UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE
BIOTECNOLOGÍA

INGENERIA GENETICA

ALUMNOS:
 Álvarez Huaytan Katherine Aracely
 Herrera Perez Delfina Karen
 Otiniano Jiménez Patricia Alexandra
 Palacios Pascual Ainnie Mackenzy
 Rodríguez Espejo Manuel Isaías

CICLO:
SEXTO
TEMA:
DISEÑO DE CEBADORES/PARTIDORES/INICIADORES/PRIMERS

DOCENTE:
WILLIAN CAPA ROBLES

NUEVO CHIMBOTE – PERÚ

2021
 PRACTICA N° 3

DISEÑO DE CEBADORES/PARTIDORES/INICIADORES/PRIMERS

I. INTRODUCCION

Un primer es un oligonucleótido corto que se pueden sintetizar in vitro para ser utilizado en
muchas técnicas moleculares desde PCR a secuenciación de DNA. Se diseñan como secuencias
complementarias de una región de DNA diana que se desea detectar.
Cuando se diseñan primers se deben tomar en cuenta una serie de recomendaciones: a) se deben
tener de 17-28 bases de longitud; b) composición de bases: 50-60% (G+C); c) la terminación
(3') primers debes ser: G ó C, ó CG ó GC: Esto previene el "breathing" de las terminaciones e
incrementa la eficiencia de la iniciación; d) Tms entre 55-80 ºC ; e) los primers largos pueden
tener errores y en algunos casos se recomienda la purificación con HPLC; La cromatografía
líquida de alta resolución f) 3' – terminales de los primers no deben ser complementarios; g)
el primer no debe ser complementario consigo mismo (evitar estructuras secundarias como
hairpins); h) evitar primers con 3 o mas Cs ó Gs en el terminal 3’, pueden causar falta de
inciación en secuencias rica en G ó C (por la estabilidad del proceso de anillado), y deberían
evitarse. Se pueden trabajar secuencias DNA conocidas o desconocidas, siguiendo las
metodologías más apropiadas.
También se pueden agregar degeneraciones en algunas posiciones de los primers, aunque se
puede incrementarse el riesgo de amplificación inespecífica, disminuirse la concentración en la
mezcla de cada uno de los primers posibles, además que no se recomienda utilizar más de 64
primers diferentes en la mezcla. Los Código IUPAC son:

A adenina R Ao G
C citosina W AoT
G guanina S CoG
T timidina en el ADN Y CoT
uracilo en el ARN K GoT
N Ao Co GoT H A o C o T; no G
M Ao C B C o G o T; no A
V A o C o G; no T D A o G o T; no C

Las aplicaciones de los primers van desde la caracterización genotípica de organismos, así
como, la búsqueda de proteínas de interés biológico y económico.
Clustal es un programa de computadora  ampliamente utilizado para realizar alineamientos
múltiples de secuencias. 

La catepsina es una proteína con actividad proteolítica (enzima), se encuentra en tejidos

animales, cataliza la hidrólisis de proteínas a polipéptidos. Se encuentra en muchos tipos de
células, incluyendo a todas las células de animales. Hay al menos una docena de miembros de
esta familia de enzimas, que se diferencian entre sí por su estructura y por el tipo de proteína
 que atacan. La mayoría se activan al pH ácido que hay en el interior de los lisosomas, por lo que
su actividad suele darse en el interior de dichos orgánulos.

Las catepsinas tienen una importancia fundamental en el recambio proteico de las células de
mamíferos, más concretamente en la reabsorción ósea, donde se encargan de la degradación de
proteínas.

II. OBJETIVO
 La presente práctica tiene como objetivo diseñar primers para su empleo en los análisis
genómicos e Ingeniería Genética.

III. METODOLOGÍA
Para el siguiente trabajo se utilizó la herramienta PRIMER BLAST del NCBI, el cual diseña
primers específicos para la reacción en cadena de la polimerasa, la elección correcta de primers
es fundamental para amplificación del fragmento del gen de interés ya que tiene que fijarse en
un punto específico de la cadena nucleotídica.

