UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE ACUICULTURA

E INDUSTRIAS PESQUERAS

PRÁCTICA 7 DE LABORATORIO

CURSO: Genética Aplicada a la Acuicultura.

TEMA: Diseño de primers o cebadores

PROFESOR: César Abram Cruz Castellón.

INTEGRANTES:

➢ Mejía Soria, Gabriella María.

➢ Valentín Cuipal, Liza Deborha
➢ Velapatiño Zavala, Valeria Del Carmen.

CICLO: 2020-I

FECHA DE REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA: 2 de octubre del 2020.

FECHA DE ENTREGA DE LA PRÁCTICA: 9 de octubre del 2020.

La Molina
Lima-Perú
 DISEÑO DE PRIMERS O CEBADORES

1. INTRODUCCIÓN

Los primers o cebadores son secuencias de ADN complementarios a uno de los

extremos de cada una de las dos hebras del ADN. Es decir que si la hebra que va de
3’ a 5’ del ADN lleva la secuencia (TCGA) el primer irá de 5’ a 3’ con una secuencia
complementaria a esta hebra (AGCT), igual a la secuencia complementaria original
del ADN. De igual forma, a la secuencia que va de 5’ a 3’ se le unirá el primer en
dirección contraria de manera complementaria (Conde. R y Vázquez. R, 2014).
Tienen aproximadamente un promedio de 20 nucleótidos, esto porque es la cantidad
necesaria para que de manera probable se una a un sitio específico de la cadena de
ADN. Los primers se necesitan porque la mayoría de ADN polimerasas, enzimas
que catalizan la replicación del ADN, no pueden empezar a sintetizar una nueva
cadena de ADN de la nada, sino que solo pueden añadir nucleótidos a una hebra
preexistente.(Conde. R y Vázquez. R, 2014).
(Onodera. K, 2007) nos indica que para el diseño de estos primers es muy
importante tener en cuenta algunas características, tales como:
- Una pareja de primers debe tener temperaturas de alineamiento muy
cercanas para maximizar el rendimiento, lo cual suele traducirse en un
contenido en GC similar, entre 50% a 60%.
- No deben formar estructuras secundarias (formación de horquillas y dímeros
debe evitarse).
- Ser específicos (asegurar que la secuencia complementaria sea única).
- Tras analizar una gran colección de primers publicados en la literatura,
parece que conviene evitar secuencias que terminen en GGG, GGT, ATT,
CGA, TAA o TTA.
- No deberá de tener una diferencia de más de 4°C entre temperaturas de
fusión.

(Contreras-Moreira. B, 2018) nos dice que para poder diseñar los primers o
cebadores es necesario el uso de softwares o programas tales como : Primer 3,
Primer Selection, NetPrimer, Primer 2, Perl Primer, etc.
Es por ello que los objetivos de la presente práctica fueron identificar los diferentes
programas bioinformáticos para el diseño de primers, diseñar primers y adquirir
habilidades y destrezas en el diseño de oligonucleótidos (primers) utilizando
programas informáticos.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. MATERIALES
➢ Computadora de escritorio o portátil con acceso a internet.
➢ Videos
➢ Programa Primer3plus.
2.2. MÉTODOS

Mediante las figuras 1 hasta la 9 se puede observar la metodología que se

llevó a cabo para el diseño de los primers:
 Finalmente se obtiene el primer, el cual se puede observar en la figura 9.

Figura 9. Primers resultantes

Además se obtiene la ubicación de los primers en la secuencia y 4 parejas

adicionales de oligonucleótidos, ubicados en la sección inferior “Additional Oligos”.

3. RESULTADOS

A continuación se presentan las tablas de los cebadores de las secuencias A, B y C

así como las demás características de los mismos: Tm, porcentaje de guanina y
citosina, etc.

