Guía de trabajo: Poniendo en práctica la clonación parte I

(acompañamiento sincrónico)
Orientaciones
Objetivo
El estudiante estará en capacidad de seleccionar enzimas de restricción específicas para
garantizar un proceso de clonación exitoso.

Conocimientos previos para desarrollar la guía

Entender los conceptos de regulación genética en procariotas y clonación.

Responsables
La actividad será realizada grupos.
Descripción de la actividad
Para esta primera actividad deben leer atentamente la guía e ir resolviendo cada una de las
preguntas en sus respectivos grupos de trabajo. Es necesario contar con acceso al siguiente sitio
web: http://nc2.neb.com/NEBcutter2/

Los profesores estarán disponibles en la sesión remota de Sicua plus para resolver cualquier
tipo inquietudes.

Entregable

Esta primera parte de la guía servirá para poder realizar la segunda parte de la guía y funcionará
como material de apoyo para la realización de la infografía.
¡Manos a la obra!

Para iniciar con su misión ustedes toman muestras para aislar el virus.

En el laboratorio, su primera tarea consiste en aislar el ARN

del SARS-CoV. Este proceso lo realizan empleando un reactivo
conocido como como Trizol.
Una vez obtienen el material genético aislado deben realizar un proceso de
transcripción reversa que consiste en convertir el RNA que aislaron del
virus en ADNc. Más adelante en el curso conocerán la técnica.

A partir del ADNc del SARS obtenemos muchas copias del gen N por medio
de un proceso que se conoce como PCR.
Después de algunos pasos adicionales obtenemos un fragmento de ADN de
1301 pb que tiene ciertos sitios de reconocimiento para enzimas de restricción. Para garantizar
que tenemos el gen con el que queremos trabajar realizamos un proceso de secuenciación. Estos
son los resultados que obtenemos:
CTGCAGGGATCCCATATGAAGCTTATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGC
ATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCG
ATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCA
ACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCA
GATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGATTTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAA
AGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGG
TGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACA
TTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGC
CAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTA
GTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTG
GCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAA
TGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTA
AGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTCTCGGCAGACGTG
GTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAA
CATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGC
ATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGA
TCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACC
AACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGA
AGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCTGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAAC
AATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAACTGCAGCATATGGAATTC

Las regiones que están resaltadas en amarillo nos están mostrando:

Las regiones que están resaltadas representan el codón de inicio y el codón de parada en
términos de bases nitrogenadas de ADN.
Para expresar nuestra proteína de interés en E. coli se decide emplear el siguiente vector de
expresión:

Estos son los detalles del MCS y alrededores en este vector:

Es importante que ustedes como investigadores detallen por qué deciden usar este vector para
la investigación y no otro. (Pista: ¿Por qué funciona en E. coli?)
Uno de los sistemas más útiles para la expresión de proteínas recombinantes en Escherichia coli
es la serie de vectores pET, que se basa en el promotor de la ARN polimerasa del fago T7 (1) y
utiliza el origen de replicación del ADN pBR322. La expresión de la proteína recombinante
utilizando estos plásmidos está estrechamente regulada y, cuando se induce, produce altos
niveles de transcritos y proteínas recombinantes (2).
La ARN polimerasa T7 es tan selectiva y activa que casi todos los recursos de la célula se
convierten en expresión del gen objetivo; el producto deseado puede representar más del 50%
de la proteína total de la célula unas horas después de la inducción. Otra ventaja importante de
este sistema es su capacidad de mantener los genes diana en silencio transcripcional en en el
estado no inducido. Los genes diana se clonan inicialmente utilizando huéspedes que no
contienen el gen de la ARN polimerasa T7, eliminando así la inestabilidad del plásmido debido
a la producción de proteínas potencialmente tóxicas para la célula huésped (3).
Adicionalmente, ustedes indican que el promotor T7 será el encargado de controlar la
expresión de su gen y el terminador T7 será el encargado de terminar la transcripción de su
gen, cuando esté todo ensamblado. Con base en lo anterior, observen la estructura del vector e
indiquen dónde va a ser insertado su gen. Señalen en la figura su respuesta:

Una vez determinan la posición donde se insertará el gen, deben decidir si el inserto puede
quedar en cualquier orientación. Para esto deben responder: ¿van a usar una o dos enzimas de
restricción para cortar el inserto y el vector?
Se utilizan dos enzimas de represión debido a que es una clonación direccional en la cual el gen
debe de ir en dirección al promotor, de no ser así, la cadena que se transcribe es la equivocada
y no se generaría ninguna proteína o por lo menos, no la deseada.

