 bases aproximadamente),presenten complementariedad de bases con regiones del
ADN molde próximas a cada uno de los extremos del fragmento que interesa amplificar[ CITATION
Pil03 \l 13322 ].[ CITATION Fra05 \l 13322 ]

Finalmente, se necesita una extensión de los fragmentos flanqueados por los primers gracias a la
acción de una molécula llamada Polimerasa y que tiene su temperatura óptima de reacción a 72 ºC
[ CITATION Fra05 \l 13322 ]

Los primers se diseñan a partir del conocimiento de la secuencia que se requiere amplificar. Se eligen
de manera que se evite la complementariedad de bases entre los propios primers, o entre éstos y
secuencias del DNA de regiones distintas a la que se quiere estudiar , ya que provocaría la aparición
de productos distintos al deseado.

Diseño de primers es esencial para el éxito de un experimento de PCR. Al diseñar un conjunto de

primers a una región específica de DNA deseado para la amplificación, un cebador o primers debe
reconocer a la cadena positiva, que por convención está orientado en la dirección 5 '→ 3' (también
conocido como el sentido o hebra forward o nontemplate) y el otro cebador debe complementar la
cadena negativa, que está orientada en el 3 '→ 5' (antisense o reverse)

Siempre que sea posible, se debe escoger una pareja de primers cuyas Tm sean similares entre si,
con lo que se asegura la eficacia del perfil de temperaturas empleado en el ciclo.

Hoy en día es posible diseñar primers mediante varios programas bioinformáticos, comparando
secuencias ,midiendo las longitudes en pares de bases y calculando valores de Tm .
OBJJETIVOS:

 Búsqueda de secuencia del gen de GAPDH humana en bases de datos.

 Diseño de partidores específicos para la amplificación de un fragmento determinado con

secuencias de enzimas de restricción(BamHI y EcoR) en sus extremos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para la búsqueda de la secuencia del gen de GAPDH humana, se digitó en el buscador de google
gapdh sequence human, se selección la opción GAPDH glyceraldehyde-3-phosfate
dehydrogenase(Figura1),luego se abrió la página del NCBI(Centro Nacional para la Información
Biotecnológica) que alberga genomas secuenciado en GenBank(base de datos que contiene todas las
secuencias de ADN de acceso público y, además, incluye anotaciones.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) ,en esta página aparece información más detallada y entre esta
la secuencia del gen(Figura 2).

Fig 1.Selección del gen en el buscador

Fig. Página de NCBI

Debajo de la información del gen, se observa la regiones genómicas ,los exones e intrones que

involucran al gen, posteriormente se realiza un clic en FASTA(formato de secuencia de ADN, ARN y

Proteínas ,se representan usando códigos de una única letra) Figura 3.

Figura 3.Regiones genómicas, exones e intrones.

Se abrirá el formato fasta del gen GAPDH humana, se procedió a copiar la secuencia (Figura 4),

para luego pegarlo en box del pick primers que se ubica a la derecha del formato fasta(Figura 5 y 6).

Figura 4.Copiado de secuencia

 Figura 5.Pick primers Figura 6. box del pick primers

En el cuadro de texto del pick primer pueden modificarse algunas condiciones, como es el
tamaño de producto de PCR, o la temperatura de alineación de los primers, se observó
muchas opciones al cuál se puede hacer ajustes de acuerdo a nuestras necesidades.
Finalmente se seleccionó la opción Get primers que se encuentra al final de la página , de
esta forma nos permitió generar los primers(Figura 7).

Figura 7.Generaciónde primers

Otra forma de diseñar primers es realizarlo de forma manual ,en la siguiente Tabla 1, se
muestra enzimas de restricción ,con sus respectivas secuencias. Se seleccionó secuencias de
longitudes cortas de 20-25 pares de bases(entre menos longitud de nucleótidos habrá mayor
estabilidad de la hebra).Para este práctico se utilizó una secuencia de 10 pares de
bases(Bam HI),y de 8 pares de bases (EcoRI), estas secuencias servirán como sitio de
corte ,la cual se va a unir con la secuencia del gen(Tabla 2).

Tabla 1.Eficiencia de la digestión de las enzimas de restricción en secuencias ubicadas en los

extremos del DNA.
Tabla 2.Diseño de pimers forma manual.

PRIMER FORWARD
BamHI

(BamHI)

PRIMER REVERSE

Se consideró también una temperatura de apareamiento aproximado de 55-65 °C, para ambos
primers, utilizando la siguiente fórmula de Wallace.

A continuación,
se muestra secuencias de nucleótidos que constituyen al gen GAPDH humana . Cada línea contiene
60 nucleótidos agrupados en 6 bloques de 10. Las secuencias que se encuentran, en negrita ,
corresponde al fragmento de gen a amplificar , comprendido entre las 2499- 3117pb (619pb),con su
respectivas direcciones (Figura 8).