3.1. Secuencia génica A

La secuencia génica A se visualiza en la figura 10 correspondiente al gen de

Vale de Sparus aurata 2006-1195 (SpaAur_EM_02) gen de rodopsina (Rhod),
CD parcial; el cual es codificado como GenBank: EU264049.1.

Figura 10. Secuencia génica del GenBank: EU264049.1

En la figura 11 se puede observar el principal primer forward y reverse para el

GenBank: EU264049.1
 Figura 11. Principales primers para el GenBank: EU264049.1

En la figura 12 se pueden observar primers adicionales para el GenBank:

EU264049.1.

Figura 12. Primers adicionales para el GenBank: EU264049.1

3.2. Secuencia génica del gen B

La secuencia génica B se visualiza en la figura 13 correspondiente al gen

ARNm bcl2 de Odontesthes bonariensis, cds completos; el cual es codificado
como GenBank: FJ868843.1.

Figura 13. Secuencia génica del GenBank: FJ868843.1.

 En la figura 14 se puede observar el principal primer forward y reverse para
el GenBank: FJ868843.1.

Figura 14. Principales primers para el GenBank: FJ868843.1.

En la figura 15 se pueden observar primers adicionales para el GenBank:

FJ868843.1.

Figura 15. Primers adicionales para el GenBank: FJ868843.1.

3.3. Secuencia génica del gen 3

La secuencia génica B se visualiza en la figura 16 correspondiente al gen

Danio rerio Gen Bcl2 (bcl2) mRNA, complete cds.
 Figura 16. Secuencia génica del gen Danio rerio Gen Bcl2 (bcl2) mRNA,
complete cds.

En la figura 17 se puede observar el principal primer forward y reverse para

el gen Danio rerio Gen Bcl2 (bcl2) mRNA, complete cds.

Figura 17. Principales primers para el gen Danio rerio Gen Bcl2 (bcl2) mRNA,
complete cds.

En la figura 18 se pueden observar primers adicionales para el gen Danio

rerio Gen Bcl2 (bcl2) mRNA, complete cds.

Figura 18. Primers adicionales para el gen Danio rerio Gen Bcl2 (bcl2)
mRNA, complete cds.

4. DISCUSIONES

4.1. Diseño de cebadores degenerados para la amplificación del gen de

prolactina en peces perciformes (Ayala. R, 2015).

Este trabajo de investigación se desarrolló en torno a la importancia de la

prolactina (PRL) en los perciformes, ya que esta hormona de crecimiento
juega un papel importante en la osmorregulación en el sistema endocrino
para así valorar la capacidad de respuesta de esta especie y actuar en
consecuencia, alcanzando las condiciones óptimas de cultivo.
 A. Diseño de cebadores degenerados para la amplificación de prolactina
de perciformes

Posterior a la recopilación de un total de 47 secuencias a partir de datos de

secuencias génicas Nucleotide perteneciente al National Center for
Biotechnology information (NCBI) y a la generación de árbol filogenético
donde se seleccionaron 15 secuencias de CDS de las 22 obtenidas de PRL
de perciformes, se diseñó varias parejas de cebadores en las zonas de
mayor homología entre las 15 secuencias. Para ello, una vez identificadas las
zonas con menor variabilidad interespecífica, se diseñan los posibles
cebadores en sentido directo (forward) y en sentido inverso (reverse). Una
vez diseñados los oligos candidatos, se analizaron con el programa Oligo
Analyzer 1.1.2, desarrollado por el Instituto de Ciencia Molecular de la
Universidad de Kuopio (Finlandia), para elegir los que presentaron mejores
características: baja diferencia de temperatura de fusión e hibridación.
formación impedidas de dímeros de primer y un contenido en %GC cercano
al 60%, además de la presencia de 3 bases GC en la zona de anclaje 5’.

