Nombre: Isaac Morán

Fecha: 17/02/24

ACTIVIDAD INDIVIDUAL

1. Defina que es un primer universal y un primer degenerado

Los primers, que son cadenas de ácidos nucleicos o una molécula relacionada,
se usan para iniciar la replicación del ADN. Son secuencias cortas que
contienen un grupo 3’ hidroxilo que actúa como punto de inicio para la adición
de nucleótidos y forma pares de bases complementarias a una hebra molde, de
esta manera, la hebra molde va a ser copiada. Los primers universales pueden
dividirse en random o específicos; el primero se refiere a una mezcla de
nucleótidos que anillan al azar en diferentes lugares del mRNA, por ende, se
sintetiza cDNA de todos los transcritos de la muestra. El segundo se usa
cuando se quiere formar cDNA que corresponda a solo el transcrito para el
cual el primer es específico. El primer universal es sólo una secuencia usada
para la amplificación de un gen similar relacionado con un género específico.
Por ejemplo, para amplificar el gen de enterobacterias se necesita un primer
universal para ello. De esa manera, todas las especies de enterobacterias se
amplifican y generalizan a usar un solo primer. Un primer degenerado es una
mezcla de primers que tienen sustitución de diferentes secuencias de bases
que sean similares mas no iguales. Son necesarios cuando se debe amplificar
un gen de un organismo que es similar. Con este tipo de primer es posible
amplificar diferentes secuencias que representan diferentes secuencias de
proteínas, por ende, se usa cuando es necesario un primer basado en la
secuencia de proteínas ya que diferentes codones codifican para diferentes
proteínas.

2. ¿Qué es la temperatura de melting?

La temperatura melting es el punto térmico donde los híbridos están en

equilibrio con los oligonucleótidos libres. Los híbridos son pares de bases
(ATCG) que se unen por complementariedad. La temperatura melting depende
principalmente de la fuerza de los enlaces de hidrógeno entre las bases, que
pueden ser dobles o triples.

a. ¿Por qué es importante conocer esta temperatura?

Al momento de realizar un PCR es muy útil la temperatura melting ya que da

una idea de la temperatura que debe ser utilizada en el termociclador, aunque
se debe saber que la que esta muestre no es siempre la ideal ya que otros
factores influyen al momento de la unión de los oligos como los iones y otras
sustancias que haya en la reacción. Pero en todo caso permite situar
aproximadamente la temperatura que se debería usar

b. ¿Cómo se calcula la temperatura de melting?

Hay diferentes formas de calcular la temperatura melting, pero una de estas es

usando la fórmula siguiente:

Tm = 4(G+C) + 2 (A+T)
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3. ¿Cuáles son las recomendaciones que se deben de tomar en cuenta al

momento de diseñar un primer?

Para diseñar un primer, se deben de tomar en cuenta las siguientes

recomendaciones:

• Los primers deben tener una longitud de 17-25 pares de bases.

• Los primers deben tener una temperatura de fusión (Tm) cercana
entre ellos, preferiblemente dentro de los 5°C de diferencia. La Tm
es la temperatura a la que la mitad de los primers se hibridan con el
ADN molde.
• Los primers deben tener un contenido de G+C entre el 50% y 60%.
Esto ayuda a que los primers se unan de forma estable al ADN molde.
• Los primers deben tener un extremo 3’ que se complemente bien
con el ADN molde. Esto facilita la extensión de la cadena por la ADN
polimerasa.
• Los primers no deben formar estructuras secundarias como
horquillas o dímeros. Estas estructuras pueden interferir con la
hibridación y la amplificación.

4. De acuerdo con los criterios visto en clase, se desea amplificar la

secuencia de referencia disponible en GenBank con el número:
NM_000024.6

a. ¿A que organismo corresponde la secuencia?

Homo sapiens adrenoceptor beta 2 (ADRB2), mRNA

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b. Usando uno de los programas para diseños de primers vistos en

clase, diseñe una pareja de cebadores cuyo producto de amplificación no
sea mayor a 450bp. Explique cuál fue el programa seleccionado por usted
para hacer el diseño. Coloque capturas de pantalla de los pasos que
realizo en su diseño de primers.

Se pegan la secuencia en el Oligo explorer

Se ajustan los parámetros requeridos

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c. Analice y reporte las Tm, longitudes de primers, %GC y la formación

de estructuras secundarias.
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