Figura 8.Fragmento del gen GAPDH humana

RESULTADOS

El resultado obtenido para la generación de primers mediante la herramienta bioinformática ,

arrojó 10 opciones de pares de primers, cada par de los primers con características similares,
como la longitud de su secuencia y su Tm (Figura 9).
 Figura 9.Características de los primers

Sin embargo, para estas 10 opciones de primers, también se especifica en que región del gen

se está amplificando y la longitud del producto de amplificación, se observa 20 a 21 pares de

bases, un porcentaje de GC de 55-60 ,una Tm 58,5-60,finalmente se quedaría a criterio propio

de que par de primers se utilizará de acuerdo a las necesidades a investigar(Figura 10).

Figura 10.Composición de las 10 opciones de primers

Para el diseño de primers de forma manual del gen , se obtuvo las siguientes Tm para cada
primers , el fragmento complementario

Primer Forward (19 nucleótidos)

Sentido (5’® 3’)

5’ 3’

Se procedió a contar la cantidad de los cuatros nucleótidos de Citosina,guanina,adenina y

Timina. Cantidad C: 6 Cantidad G: 5 Cantidad A: 6 Cantidad T: 2

Reemplazando en la fórmula se tiene:

Tm = 4(5+6)+ 2(6+2)°C

Tm = 44+16

Tm = 60°C

Primer Reverse (19 nucleótidos)

Al igual que el procedimiento anterior del primer forward , se calculó la Tm para el primer
reverse ,reemplazando la cantidad de sus nucleótidos en la siguiente fórmula:ñ

Tm = 4(3+8)+ 2(4+4)°C

Tm = 44+16

Tm = 60°C

Se tiene el fragmento del gen , más la enzima de restricción empleado ( sitio de corte )

Sentido (3’® 5’)

Fragmento del gen (BamHI)

3’ 5’
 DNA

Sitio de corte

Posteriormente se realizó el proceso de síntesis, que comprende al cambio de los nucleótidos

de la hebra del fragmento original, de esta forma obtener el RNAm.

3’ 5’
 RNAm

Finalmente se realizó la complementariedad de la secuencia obtenida

Sentido (5’® 3’)

5’ 3’

cDNA

DISCUCIÓN:

De la composición de las 10 opciones de primers obtenidos (Figura 10),en su mayoría sus parámetros
son muy similares(longitud en pares de bases 20 a 21, 55-60 %GC, una Tm 59-60) ,la similitud es
necesario para su optimización ,en su posterior realización de técnica PCR, sin esta similitud se
produciría dímeros, formación de horquillas inclusive podrían ligarse a sitios secundarios, las mismas
consecuencias podría suceder, si no se cumple dicha condición de la forma manual.

Por otro lado, para el primer reverse, de la secuencia que fue complementada (generado de forma
manual), nos servirá para un fin comercial, es decir , para poder comprarlo, ya que si se entrega como
secuencia de mRNA ,se diseñará como tal ,y no se podrá unir a la hebra molde original.
CUESTIONARIO :

¿Porqué para calcular la Tm según el método Wallace el n° de (C+G) se multiplica por 4 y el de (A +T)
por 2?

Este cálculo se basa en el estudio de las interacciones de puente de hidrógeno que ocurre en la doble
hebra de DNA, donde GC es más estable que la interacción entre AT.

Fundamento:

Las cadenas con alta proporción de pares G-C muestran una temperatura de fusión más elevada que
las que poseen proporciones inferiores. La temperatura de fusión del DNA en la mayoría de las
especies varía literalmente entre 70°-100°,cuando la proporción de G-C sobre el total de los
nucleótidos aumenta entre el 20%-80%.

La explicación a este comportamiento se encuentra en la mayor estabilidad delas uniones G-C con
tres puentes de hidrógeno, frente a las de A-T que poseen dos, son las primeras en desnaturalizarse.
Estos fenómenos de separación de filamentos tiene lugar, en las células vivas ,durante los procesos
de transcripción o replicación del DNA,y su iniciación debe coincidir con las secuencias ricas en pares
A-T[ CITATION Arm06 \l 13322 ].

BIBLIOGRAFÍAS

Armando Garrido, Jose Teijón,Dolores Blanco,Carmen Villaverde,Carlos Mendoza,Jesús Ramirez. Fundamentos

de Bioquimica Estructural. 2 EDICIÓN. Madrid: TEBAR, 2006.

Francisco Castillo, María Roldan,Rafael Blasco. Biotecnología Ambiental. Madrid: Tebar, 2005.

Pilar Roca, Jordi Oliver,Ana Rodriguez. Bioquímica:Técnicas y Métodos. Madrid: Hélice, 2003.

Sitio web:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank