EPIGENETICA.

LUCIA RAMIREZ. CATEDRÁTICA DE GENETICA Y MEJORA VEGETAL.

 INDICE

A. Concepto de Epigenética.
B. Mecanismos que…..
C. Proteínas y RNAs que….
D. Estructuras con capacidad de mantener…
D .1. Metilación del DNA.
E. Estructuras que se autoperpetúan.
E.1.ProteíNAS. “per se “.
F. Silenciamiento génico mediado por metilación.
G. Metilación y Replicación del DNA.
G.1. Maquinaria celular de Metilación.
G.1. 1. DNA Metiltransferasa de mantenimiento y “ de novo”.
G.1.2. DNMT1 y HP1.
G.1.2.1. Targets de DNMT1
F. Establecimiento de regiones desmetiladas.
G. Patrón de metilación en plantas y animales.
H. Modificación de histonas.
H .1.Modificación post-traduccional de histonas,
H.2. Metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación.
H.3. Código de Histonas y variantes de histonas.
I. heterocromatina. Efecto de Posición.
I.1. Función de la heterocromatina.
I.1.1. Mecanismos moleculares que regulan la formación de la heterocromatina.
J. Formación de heterocromatina en centrómeros de Schizosaccahromyces pombe.
K. Polycomb y Trithorax.
L. Efectos epigenéticos
L.1. Efectos epigenéticos que se heredan.
L.1.1.Destinos de los complejos proteicos.
M. Epigenética transgeneracional.
N. Alelos metaestables.
O. Herencia priones de levadura.
P. Priones en humanos.
Q. Imprinting.
Q.1. Metilación como causa de imprinting.
Q.2. Expresión diferencial de genes troquelados.
EPIGENETICA.
Concepto.

 Modificación de un ácido nucleico después de su síntesis sin que ocurran cambios en la secuencia primaria de ADN o por la perpetuación de las
estructuras de proteínas.

 Significa que dos individuos con la misma secuencia de ADN en un locus pueden mostrar fenotipos diferentes.

 Causa?. Existencia de una estructura que se autoperpetúa en uno de los individuos que no depende de la secuencia de ADN.
MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA REGULACIÓN EPIGENÉTICA:

 1) Metilación del ADN--->fundamental para señalar qué genes deben activarse o inactivarse en momentos específicos del desarrollo, o en procesos
como la inactivación del cromosoma X, impronta genómica…

 2) Modificaciones post-traduccionales de las histonas.

 2. a) Modificaciones de histonas---> modificaciones covalentes: metilación, acetilación, ubiquitinación, fosforilación, sumoilación (similar a
ubiquitinación) y ADP-ribosilación.
 2.b) Variantes de histonas--->intercambio dinámico entre histonas y variantes de histonas en la cromatina, que se correlaciona con el estado
transcripcional de un locus determinado. Ej: histona H3.3 de levadura y la variante macro-H2A en ratón...

 3) Remodelación de la cromatina
 No dependiente de ATP.
 3.a) Formación de asas de cromatina (looping)---> favorecen la activación transcripcional, acercando elementos de regulación a los promotores que
deben ser activados.
 Dependiente de ATP.
 3.b) Estructuras de la cromatina de orden superior. Establecimiento de regiones de eucromatina (transcripcionalmente activa) y regiones de
heterocromatina (transcripcionalmente inactiva).
PROTEÍNAS Y ARNs QUE PARTICIPAN EN LA REGULACIÓN EPIGENÉTICA:

 a) Metiltransferasas de DNA (DNMTs) y proteínas con dominios de unión metil-CpG (MBD).

 b) Proteínas modificadoras de histonas---->metiltransferasas (HMT), acetiltransferasas (HAT), desacetilasas (HDAC), y quinasas como MAPK y SAPK.

 c) Proteínas delimitadoras (“insulator”)--->Son secuencias a las cuales se unen factores transcripcionales y proteínas con actividad remodeladora de la
cromatina, que bloquean o facilitan la formación de asas de cromatina e interacciones entre elementos reguladores.

 d) Complejos remodeladores de la cromatina--->Son complejos de proteínas que pueden incluir moléculas de los otros grupos mencionados, y cuya
composición es regulada en tiempo y espacio. SWI/SNF.

 e) Transcritos no codificantes/RNAs no codificantes---> siRNA, miRNA y piRNA.

TIPOS DIFERENTES DE ESTRUCTURAS TIENEN LA CAPACIDAD DE MANTENER LOS EFECTOS EPIGENÉTICOS:

 a. Una modificación covalente del ADN (metilación de una base).

 b. Una estructura proteica que se ensambla con el ADN.

 c. Una proteína que controla la conformación de subunidades proteicas conforme se sintetizan.

a. METILACION DEL DNA.

 Modificación de la estructura primaria del DNA por incorporación de un grupo metilo , CH3, en determinadas posiciones de bases nucleotídicas
mediante la acción de enzimas específicas.

 En bacterias está asociado a un sistema de METILACION-RESTRICCION usado por las mismas para defenderse de patógenos y para diferenciar si el
DNA se ha replicado o nó.

 Ocurre en sitios específicos. Los grupos –CH3 se localizan en ambas cadenas de DNA.

 Adenina y citosina se metilan frecuentemente en procariotas en tanto que la citosina lo hace por lo general en eucariotas, en el carbono 5 para
formar 5 metil citosina.

 Proporción de citosinas metiladas en células animales: 5% y 50 % en plantas.