Si bien el resultado de la PCR puede verse influido por muchas otras condiciones, como la
preparación del ADN molde y las condiciones de reacción, el diseño de un buen par de primers
es un factor crítico. Un requisito general es que las imprimaciones deberán tener temperaturas
de fusión (Tm) similares y un contenido de G / C % equilibrado, estos son factores que debemos
tomar en cuenta antes de la elección del primers. (Ye, Coulouris, & Zaretskaya, 2012)

Para llevar a cabo ello, se hizo el ingreso a la página del NCBI. En la barra de búsqueda, se
escribió L-catepsine. Posteriormente, se seleccionó la opción GENE. De los resultados
arrojados por este servidor, se eligieron dos que son de nuestro interés; que llevan por código de
accesión: NC_003283.11 y NW_020230620.1 respectivamente.

En la sección Genomic regions, transcripts and productos, se seleccionó la opción FASTA,

donde se mostró la secuencia nucleotídica de esta proteína en ambos resultados desde la región
16592572 hasta 16595346 y 638946 hasta 644411, respectivamente. Luego se hizo click en pick
primers donde sin modificar los parámetros, nos dio 10 primers para ambos resultados que
posteriormente fueron analizados. Una vez realizado este procedimiento, se evaluó los
parámetros como temperatura de melting y porcentaje de GC%.
IV. RESULTADOS
IV.1. RESULTADOS DE SECUENCIA CONOCIDA 1
Código de accesión: NC_003283.11

Fig 1. Secuencia nucleotídica en formato Fasta

Fig 2. Herramienta Pick Primers

 Fig 3. Herramienta Primer -BLAST

Fig 4. Vista grafica de resultados de los primers con respecto a la secuencia conocida 1

Fig 5. Informe detallado sobre los pares de primers de la secuencia conocida 1 (forward y
reverse)

Tabla 1. Registro de primers de la secuencia conocida 1 para evaluación de parámetros.

PRIME SECUENCIA LONGITU TAMAÑO DEL TM GC%
RS (5’>3’) D PRODUCTO
1F TCCGTGGTTTCCGTACTTG 20 925 59.97
G 55.00
1R CGTCTCGTGACTGACCAAC 20 59.97 55.00
A
2F TTGCATCCGTGGTTTCCGT 20 928 59.96 50.00
A
2R TCTCGTGACTGACCAACAGC 20 59.97 55.00

3F AGCTGTTGGTCAGTCACGAG 20 351 59.97 55.00

3R CGGGGACTCAAATTCTGGCT 20 60.04 55.00

4F TGGGTATCACGCCAGTCAAC 20 746 60.04 55.00

4R AGCTGGCTTATCACACCAC 20 60.04 55.00

C
5F CAGCTGTTGGTCAGTCACGA 20 607 60.25 55.00

5F AGCTGTCCCGTCAAATCGAG 20 60.11 55.00

6F TGGTGGTGTGATAAGCCAGC 20 329 60.32 55.00

6F GCTCCAGGGTCCCAAGTTTT 20 60.18 55.00

7F CACGCCAGTCAACCTCAT 20 750 60.04 55.00

CT
7F GACTGACCAACAGCTGGCTT 20 60.54 55.00

8F TCACGCCAGTCAACCTCATC 20 761 60.04 55.00

8F CTCGTCTCGTGACTGACC 20 59.41 55.00

AA
9F AAGCCAGCTGTTGGTCAGTC 20 545 60.54 55.00

9F AGTACTCGGAGAGCGAGG 20 60.18 60.00

AG
10F TCTGGACCCCAACAAAAC 20 60.11 55.00
CC 198
10F TCACACCACCACACTGACAA 20 59.38
50.00

Fuente: NCBI

IV.2. RESULTADOS DE SECUENCIA CONOCIDA 2

Código de accesión: NW_020230620.1

Fig 6. Secuencia nucleotídica en formato Fasta

Fig 7. Herramienta Pick Primers

 Fig 8. Herramienta Primer –BLAST

Fig 9. Vista grafica de resultados de los primers con respecto a la secuencia conocida 1

Fig 10. Informe detallado sobre los pares de primers de la secuencia conocida 1 (forward y
reverse)

Tabla 2. Registro de primers de la secuencia conocida 2 para evaluación de parámetros.

PRIMER LONGITU T GC
SECUENCIA (5’>3’) TAMAÑO DEL PRODUCTO
S D M %
 60.
1F GTACGCGAAGGTCTCTTGCT 20 55.00
11
340
60. 60.
1R CATCACCCCAGGTTACACCC 20
3 00
60.
2F TACGCGAAGGTCTCTTGCTG 20 55.00
11
277
60. 55.0
2R GTACCGTAGCCAACGACCAA 20
04 0
60. 55.
3F TCACGGGCAAACTGGTATCC 20
04 00
434
60. 60.
3R GAGACCTTCGCGTACCTTCG 2020
52 00
60. 55.
4F AAGGATCAAGGACACTGCGG 20
04 00
891
60. 55.
4R CAAGAGACCTTCGCGTACCT 20
04 00
59.
5F AGGTACGCGAAGGTCTCTTG 20 55.00
47
327
5F CACCCCAGCTGTTCTTCACT 20 59.89 55.00

6F TGCGGATCTTGCTGGTCTTT 20 874 59.96 50.00

6F AGAGACCTTCGCGTACCTTC 20 59.19 55.00

7F CACGGTGCTGTCACACCTAT 20 60.04 55.00

912
60.
7F CAAGAGACCTTCGCGTACCTT 21 52.00
07
60.
8F CGACAAGAGTGCGTGTCTCT 20 55.00
04
235
61.
8F GCAAGAGACCTTCGCGTACC 20 60.00
08
52,.
9F AAGGTACGCGAAGGTCTCTTG 21 60.07
00
329
55.
9F ACACCCCAGCTGTTCTTCAC 20 60.18
00
59. 55.
10F CCGTACGAAGCGGAGAATGA 20
90 00
290
59.
10F AAGAGACCTTCGCGTACCTTC 21
80 52.00

Fuente: NCBI

DISCUSION
Indica los autores Hernández y Valdez (2017).los iniciadores que no tienen Tm semejantes, la
amplificación es menos eficaz e incluso puede no llevarse a cabo. El iniciador con el Tm mayor,
funciona mal a temperaturas más bajas y el iniciador con el Tm más baja, no se une a
temperaturas más elevadas, indican además que un par de iniciadores que no se analizan
adecuadamente pueden llevar a obtener poco producto, productos inespecíficos o incluso ningún
producto, debido a una amplificación inespecífica y/o a la formación de dímeros de iniciadores
que compiten durante la reacción.

De acuerdo a Hu y Leung (2007), se sintetiza como un precursor inactivo, translocado al

retículo endoplásmico, y luego se dirige a los lisosomas, por lo que se ha considerado como una
proteasa lisosomal que actúa en el metabolismo intracelular de proteínas no deseada.
Según Uchiyama (1994) La localización y distribución heterogénea de la catepsina L en las
células dentro del mismo tejido sugiere que su expresión se regula de acuerdo a la
especialización celular. Además, estudios como el de Olbricht y Delaria (2000) revelan
resultados que confirman que es una enzima clave en procesos patológicos y en carcinomas en
los vertebrados.

CONCLUSION (concluir con los objetivos que propuso el profe en su práctica,

cuantos primer obtuvimos nosotros y esas cosas)
Diseñamos primers para su empleo en los análisis genómicos e Ingeniería Genética.

BIBLIOGRAFÍA

Meza, G. M. G. (2014). “LAS CATEPSINAS LISOSOMALES COMO PARTE DEL SISTEMA

DE DEFENSA DEL CAMARÓN BLANCO Litopenaeus
vannamei.” Repositorioinstitucional.mx.
https://ciad.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1006/321/1/GONZALEZ-
MEZA-GM14.pdf