Con base en lo anterior, también deben determinar en dónde quieren cortar el inserto (en
varios pedazos, uno solo, en el extremo, en la mitad). Para ello, deben analizar la secuencia de
su inserto (Gen N de la cápside del coronavirus) en el sitio web:
http://nc2.neb.com/NEBcutter2/
Esta es una herramienta para encontrar qué enzimas de restricción cortan en su inserto y
dónde). Para esto, copien y peguen la secuencia y hagan click en submit, como se muestra en
los espacios que están señalados por las fechas a continuación:

Hagan click en custom digest. Seleccionen cuáles enzimas quieren ver si cortan y dónde (viendo
su vector y MCS)

Haciendo uso del programa descrito, deben proponer la(s) enzimas de restricción con la(s) que
cortarían su plásmido e inserto para posteriormente hacer una ligación en ese vector.
(Justifiquen por qué esas y no otras). Analice las secuencias y diga qué problemas se pueden
presentar si usted decide usar el tag de histina para la purificación de la proteína.
En primer lugar, se escogió BamHI puesto a que la enzima de restricción tipo II BamHI genera un
extremo cohesivo luego de realizar su actividad catalítica hidrolasa. Lo que la convierte en una
buena opción, pues, además, no se encuentra sobrelapada y podrá actuar de mejor manera, así
como también se encuentra una sola vez. Adicionalmente, esta encima está pensada para el
rendimiento, por lo que minimiza los productos y deja una gama más amplia de opciones [4][5][6].
Asimismo, se escogió la enzima EcoRI pues es una enzima de restricción de uso común en el
laboratorio, además de que al cortar los fragmentos con dicha enzima posee un patrón específico
que producen extremos sobresalientes. De ese modo, si otro fragmento es cortado con la misma
enzima o tiene el mismo patrón estas se pueden unir por complementariedad de bases. Estos
extremos que son dejados como una cadena sencilla son conocidos como extremos cohesivos, que
además ayudan en la clonación al mantener unidos dos fragmentos de ADN para que la ADN ligasa
los pueda unir [7]. Por otro lado, si se usa la prueba de la histidina, primeramente, se encontrará la
secuencia de parada y luego podremos encontrar la secuencia expresada (tag). En ese orden de
ideas, el tag de la histidina fallaría pues no podría hacer la transcripción.

¡Están listos para continuar con la guía II!

1. Studier FW, Rosenberg AH, Dunn JJ & Dubendorff JW (1990). Use of T7 RNA polymerase to
direct expression of cloned genes. Methods in Enzymology, 185: 60-89.
2. Oliveira MLS, Neto JC, Krieger JE, Raw I & Ho PL (2001). Site-directed mutagenesis of bovine
FGF-2 cDNA allows the production of the human-form of FGF-2 in Escherichia coli
Biotechnology Letters, 23: 1151-1157.
3. Research.fredhutch.org. 2021. [online] Available at:
<https://research.fredhutch.org/content/dam/stripe/hahn/methods/biochem/pet.pdf>
[Accessed 28 October 2021].
4. New England BioLabs Inc., «New England BioLabs Inc.,» [En línea]. Available:
https://international.neb.com/products/r0136-bamhi#Product%20Information.

5. «BamH I from Bacillus amyloliquefaciens H». Sigma Aldrich (en inglés). Consultado el 28 de
octubre de 2021.
6. «Restriction endonuclease, type II, BamHI (IPR004194)». InterPro (en inglés). Consultado el
28 de octubre de 2021.

7. Las enzimas de restricción y la ADN ligasa (artículo) | Khan Academy

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-
tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase. Accessed: 2021-10-28