 Entre el 60 y el 90 % de las secuencias GpC del DNA de mamíferos están metiladas. No se ha descrito metilación de citosina en Saccharomyces y el
nivel de 5 metil citosina en Drosophila en muy bajo. (1 base metilada por cada 12.500 nts).

 En eucariotas ocurre en las islas CpG localizadas en la región 5´de algunos genes.

 La metilación de los genes en el extremo 5’ de los mismos (ej en las GpC islands) se correlaciona con el silenciamiento génico. Heterocromatina
constitutiva está altamente metilada.

 En eucariotas la metilación está relacionada con la falta de transcripción o inactivación génica.

 Mecanismo (probable)?... Un grupo metilo en el surco mayor dificulta la interacción de un TF con su secuencia diana.
 Análisis de metilación en muestras de tumor de
pulmón.
 Digestión del ADN genómico por HpaII y MspI
seguido de Southern.
 HpaII corta en CCGG pero no en CmCGG.
 MspI corta en ambos casos (CCGG & CmCGG).
 Si el sitio no está metilado
aparece un fragmento de restricción más largo
en la digestión con HpaII
mientras que con MspI
 1. DNA cortado con HindIII aparecen fragmentos de menor tamaño.
 2 y 4 DNAs cortado con HindIII y MspI.
 3 y 5. DNAS cortados con HindIII y HpaII.

Regulation of the expression of the tissue transglutaminase gene by DNA methylation

PNAS April 29, 1997 94 (9) 4692-4697; https://doi.org/10.1073/pnas.94.9.4692
 b. Las estructuras que se autoperpetúan y que se ensamblan en el ADN generalmente tienen un efecto represivo al formar regiones heterocromáticas
que impiden la expresión de genes dentro de ellas.

 Perpetuación depende de la capacidad de las proteínas en una región heterocromática para permanecer unidas a esas regiones después de la
replicación de las secuencias de las que derivan, y luego reclutar más subunidades de proteínas para mantener el complejo. ACTUAR COMO PUNTO
DE NUCLEACION.
 c. Puede ser el estado de modificación de una proteína, más que la presencia de la proteína per se, el responsable de un efecto epigenético.

 Los agregados de proteínas que causan efectos epigenéticos (llamados priones) funcionan secuestrando la proteína. Formado el agregado de
proteína, obliga a las subunidades de proteína recién sintetizadas a unirse en la conformación inactiva.

 Un prion: proteína mal plegada capaz de transmitir su forma mal plegada a otras variedades
de la misma proteína.
 Produce las encefalopatías espongiformes transmisibles. Ejemplo: la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob y la encefalopatía espongiforme bovina.
 Los priones son considerados agentes infecciosos​ y su forma intracelular ), un prion solamente
está compuesto por a.a y no presenta material genético.

 Se trata de una glicoproteína PrP presente en las células que puede convertirse en patogénica.
 como consecuencia de la alteración de su estructura secundaria, lo que conduce a un
incorrecto plegamiento de su estructura terciaria.
LEWIN, XII. 2020.

17
SILENCIAMIENTO GÉNICO MEDIADO POR METILACION.
MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, May 2002, p. 3157–3173 Vol. 22, No. 9 0270-7306/02/$04.000 DOI: 10.1128/MCB.22.9.3157–
3173.2002
Molecular Mechanisms of Gene Silencing Mediated by DNA Methylation.

 En las células normales, la metilación se localiza en regiones pobres en CpG, mientras que las áreas ricas en CpG (CpG islas), ubicadas en regiones
reguladoras de genes de clase II, están protegidos de la modificación .

 La ausencia de metilación es un requisito previo para la transcripción activa. Las islas CpG metiladas se encuentran en el cromosoma X inactivo y en
alelos silenciados de genes troquelados ( gene imprinting) de los padres.

 La correlación entre la metilación del ADN y el silenciamiento génico se ha estudiado en experimentos de transfección realizados en ovocitos de
Xenopus.

 Se clonó una región de DNA humano que contenía una alta densidad de dinucleótidos CpG en diferentes posiciones con respecto al promotor tk de la
timidin quinasa del herpes simplex virus (HSV) variándose en cada experimento el número de dinucleótidos metilados.

 Se observó que unas pocas citosinas modificadas frente al promotor tk son suficientes para inhibir drásticamente la transcripción.

 La represión no depende del sitio en el que se clonó el fragmento con dinucleótidos metilados con respecto al promotor ni tampoco es una función
lineal el nivel de transcripción observado, sino más bien hay un claro efecto umbral.

 Se observó que la inhibición transcripcional se extiende, en cis, por varios cientos de pares de bases sólo cuando hay suficiente
 cantidad de CpG metilada.

 Se observa un escenario diferente cuando se reduce el número de dinucleótidos metilados: sólo se produce el silenciamiento en las secuencias que
flanquean inmediatamente la región metilada.

 La tricostatina A elimina por completo el efecto represivo.

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CONTINUACION.

 La metilación atrae proteínas que se unen específicamente al ADN modificado, bloqueando así el acceso a otros factores necesarios para la inducción
génica.

 Proteínas que contienen un dominio de unión al ADN metilado (MBD) están implicadas en la represión transcripcional.

 La caracterización bioquímica de las proteínas MBD mostró que la mayoría de ellas están en complejos que contienen histona desacetilasas, lo que
sugiere que las CpG metiladas (mCpG) suprimen la transcripción al establecer un ambiente represivo de cromatina.

 Por tanto, las histonas ensambladas en el ADN metilado están significativamente menos acetiladas que las histonas ensambladas en el resto del
genoma,

 La metilación de CpG y la desacetilación de histonas actúan sinérgicamente para silenciar la expresión génica.