Se diseñaron en total dos parejas de cebadores, una más externa (Pr Ext Fw
y Rev) y otra más interna (Pr Int Fw y Rev). Debido a que la secuencia no
presentaba un 100% de consenso en todas las bases de las zonas elegidas
para el diseño de los oligos, se optó por incluir degeneraciones en aquellas
bases puntuales que presentaban mayor grado de variabilidad.

Figura 19. Pares de bases de los cebadores.

Una vez diseñadas las parejas de cebadores, se procedió a la verificación de

su capacidad de amplificación mediante diferentes reacciones en cadena de
la polimerasa (PCR). Los fragmentos esperados de la amplificación se
muestran en la figura 20. El ADN molde utilizado en este apartado se trata de
ADNc de PRL de dorada (Sparus aurata). Este se encuentra insertado en el
plásmido pBlueScript SK (-) en células de Escherichia coli cepa DH5-alfa.
 Figura 20. Fragmentos esperados de la amplificación

B. Diseño de cebadores para cuantificación de ARNm de Prolactina

mediante PCR cuantitativa (qPCR).

Luego del uso de los oligos degenerados para la amplificación de

PRL en perciformes, se obtuvo la PRL de corvina secuenciada, se
puede diseñar nuevos cebadores, específicos de PRL de corvina para
la detección y cuantificación de ARN, mediante PCR cuantitativa. La
principal diferencia en las características de estos cebadores con
respecto a los utilizados en una PCR convencional, es que la longitud
del producto amplificado debe ser más corta (60 - 100 pb).
Atendiendo a las consideraciones que se deben realizar en el diseño
de cebadores y utilizando el software Primer Express (Life
Technologies) se diseñaron tres parejas de cebadores para
cuantificación.
Con el fin de analizar qué pareja de cebadores proporcionaba mejor
calidad en los resultados de amplificación se realizaron dos PCRs
cuantitativas. Previamente a estas qPCR, se realizó una nueva
retrotranscripción de una mezcla de 500 ng de ARN total, usando las
cuatro muestras mencionadas anteriormente, con qScript cDNA
Synthesis Kit (Quanta BioSciences), siguiendo el protocolo del
fabricante. El ADNc sintetizado se utilizó como molde para las
qPCRs.
Ambas qPCRs se realizaron utilizando PerfeCta SYBRGreen FastMix
(Quanta BioSciences), que incluye todos los reactivos necesarios
para la cuantificación a excepción de los cebadores y el ADN molde.
Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en el equipo
Mastercycler epgradient S Realplex y el diseño del programa de
amplificación mediante el software Realplex (Eppendorf, version 2.2).
 El volumen de reacción total fue de 10 uL, distribuidos en placas de
96 pocillos (Eppendorf).
En la primera qPCR realizada se analizaron las condiciones óptimas
de concentración para cada pareja de cebadores diseñadas para
qPCR. Las condiciones evaluadas fueron: concentración del primer
(200 nM y 400 nM) y temperatura de hibridación/extensión mediante
gradiente (de 56°C a 62°C). En todos los casos se utilizaron 4 ul de
ADNc (1,25 ng/ul), 0,5 ul primer forward, 0,5 ul primer reverse y 5 ul
perfeCTa SYBRGreen FastMix.
En la segunda qPCR se estudió la eficiencia y el coeficiente de
regresión (r cuadrado) para cada pareja de cebadores, para la
temperatura y concentración óptimas de cada oligo específico,
obtenidas en el apartado anterior. Para ello se realizó un dilución
seriada del ADNc, añadiendo por triplicado diferentes cantidades de
ADNc (5 ng, 2,5 ng, 1,25 ng, 0,625 ng, 0,3125 ng y 0,1505 ng),
además de un triplicado con ARN total sin retro transcribir y un
triplicado de control sin molde.

Figura 21.Secuencia de cebadores.

4.2. Uso del software geneious (versión 5.6.7) en el diseño de “primers”

para la detección del Vibrio parahaemolyticus causante de enfermedad
de necrosis hepatopancreática aguda en el camarón. (Gonzaga. C, 2016)

El propósito de este trabajo fue el de identificar en el genoma del Vibrio

parahaemolyticus la región relacionada con la producción de las toxinas Tox
A y Tox B mediante el uso del software Geneious, para posteriormente
diseñar un juego de “primer” para la amplificación de los genes de Tox A y
Tox B empleando el software Geneious.
La recopilación de datos y la observación para este caso de estudio se lleva
a cabo al observar las alineaciones realizadas por el software Geneious de
las secuencias genómicas completas del V. parahaemolyticus escogidos del
banco de genes (GenBank-NCBI) y luego de la observación se realiza la
identificación y el análisis de la región relacionada con la producción de las
toxinas responsables de la enfermedad en camarones. Seguidamente, se
procedió al diseño de los iniciadores a partir de la selección de la opción
adecuada según las posibilidades que otorga este software.
Para verificar o evaluar la calidad de los iniciadores se realizó el análisis y la
observación (configuración) de una serie de parámetros relacionados con la
especificidad, funcionalidad teórica y características físico-químicas.
Se empleó la calculadora de propiedades oligonucleótidos (OigoCalc) y una
vez elegidos los iniciadores no defectuosos en base a sus resultados
anteriores se procedió a analizar los mismo utilizando la herramienta de
búsqueda de nucleótidos BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), de la
base de datos de NCBI.

A. Identificación de la región con la producción de las toxinas

Para identificar las regiones relacionadas con la producción de las
toxinas A y B (región Pir A y Pir B) con el objetivo de anclar los
iniciadores por medio de complementariedad de bases, se realizaron
alineaciones en el software Geneious (versión 5.6.7) de los genes
relacionados con la producción de toxinas del Vibrio parahaemolyticus
que atacan insectos, cada uno de ellos escogido según la
disponibilidad en el banco de genes (NCBI).
Una vez alineadas las secuencias de interés, Geneious
automáticamente genera una secuencia consenso, de todos los
genes alineados; en base a esta y a la ausencia de brechas,
seleccionaron las regiones objetivos que constituyeron las zonas
altamente conservadas. Para el caso de Tox A se escogieron los
300-400 primeros nucleótidos de la región y para el caso de Tox B los
primeros 400-800 nucleótidos. Estas regiones son las que, a
continuación, extraemos para cada una y es la que nos va a servir
para el diseño de los iniciadores.

B. Diseño de iniciadores o “primers”

Posteriormente a la identificación de la región con la producción de
toxinas se procedió al diseño de iniciadores, seleccionando Diseñar
Nuevo Iniciador en las opciones de Geneious. A continuación, se
configuró los parámetros más importantes requeridos para la creación
de los iniciadores.
Los parámetros escogidos tanto para Tox A como Tox B fueron: 22
nucleótidos, la Temperatura melting (Tm) óptima a 57°C, el porcentaje
de Guanina Citosina (GC) óptimo 50%, y la diferencia máxima de
Temperatura melting (Tm) entre iniciadores 0°C. Finalmente se
obtuvieron 4 set de iniciadores para Tox A y Tox B
 Figura 22 y 23. Set de iniciadores para Tox A(izquierda) y Tox B (derecha)

Observados estos 2 trabajos de investigación 4.1 y 4.2 para el presente informe se

compara los factores más importantes de estos 2 con el método realizado en clase,
para lograr un buen diseño de primer o iniciador.

➢ En el caso 4.1 el Tm se encontró entre 56°C y 60°C, por otro lado en el caso
4.2 se encontraba en 57°C finalmente en la prueba realizada en clase el Tm
no figuraba.
➢ En el trabajo 4.1 el % de CG fue de 60%, en el caso 4.2 fue de 50% mientras
que en el diseño de “primer” realizado en clase fue de 45% - 60%. Según
Contreras-Moreira. B en el 2018, el % de CG óptimo para el diseño de un
cebador debe fluctuar entre los 50 - 60 %, esto nos indica que en los tres
procedimientos realizados para el diseño del primer se mantuvo un
porcentaje de CG óptimo.
➢ Los programas utilizados para el diseño del cebador en los casos 4.1, 4.2 y el
diseño realizado en clase fueron Clustal W.2 elaborado por la European
Molecular Biology laboratory, Geneious y el Primer 3 plus respectivamente.
Según Onodera. K, 2007 los programas más eficientes para el uso de diseño
de primers son: Primer 3, Primer Selection, NetPrimer, Primer 2, Perl Primer,
Geneious. Observamos que el software Clustal W.2 no se encuentra dentro
de la lista, esto se puede deber a que es un programa nuevo creado en el
2015.
➢ Por último, uno de los factores que indican que el diseño de un primer se
realizó de manera correcta es la longitud de amplicón; obtuvimos los
siguientes resultados para el caso 4.1, 4.2 y el elaborado en clase: 60-100
pb, 472-529 pb y 154-240 pb respectivamente. Estos valores se ven
 influenciados por el tipo de PCR utilizado previamente, el caso más inusual
es el visto en el caso 4.1 con 60-100 pb, esto se debe a que se realizó un
PCR cuantitativa en lugar de una PCR convencional.

4.3. Desarrollo de un PCR para la Identificación del Parásito Dawestrema

(Trematoda: Monogenea) en el Pez Arapaima gigas

Diseño de Serrano, et al. (2016) manifiesta que para el diseño cebadores del
gen ribosomal 18S de Dawestrema cycloancistrum se ubicaron las
secuencias presentes en la plataforma GenBank, lo cual coincide con la
ubicación de secuencias utilizado en el presente informe; en el caso dicho
estudio, ubicaron la secuencia presente en el gen ribosomal 18S de los
monogeneos de la familia Ancyrocephalidae; sin embargo, se diferencia
porque dichos autores lo llevaron al formato FASTA utilizando el programa
Clustalw2 con el objetivo de alinearlos.

Una vez obtenida la secuencia consenso procedieron a diseñar los

cebadores con la ayuda del programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/), lo
cual coincide con la metodología utilizada en el presente informe. Obteniendo
los cebadores diseñados:

➢ DAW182F: CAGTCTCCGGGAAACCTGTA
➢ DAW182R: CAGACAGCTCGTACCACGAA
➢ DAW183F: CCGTTTGTTGCCTGAAGATT
➢ DAW183R: GGCAGATGCTTTCGCTTTAG
➢ DAW184F: CCGTTTGTTGCCTGAAGATT
➢ DAW184R: GCAGATGCTTTCGCTTTAGG

Al observar los cebadores diseñados por Serrano et al. (2016) utilizan

cebadores de 20 bases nitrogenadas lo cual coincide con la cantidad de
bases nitrogenadas utilizadas para diseñar los primers en la presente
práctica. Así mismo los primers de los autores tuvieron un porcentaje de
guanina y citosina que variaron desde 45% a 55%, es decir que estuvieron
dentro del rango recomendado de % de guanina y citosina (40% a 60%)
coincidiendo igualmente con los parámetros utilizados en la práctica.

4.4. Identificación de genes asociados a la virulencia de Aeromonas

salmonicida aislada de truchas Arcoiris (Oncorhynchus mykiss)
procedentes de piscigranjas del Perú (Toro, 2020)

Toro (2020) en su estudio de identificación de genes asociados a la

virulencia de Aeromonas salmonicida en truchas de diferente regiones del
Perú tuvo que diseñar primers para algunos genes. El investigador
seleccionó como genes de interés a vapA, neuB, ahe2, satA, ascV, aopO,
aopH y basB; pero solo diseño primer para los genes neuB y basB, en el
caso de los otros genes utilizó primers referenciados. En este trabajo se
utilizó la base de datos del Genbank correspondiente a la cepa A.
salmonicida 0449 para obtener la secuencia y el programa Primer3 para el
 diseñar los primers. El autor tuvo como consideraciones para la elección del
primer: parámetros de longitud (17-28 nt),temperatura de melting (Tm), el
cual estuvo entre 50-60°C, el % GC (40-60%), además también verificó que
los primers no formen dímeros o heterodímeros. La determinación del mejor
primer para cada gen se hizo a través del programa BLAST (Basic Local
Alígnment Search Tool) mediante el análisis de los parámetros E-valor
(<0.02), cobertura de la secuencia problema (query cover) y el porcentaje de
identidad (>70%).

Figura 24. Primers de los genes neuB y basB.

A través de una PCR convencional se buscó identificar las secuencias, se

identificaron los 6 genes donde se usaron primer referenciados, sin embargo,
no se logró identificar genes donde se utilizaron primers diseñados por el
autor, atribuyendo estos resultados a un posible error en los ensayos.
El diseño de primers realizado por Toro (2020) considera el mismo %GC que
el que se utilizó durante la práctica, de acuerdo a Contreras (2018) los %GC
es importante para que las parejas de cebadores tengan temperaturas de
alineamiento cercanas,también la Tm es proporcional al contenido de GC.El
autor también verificó que los primeros no formen dímeros o heterodímeros,
verificación que no se llevó a cabo en la práctica, sin embargo si se precisó
como importante, esto también es mencionado por Contreras(2018) como
una de las 3 condiciones mínimas que debe cumplir un primer.

5. CUESTIONARIO

5.1. ¿Qué factores pueden afectar en el diseño de un primer?

Giorgio (s.f.) manifiesta que el diseño cuidadoso de primers es uno de los

aspectos más importantes de la PCR y que primers mal diseñados pueden
amplificar otros fragmentos de ADN distintos a los buscados (amplificación
inespecífica). Es por ello que en el diseño de los mismos existen algunas
reglas asociadas a diversos factores que se han demostrado como útiles, por
ejemplo:
➢ Cada primer individual debe contar con una longitud de 18-24 bases.
➢ Se debe mantener un contenido de G:C (Guanina:Citosina) entre 40 y
60 %.
➢ Los dos primers del par deben de tener temperatura de fusión “Tm”
cercanos, dentro de los 5 °C.
➢ La secuencia de los primers individuales debe iniciarse y terminarse
con 1 o 2 bases púricas.
➢ Evitar regiones con potencialidad para formar estructuras secundarias
internas.
➢ Evitar poli X.
➢ Secuencias adicionales pueden ser agregadas en el extremo 5’ del
primer (no incluir cuando se estima la Tm del primer).

➢ El diseño de un primer puede ser afectado en su estabilidad la cual

dependerá del extremo 3’ del primer; es mejor que el extremo 3’ se
una ya que permite una polimerización más eficiente. Si no se conoce
la secuencia blanco, un primer con el extremo 5’ estable y el 3’
inestable aumentará la especificidad.

➢ La temperatura de fusión de una molécula dada depende

principalmente de su contenido de G+C, de sí se trata de DNA o RNA,
híbridos RNA:RNA (que tienen las temperaturas más altas), de las
condiciones físico químicas de la solución en la que se trabaja, así
como de la longitud de las secuencias implicadas en el proceso (a
menor longitud, menor temperatura de fusión).