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16
 METILACION Y REPLICACION DEL DNA.

 Un alelo tiene una secuencia que está metilada en ambas

cadenas de ADN, mientras que el otro alelo tiene una
secuencia no metilada.

 La replicación del alelo metilado crea moléculas de DNA

hijas hemimetiladas cuya metilación es restaurada por una
metiltransferasa de ADN constitutivamente activa (DNMT)
.
 La replicación no afecta el estado del alelo no metilado.

 En caso de que el estado de metilación afecte la

transcripción, los dos alelos difieren en su estado de
expresión génica, aunque sus secuencias sean idénticas

LEWIN, XII. 2020.

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 Un sitio se dice totalmente metilado si los residuos de C de las
secuencias palindrómicas de ambas cadenas están metilados.

 Cuando se replica una cadena metilada, las células hijas reciben

una cadena metilada y la otra no.

 La perpetuación de un sitio metilado depende de lo que le

ocurre al DNA metilado.

 Si ocurre metilación de la cadena no metilada, el sitio se

restaura a la condición inicial de metilación completa.

 Si la replicación ocurre primero, la condición de hemimetilación

se perpetuará en una sola de las cadenas de DNA pero el sitio
equivalente en la otra cadena no se metilará.

LOS ESTADOS DE METILACION DEL

DNA SON CONTROLADOS POR DNA
METILTRANSFERASAS.

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Maquinaria celular de metilación.

 La metilación del ADN es un proceso dinámico

 Secuencias no metiladas pueden metilarse
 Secuencias metiladas pueden desmetilarse.

 Los procesos de metilación y desmetilación establecen PATRONES DE METILACION.

 La reacción de metilación está catalizada por enzimas. Metiltransferasas.

 Existen 2 grupos:

 DNA metiltransferasas “de novo”.

 DNA metiltransferasa de mantenimiento tiene una eficiencia menor al 100%.

 Con la edad suele observarse, epigenetic drift. (disminución de la metilación genómica con replicación celular
progresiva (células envejecidas).
 DNA metiltransferasa de mantenimiento.

 Actúa constitutivamente sobre sitios hemimetilados convirtiéndolos en sitios totalmente metilados

 Su actividad principal se observa justo antes del inicio de la replicación, por lo que solo se metila la hebra molde.
 Los patrones de metilación se heredan de forma semiconservativa (permanecen en la población celular).
 Su presencia asegura que cualquier sitio metilado se perpetúe después de la replicación.
 Interacciona con complejos proteicos implicados en la represión transcripcional como las desacetilasas (HDAC).
 Ejemplos:
 Mamíferos → DNMT1.
 Plantas → MET1
 ADN metiltransferasa “de novo”.

 Solo actúa sobre una de las hebras añadiendo grupos metilo en zonas “vacías”.
 Crea nuevos patrones de metilación.
 Interactúa con las HDAC → las recluta para silenciar genes.
 Ejemplos:
 Mamíferos → DNMT3 Ay B.
 Plantas → DRM2.
 DNMT1 METIL TRANSFERASA DE MANTENIMIENTO MARCA SITIOS CpG METILADOS PARA PRESERVARLOS EN CADA PROCESO DE
REPLICACION CELULAR. ASOCIACION CON HP1.

 HP1 (heterochromatin 1, chromoprotein, relacionada con represión génica y localizada en centrómeros y telómeros.
 Es reclutada a regiones heterocromáticas en las que la H3K9 están metiladas.
 Se une a DNMT1 y potencia su actividad represiva incrementando la metilación de las C cercanas.
 DNMT1 ayuda a HP1 a unirse a la heterocromatina.
  TARGETS DE DNMT1:

 i) Promotores de genes. Mutaciones en DNMT1 (mantenimiento) en ratón, producen desmetilación completa de promotores y una
expresión génica descontrolada. Mutación. Letal.

 ii) DNA satélite. Mutaciones en el gen DNMT3 en ratón impide la metilación del DNA satélite y produce centrómeros inestables.

 Iii) en humanos, la mutación homóloga es responsable del Síndrome de Rett. Los que la padecen muestras síntomas de autismo.

 ESTABLECIMIENTO DE REGIONES DESMETILADAS Y MANTENIMIENTO DE LAS MISMAS.

 Existen proteínas que protegen sitios no metilados.

 La demetilación de sitios metilados puede producirse por:

 i) Pérdida de metilación debido a disminución en la fidelidad de DNMT1 durante el mantenimiento de la metilación: DESMETILACIÓN
PASIVA. Disminuye la 5 metilcitosina y se incrementa la 5 hidroximetilcitosina.

 ii) Bloqueo de la metilasa de mantenimiento cuando se ha producido la replicación. Después del segundo ciclo de replicación una de las
dos cadenas dejará de estar metilada.

 iii) Demetilar activamente el sitio y remover el grupo –CH3.

 TRANSMISION DEL PATRON DE METILACION EN PLANTAS Y MAMIFEROS.

 Las plantas transmiten el patrón de metilación de generación en generación aunque, el patrón se elimina de las secuencias
repetidas por medio de glicosidasas de la familia DEMETER para prevenir interferencias con la expresión génica de genes vecinos a
dicha secuencia.

 En mamíferos la metilación genómica se borra en las células germinales primordiales que son las que darán origen a la línea
germinal.

 Las células germinales primordiales tienen bajos niveles de DNMT1. Por eso es proceso de desmetilación no es tan traumático.

 En mamíferos se ha visto que DNMT3 A Y B que son metiltransferasas de novo intervienen no sólo en procesos de desmetilación
sino también de re-metilación dentro del ciclo celular.
MODIFICACION DE HISTONAS.

Características generales:

 Proteínas básicas, de bajo peso molecular con gran afinidad por el DNA.

 Sujetas a modificaciones covalentes en sus colas, extremo NH2, producidas por metilación, acetilación fosforilación, sumoilación, (modificación post
traduccional que consiste en la adición de una pequeña proteína llamada SUMO, small ubiquitin related modifier) etc.

 Algunas modificaciones son exclusivas y se producen durante la replicación, ensamblaje de la cromatina, splicing, transcripción, etc.

 AMINOACIDOS MAS FRECUENTEMENTE MODIFICADOS.

 Lisina: puede ser acetilada y metilada.

 Arginina: puede ser mono o dimetiladada.
 Serina y Treonina son fosforiladas.

 Las modificaciones son reversibles. Algunas pueden mantenerse estables a través de múltiples ciclos celulares. Son realizadas por ENZIMAS
ESPECIFICAS.

 Alguna modificaciones cambian la carga de la proteína. Grandes acetilaciones de lisina disminuyen la interacción entre las histonas y el DNA.

 Las histonas recién sintetizadas tiene un patrón de acetilación que se elimina luego del ensamblaje de los nucleosomas.
 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE HISTONAS.

 Las colas NH2 terminal de las Histonas salen por fuera del octámero de
histona. Las colas , especialmente de las Histonas H3 Y H4 sufren
modificaciones post-traduccionales en muchos de sus a.a. que constituyen
una fuente de variabilidad.

IMPORTANTE!!!!!.
METILACION DE HISTONAS:

 Transferencia de grupos metilo a los extremos N-terminal de los residuos de lisina (K) o arginina (R).

 Reacción catalizada por enzimas HTMs (Histone methyltransferases) para metilar residuos y enzimas con dominios
desmetilasas para quitar los grupo metilo, HKDMs (Histone lysine demethylases).

 La subunidad de las histonas con mayor tasa de metilación es H3, seguida de H4.

 Lisinas → mono, di o trimetilación → activación y represión de la transcripción.

 Argininas → mono o dimetilación → activación de la transcripción.

 La metilación genera gran estabilidad y puede convertirse en una modificación epigenética a larga duración.
 Metilación está relacionada con INACTIVACION.
 ACETILACIÓN DE HISTONAS

 Adición de grupos acetilo a los radicales amino terminal de las lisinas (K) de las histonas.

 H4 es la subunidad con mayor tasa de acetilación.

 Reacción catalizada por HATs (Histone acetyltransferases) y HDACs (Histone deacetylases).

 Implicada en el control transcripcional y en la reparación de daños en el DNA.

 Hiperacetilación → Cromatina más descondensada y accesible a factores de transcripción. Aumento de la expresión génica
 Hipoacetilación → Cromatina más compacta. Silenciamiento transcripcional
FOSFORILACION Y UBIQUITINACION

FOSFORILACIÓN

● Adiciónde grupos fosfato aresiduosdeserina(S) o

treonina (T)
● Regulan el control transcripcional y mitótico
● Mediado por enzimas tipo quinasas
● Mayoritaria en las histonasH3 y H4

UBIQUITINACIÓN

● Adiciónde ubiquitina sobre los residuosdelisina (K)

● Genera estados transcripcionalmente activose
inactivos por igual.

“CÓDIGO DE HISTONAS”
 CÓ D I G O D E H I S TO N A S

● Conjuntode marcas (modificaciones covalentesde las

histonas)que funcionan de manera complementaria
para regular la expresión de un gen.

● Las diferentes combinaciones de marcas codifican

información que regula la expresión génica

● Regulado por enzimas que constituyen la maquinaria

epigenética que “escriben”, “leen” y “borran” estas
marcas epigenéticas

Tudor domain y PHF plant homeodomain

protein reconocen lisinas metiladas.
VARIANTES DE HISTONAS.

 Histonas que presentan algunas diferencias con respecto a las histonas canónicas en su secuencia.

 La magnitud de la diferencia es variable.

 FUNCION:

 Cambiar la naturaleza de la cromatina.

 La H3 tiene una variante de mayor y otra de menor tamaño.

 La variante de mayor tamaño, H3.3 es un componente minoritario de las células pero en levadura se expresa durante todo el
ciclo celular, a diferencia que las histonas canónicas que lo hacen sólo en la fase. S.

 La H2A tiene una variante, H2AZ, que es importante en procesos como: activación génica, demarcación del límite entre la
eucromatina y heterocromatina, progresión del ciclo celular.
RESUMEN
Eucromatina: Cromatina en estado relajado. Accesible para la maquinaria de transcripción

Heterocromatina: Cromatina en un estado más compacto. Inaccesible para la maquinaria de transcripción

- Acetilación generalizada. - Metilación generalizada
- Bajo grado de metilación - Ausencia de acetilación
- Transcripción génica ACTIVA - Transcripción génica INACTIVA
LA HETEROCROMATINA Y SU RELACION CON EL SILENCIAMIENTO GENICO.EFECTO DE POSICION.

 Secuencias altamente repetidas : DNA satélite.

 Se ha visto que si se transloca o se transfiere un gen a una posición adyacente a un bloque de heterocromatina, se produce
inactivación del mismo.

 La inactivación es el resultado de un efecto epigenético que es variable entre células del mismo organismo y que se llama: PEV

 PEV: position effect variegation, EFECTO DE POSICION (células genotípicamente idénticas tienen fenotipos diferentes).

 El estado del gene afectado puede ser : activo o inactivo dependiendo de su posición con respecto al bloque heterocromático y
puede observarse como variegado.

 CAUSAS?. El gen requerido para la producción de pigmento, w+ al estar adyacente a un bloque heterocromático se inactiva en
algunas células pero en otras no.
 La inactivación se extiende desde el bloque heterocromático hacia las regiones adyacente.

 CUANDO OCURRE?.....

 En un momento del desarrollo embrionario y todas las células derivadas de ella tendrán el mismo fenotipo.

 Cuanto menor es la distancia entre un gen y un bloque heterocromático mayor es la probabilidad de ser inactivado.

 FORMACION DE LA HETEROCROMATINA:

 Proceso en dos pasos:

 i) Evento de nucleación: ocurre en una secuencia específica disparado por una proteína de unión a DNA que reconoce dicha
secuencia y actúa como sitio de anclaje para otras proteínas similares.

 Ii) Evento de extensión. La estructura que se forma se extiende a lo largo de la fibra de cromatina

 Parámetros que la influyen:

 Cantidades limitantes de compuestos proteicos, activación de promotores en la región, presencia de insulators (pueden proteger una
región transcripcionalmente activa, evitando la propagación de la heterocromatina.
 RESUMEN:

 La heterocromatina se nuclea en una

secuencia específica y la estructura se
propaga a lo largo de la fibra de cromatina.

 La nucleación es el resultado de la unión de

proteínas a secuencias específicas.

 Genes situados en regiones heterocromáticas

se inactivan.

 La longitud de la región inactivada varía de

célula a célula.

 La inactivación de genes es el resultado del

PEV.
Inactivacion génica por vecindad con bloque heterocromático.
 PORQUE SE INACTIVA LA CROMATINA????

Inactivación de la cromatina:

 Adición de grupos que modifican su estructura.

 Condensación de la cromatina que hace inaccesible la polimerasa.

 Adición de proteínas que bloquean los sitios de regulación de transcripción.

 Ausencia de proteínas que inhibe la transcripción.

MECANISMOS MOLECULARES QUE REGULAN LA FORMACION DE LA CROMATINA.

 CÓMO SE ANALIZÓ?...

 Mediante el análisis de mutantes del PEF en Drosophila.

 Tipos de mutantes:

 i) Su (var): Son genes cuyos productos suprimen la variegación y son necesarios para formar heterocromatina. Ejemplo. HDAC.

 ii) E (var): genes cuyos productos incrementan la variegacíón. Son necesarios para activar la expresión génica. Ej. SWI/SNF,
remodelador de cromatina.

 La proteína HP1, Heterochromatin 1 es una proteína SU (var) de mamíferos.

 i) Contiene un cromodominio en el extremo NH2 terminal que interactúa con la H3K9 que puede estar di o trimetilada (ésta es la
marca de la cromatina inactiva) y un dominio carboxilo terminal relacionado con el primero llamado cromo-shadow que
interacciona con otras proteínas.

 La metilación de histonas es fundamental para saber si nos encontramos en región de heterocromatina (H3K9) o en región de
eucromatina (H3K4).
 LA HETEROCROMATINA DEPENDEDE SU INTERACCION CON LAS HISTONAS.

• HP1 es clave para la formación de la heterocromatina en mamíferos.

• Se une a la H3K9 trimetilada y promueve la formación de estrcuturas de cromatina de
orden superior. .

Bank 1KNE. S. A. Jacobs and

Structure from Protein Data

S. Khorasanizadeh, Science
295 (2002): 2080–2083.
Photo reproduced from G.
Lomberk, L. Wallrath, and
R. Urrutia, Genome Biol. 7
(2006): p. 228. Used with HP1 contains a chromodomain and a
permission of Raul A.
Urrutia and Gwen Lamberk,
chromoshadow domain. Methylation of
Mayo Clinic. histone H3 creates a binding site for HP1.
HETEROCHROMATIN DEPENDS ON INTERACTIONS WITH HISTONES

Figure 27.7: Binding of HP1 to

methylated histone H3 forms a
trigger for silencing.
FORMACION DE HETEROCROMATINA EN S. pombe. FUNCION Y MECANISMO DEL COMPLEJO si RNA RITS.

 Utiliza la vía del RNAi.

 Se inicia por la producción de moléculas de RNAs resultantes de la transcripción de secuencias repetidas 5´-3´y 3´-5´de
los centrómeros.

 La RdRP transforma los RNA de cadena simple en ds RNAs,

 ds RNA se corta por DICER.

 Los si RNAs se acoplan al complejo RITS.

 Los siRNAs posicionan el complejo en los centrómeros.

 EL complejo contiene proteínas homólogas a las halladas en otros organismos.

 El complejo si RNA promueve la metilación de la H3K9 que está en la región heterocromática del cromosoma, mediante
la histona metiltransferasa Clr4 homóloga de Su (var) 3-9.
 El mantenimiento de las regiones de de heterocromatina por el complejo RITS se ha descrito como un loop como
consecuencia de un feedback, debido a que los complejos se unen de forma estable a la H3K9 e inducen la
transcripción de cualquier RNAm naciente.

 Los ARNm nacientes se utilizan como sustrato para la síntesis de nuevos si RNAs ( SECUNDARIOS) por acción de
la RdRP que se unirán a complejos RITS.

 El complejo RITS se localiza en regiones heterocromáticas gracias al emparejamiento de base de los tránscritos
heterocromáticos nacientes y a la acción de proteínas con cromodominios del RITS que reconocen las regiones
metiladas de la heterocromatina.

 Una vez incorporado en la heterocromatina el complejo RITS recluta otros complejos RNAi y enzimas
modificadoras de la cromatina.

 La formación de la heterocromatina, pero no el mantenimiento de la misma depende de la función endonucleasa

del complejo DICER que se utiliza para generar el complejo inicial de la vía si RNA de silenciamiento.

 En eucariotas el silenciamiento por RNAi parece desempeñar un papel importante en las células de la línea
germinal.
 MECANISMO DE FORMACIÓN DE HETEROCROMATINA EN EL CENTROMERO
DE (S. pombe).

1. Se genera un RNA de doble cadena mediante la

transcripción bidireccional o RNA dependiente de la
síntesis de RNA.
Las secuencias que se transcriben suelen ser
secuencias repetidas centroméricas del DNA.
2. Dicer digiere la molécula formada → siRNA
3. Los fragmentos se unen al complejo RITS.
El complejo usa al ARN como mecanismo de
direccionamiento para regresar a su origen y poder
comenzar así el proceso de represión.
4. El complejo RITS se une a la H3K9 para
estabilizarse.
La unión permite el reclutamiento de factores que
inician la modificación de la cromatina.
FACTORES
metiltransferasa de histonas H3K9
complejo RDCR
5. Reclutamiento de otras proteínas: Clr4 y Swi6
(extensión de la metilación)
 PORQUÉ UN COMPLEJO DE SILENCIAMIENTO REPRIME LA ACTIVIDAD DE LA CROMATINA?....

Porque condensa la cromatina evitando de ese modo el acceso a las proteínas reguladoras a sus targets.

 Qué significa ?????.

 Que el complejo de silenciamiento y el de transcripción son incompatibles.

 Que el complejo de silenciamiento impediría que haga su trabajo compitiendo con él ya que la activación génica impide
que el complejo de silenciamiento se extienda por la fibra de cromatina.

 La interacción entre Pc-G (polycomb) y Trx-G (Trithorax) constituyen un ejemplo.

 LA REPRESION DE POLYCOMB UTILIZA METILACION DE HISTONAS.

 QUE ES POLYCOMB?....

 Las proteínas del grupo Polycomb (Pc-G)son:

 una familia de complejos descubiertos por primera vez en moscas de la fruta que pueden remodelar la cromatina de manera que se
produce el silenciamiento epigenético de los genes.

 No son represores convencionales.

 Perpetúan un estado de represión génica a través de divisiones celulares.

 Los represores Pc constituyen dos complejos: PRC1 y PRC2 .

 El complejo PRC2 es reclutado por proteínas PHO-RC, que se unen a los PRE Polycomb Response Element . PRC2 contiene una histona
metil transferasas que trimetila H3K27 en las colas de histona.
 La metilación determina el reclutamiento de PRC1 que condensa la cromatina.

 CARACTERISTICAS DE PC.

 i) proteína nuclear que se localiza hasta en 80 sitios de los cromosomas politénicos.

 ii) reconoce el estado represivo establecido previamente y lo perpetúa a través de divisiones celulares.
 Iii) se une a PRE Polycomb Response Element que es sitio que actúa como punto de nucleación de las proteínas PC y a partir del cual
se extenderá por la fibra de cromatina la estructura proteica represiva.
PRC2 contiene una
metiltransferasa que
metila colas de
histonas H3K27me3
y promueve
reclutaimetno de
PRC1.

FIGURA 19-29. Papeles posibles de la histona H3 trimetilada en Lys27 (H3K27me3) en la

función del grupo Polycomb. a) El papel posible de la histona H3 trimetilada en Lys27
(H3K27me3) en la atracción del complejo represor Polycomb 1 (PRC1) (para los detalles, véase el
texto). b) El papel posible de la H3K27me3 en la formación de asas en la cromatina. El PRC1,
anclado en el PRE, podría interaccionar con la H3K27me3 para estabilizar el contacto con el gen.
El asa de DNA resultante yuxtapondría los complejos del grupo Polycomb y la región transcrita,
en donde el PRC2 podría propagar aún más la metilación de H3K27, compactar los nucleosomas
locales y obstaculizar la RNA polimerasa. (Adaptado de Simon J.A. y Kingston R. 2009. Nat. Rev.
Mol. Cell Biol. 10: 697-709, Fig. 3. © Macmillan. Reproducido con autorización).
Polycomb y Trithorax son antagonistas: Represor y Activador respectivamente.

 Polycomb es un grupo de proteinas (Pc-G) que

perpetúan el estado de represión a través de
las divisones celulares pero no inician la
repression.

Figure 27.9: Pc-G proteins do not

initiate repression, but they are
responsible for maintaining it.
 POLYCOMB Y TRITHORAX SON ANTAGONISTAS: REPRESOR Y ACTIVADOR.

• Trithorax es un grupo de proteínas (TrxG).

• Antagonizan la acción de Pc-G.
• Se diferencian tres clases:
• i)Trx G modificadoras de histonas.
• Ii) TrxG remodeladoras de cromatina.
• Iii) Trx G de union a DNA.
• Hacen accessible la cromatina a los T.F.
• Pc-G and TrxG se unen a la misma secuencia PRE pero CON EFECTOS OPUESTOS.
 LOS EFECTOS EPIGENETICOS PUEDEN HEREDARSE.

 HERENCIA EPIGENETICA:
 Transmisión a la descendencia, por tanto heredable, de efectos fenotípicos que no se corresponden con cambios en la
secuencia de DNA.

 MECANISMOS EPIGENETICOS. CLASIFICACION.

 CLASE 1.
 Modificación covalente del DNA que se perpetúa y que puede llevar a que los dos alelos de un locus muestren
fenotipos diferentes
 La metilasa de mantenimiento actúa de forma constitutiva para restaurar la metilación después de cada ciclo de
replicación.

 CLASE 2.
 Estado proteico que se autoperpetúa y que deriva del ensamblaje de un complejo proteico, modificación de una/s
proteína/s específica o del establecimiento de una conformación alternativa de una proteína.
DESTINO DEL COMPLEJO PROTEICO QUE SE PERPETÚA EN SUCESIVAS DIVISIONES MITÓTICAS.

POSIBILIDAD 1 .

 Similar a como se restituye la metilación en

secuencias completamente metiladas.

 POSIBILIDAD 2.

 Que después del ciclo celular todo el complejo

proteico vaya a una de las células hijas y la otra
requiera la síntesis de un nuevo complejo.
 POSIBILIDAD 3.
 Distribución aleatoria del complejo proteico a cada célula hija. Al final puede lograrse el estado de restauración completa de
heterocromatina si la proteína se autoensambla e induce que las nuevas unidades proteicas que se sintetizan se asocien a ella.
 En algunos casos puede ser el estado de la proteína modificada más que la presencia “per se” de la proteína la que es responsable del
efecto epigenético.
 La siguiente figura muestra cómo cada célula hija recibe DNA con algunas regiones acetiladas y otras nó. La acetilación se logra porque
alguno de los octámeros de las histonas H3 y H4 actúan como señal para la HAT.

Figure 27.14: Acetylated

histones are conserved and
distributed at random to the
daughter chromatin fibers at
replication.
 EPIGENETICA TRANSGENERACIONAL.

 Son aquéllos efectos epigenéticos que se transmiten a través de las generaciones.

 Se ha observado en PLANTAS y MAMIFEROS.

 MAMIFEROS.

 Se ha observado epigenética transgeneracional en mamíferos.

 Epialelos metaestables : la transcripción de los mismos dependen de su estado epigenético, que varía no sólo entre tejidos sino
también entre células .

 En mamíferos, el estado epigenético del genoma se reprograma en los genomas parentales y durante la embriogénesis temprana. Pero
algunos loci pueden transmitir el estado epigenético a la siguiente generación a través de los gametos, epigenética transgeneracional.
ALUMNOS.

 Ejemplo:

 En ratones la mutación dominante del locus agutí, se conoce como agouti viable yellow y controla el color de la capa en ratones. La
mutación es causada por un retrotransposón que se inserta en la región 5´codificante. La mutación afecta todo el genoma.

 ´Efecto del alelo?....

 VARIEGACION. Se observa que la capa tiene colores que van del amarillo sólido al moteado y al agutí, oscuro.

 Se observó que las hembras agutí procreaban mayoritariamente progenie agutí y las hembras amarillas, mayoritariamente
descendencia amarilla.
  Las regiones CpG metiladas del retrotransposón
esta correlacionadas inversamente con la expresión
del alelo dominante, amarillo.

 Es decir que los ratones con capa amarilla son los

que tienen menos metilado el retrotrasnposón y
viceversa.

 CONCLUSION: Variaciones en la metilación del

retrotransposon determina el color de la capa.

https://www.youtube.com/watch?v=u6B7CP3pRPQ

 QUE SE DEDUCE DE ESTOS RESULTADOS?..... AA x aa --- Aa

 a. El nivel variable de expresión de agouti viable yellow en las madres parece que se transmite. EL color aportado por el padre es irrelevante.

 b. La metilación del retrotransposón que se ha insertado determina el color de la capa de los ratones indicando conservación transgeneracional de los
niveles de expresión debido a un borrado incompleto de las marcas de metilación entre generaciones.
El cortisol se une a los GR
del hipotálamo para
aliviar la respuesta al
stress.
a. Respuesta adaptativa
en ambientes hostiles.
 ALELOS METAESTABLES:

 Juegan un papel importante en la herencia epigenética transgeneracional en humanos . Ejemplo, el alto grado de variación de VNTR
en algunos loci en gemelos.

 En algunos casos del síndrome de Prader Willi, no hay mutaciones pero hay una epimutación que significa metilación aberrante del
DNA. ALUMNOS.

 CAUSA EPIMUTACION?: un alelo que ha pasado a través de la línea germinal sin borrar su estado epigenético de silenciamiento
establecido en la abuela.

 Otro ejemplo en ratas es la exposición “ in útero” á dietas carentes de algunos nutrientes, folato / colina, que actúan como donadores
de grupos metilo. Resultado???. Regiones hipometiladas del genoma en la descendencia durante toda la vida..
 HERENCIA DE LOS PRIONES DE LEVADURA.
 Priones son estructura proteicas y constituyen la evidencia de herencia epigenética.

 Priones en Saccharomyces cerevisiae:

 Se han descrito dos estados de los priones: (psi-) y (PSI +). Se heredan, mapean en el mismo sitio, el locus SUP35 y tienen la
misma secuencia.

 `Pueden ocurrir cambios entre una forma y otra.

 (psi-) codifica para un factor de terminación de la traducción . Las células wild type son (psi-), en este estado el gen es activo y la
proteína SUP35 culmina la síntesis de proteínas.

 Células mutantes (PSI +) producen una forma oligomérica afuncional de la proteína que impide la terminación e la traducción.