➢ Temperatura de anillamiento: la temperatura de fusión de una cadena

doble de ácidos nucléicos está relacionada con su longitud y
contenido de G+C 1 . De esta manera la temperatura de anillamiento
que se escoge para una PCR depende directamente de la longitud y
composición de los primers. Es común utilizar temperaturas de
anillamiento 5 oC por debajo de la temperatura de fusión más baja del
par de primers utilizados (Innis and Gelfand, 1990). Es importante
tener en cuenta que una Ta demasiado baja puede llevar a eventos
de inespecificidad de los primers utilizados, de tal manera que lleguen
a ser anillados en secuencias diferentes a la que queremos amplificar
(Rychlik et al., 1990). Una Ta demasiado alta, por su parte, puede
llevar a que el rendimiento de la amplificación sea muy bajo ya que se
reduce la probabilidad de anillamiento. También es muy importante
tener en consideración que el par de primers escogidos deben no
tener Tas demasiado diferentes, ya que es muy probable obtener
amplificaciones asimétricas (amplificaciones de una sola hebra).

➢ Longitud del primer: Un primer debe ser lo suficientemente complejo

de tal manera que la probabilidad de anillamiento con una secuencia
diferente a la de nuestro interés sea muy baja. Como se anotó
 anteriormente una secuencia de 16b de longitud tiene una
probabilidad de ser encontrada una vez cada 4 16 bases. Por esta
razón es muy recomendable que un primer tenga, como mínimo, 17
bases de longitud.

5.2. ¿Qué es la Bioinformática?

De acuerdo a el National Human Genome Research Institute(s.f.), la

Bioinformática es una subdisciplina de la biología y de las ciencias
computacionales que se encarga de adquirir, almacenar, analizar y diseminar
la información biológica, en su mayoría correspondiente a las secuencias de
ADN Y aminoácidos, se apoya en el uso de programas informáticos que
tienen muchas aplicaciones, como por ejemplo: determinar funciones de
genes y proteínas, establecer relaciones evolutivas y predecir la
conformación tridimensional de las proteínas.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

➢ Ayala, R. 2015. Diseño de cebadores degenerados para la amplificación del

gen de prolactina en peces perciformes. Universidad de Cádiz. Consultado el
08 de octubre del 2020 de
https://rodin.uca.es/xmlui/bitstream/handle/10498/17723/Ayala%20Su%C3%
A1rez%2C%20Rub%C3%A9n.%20TFG%20Biotecnolog%C3%ADa..pdf?seq
uence=1&isAllowed=y
➢ Bioinformática | NHGRI. (s. f.). Genome.gov. Recuperado 6 de octubre de
2020, de https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Bioinformatica
➢ Conde, R y Vázquez, R. 2014. Temas selectos de Biología. Grupo Editorial
Patria, México. pp. 182. Consultado el 07 de octubre del 2020 de
https://editorialpatria.com.mx/pdffiles/9786074380286.pdf
➢ Contreras, B. 2018. Algoritmos en bioinformática estructural. Consejo
Superior de investigaciones científicas. pp. 31-32.
➢ Gonzága, F. 2016. Uso del software geneious en el diseño de “primers” para
la detección del vibrio parahaemolyticus causante de enfermedades de
necrosis hepatopancreática aguda en el camarón. Universidad de Guayaquil.
Consultado el 08 de octubre del 2020 de
http://repositorio.ug.edu.ec/bitstream/redug/24216/1/EC-UG-POS-DP-MBM-0
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➢ Onodera, K. 2007. PCR Primer Design. Editorial Humana Press. pp. 61-74.
Consultado el 07 de octubre del 2020 de
https://europepmc.org/article/pmc/pmc7127618
➢ Serrano, E., Tantaleán, M,. Quispe, M., Casas, G. y Londoña, P. (2016).
Desarrollo de un PCR para la Identificación del Parásito Dawestrema
(Trematoda: Monogenea) en el Pez Arapaima gigas. Recuperado de
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1609-911720160
00300019
➢ Toro, D. (2020).Identificación de genes asociados a la virulencia de
Aeromonas salmonicida aislada de truchas Arcoiris (Oncorhynchus mykiss)
procedentes de piscigranjas del Perú [tesis de maestría, Universidad
Peruana Cayetano Heredia].Repositorio institucional
UPCH.http://repositorio.upch.edu.pe/handle/upch/8209