 Cepas (PSI +) tiene propiedades poco comunes.

 CRUZAMIENTO:
 (psi-) X (PSI +)

 (PSI +) Esta forma es METAESTABLE?????. Significa que aunque es heredado por la mayoría de la progenie la frecuencia de la
pérdida del mismo que se observa en la descendencia es alta, lo que es consistente comuna mutación.
HERENCIA NO CONVENCIONAL DE PRIONES DE LEVADURA

• The Sup35 protein in its wild-type

soluble form is a termination factor for
translation. Se localiza en el cytosol.
• Sup35 can also exist in an alternative
form of oligomeric aggregates, in
which it is not active in protein
synthesis. Forma complejos proteicos
oligoméricos

The state of the Sup35 protein

determines whether termination of
translation occurs.
 El estado (PSI +) está determinado por la conformación de la proteína SUP35.

 En una célula wild type (psi-) la proteína muestra su función normal. Pero en una célula (PSI +) la proteína está presenta pero su
conformación es tal que pierde su funcionalidad.

 COMO EXPLICAR LA DOMINANCIA DE (PSI +) sobre (psi-) EN LOS CRUZAMIENTOS ??.

 Debemos asumir que la presencia de proteína en el estado (PSI +) causa que toda la proteína en la célula entre en ese estado y
esto se logra mediante la interacción entre la proteína (PSI +) y las proteínas nuevas que se sintetizan. Esta interacción termina
formando una estructura proteica oligomérica en la que la proteína mal plegada (PSI +) actúa como centro de nucleación.

 CARACTERISTICA DE SUP35.

 Tiene dos dominios que funcionan independientemente. El dominio N terminal es suficiente para la formación de estructuras
que hacen la proteína inactiva y el C terminal es suficiente para la actividad de la proteína .

 El extremo N terminal es rico en glutamina y arginina.

 La pérdida de función en el estado (PSI +) es debido al secuestro de la proteína en una estructura oligomérica.

 DONDE SE LOCALIZA SUP35???

 En células normales (psi-) se localiza en el citosol. En células (PSI +) se agrupan en foci y forma fibras amiloides “in vitro” que son
estructuras proteicas con forma de lámina beta que asegura la transmisión de la estructura.
HERECIA NO CONVENCIONAL DE PRIONES DE LEVADURA

• The presence of the oligomeric form causes newly

synthesized protein to acquire the inactive
structure.

Newly synthesized Sup35

protein is converted into the
[PSI+] state by the presence of
preexisting [PSI+] protein.
 QUE PERMITE A LA PROTEÍNA QUE ADQUIERA UNA CONFORMACION ESPECIAL?....

 Diferentes chaperonas como las chaperonas Hsp 40, 70 y 104 que influencian la conversión entre las dos formas.

 EVIDENCIA EXPERIMENTAL QUE DEMUESTRA EL ROL DE LA PROTEINA SUP35.

 La proteína “ in vitro” pasa a forma inactiva.

 Se incorpora en un liposoma.

 Se fusiona el liposoma con células de levadura con genotipo (psi-)

 Transformación en levadura de tipo (PSI +).

 CONCLUSION:

 La capacidad que tiene una célula de formar priones (PSI +) depende del
fondo genético de la célula de levadura.
 RESUMEN.

 La proteína SUP35 en su forma wild tipe, activa, es soluble y codifica un factor de terminación de la traducción.

 SUP35 existe en una forma alternativa de agregados oligoméricos que se localizan en foci.

 La presencia de agregados indica a las proteínas similares que se sintetizan que adquieran dicha conformación.

 La transición entre forma activa e inactiva la realizan las chaperonas.

 (psi-) es recesivo y (PSI +) es dominante.

 LOS PRIONES CAUSAN ENFERMEDADES EN HUMANOS.

 KURU:
 Enfermedad neurológica que afecta al hombre y que es causada por priones

 Proteína responsable?.......

 Proteína Scrapie-.

 Existe dos formas de Scrapie:

 Forma no-infecciosa, PrPC, que es sensible a proteasas

 Forma infecciosa que causa la enfermedad PrPSc, que es resistente a proteasas.

Los niños no se pueden mantener en pie ni sentados
sin ayuda.
 El kuru (temblar de miedo) es una enfermedad neurodegenerativa e infecciosa causada por un prion (partícula
formada por una proteína priónica alterada del tejido cerebral).

 La palabra kuru significa en lengua aborigen 'temblor, con fiebre y frío', uno de los signos que manifiestan los afectados
por dicha enfermedad.

 Descrita a comienzos del siglo XX en Nueva Guinea. Comenzó a investigarse de manera científica en la década de los
50.

 Inicialmente se pensó que era una enfermedad hereditaria, ya que afectaba a los miembros de una tribu nativa de
Nueva Guinea.

 Se demostró que en realidad estaba causada por un prion (que no es estrictamente un agente infeccioso, aunque sí
transmisible), transmitido por la ingestión de tejidos cerebrales de personas difuntas con la intención de adquirir la
sabiduría durante los ritos funerarios.
LOS PRIONES CAUSAN ENFERMEDADES NEUROLOGICAS EN HUMANOS.

 La enfermedad se puede transmitir a

ratones inyectando la proteína purificada
Pr Psc.

 El ratón receptor debe poseer una copia

del gen Pr p responsable de la
producción de la proteína.

 La proteína Pr Psc. puede perpetuarse

A PrPScprotein
haciendo que la proteína PrP recién
can only infect an
sintetizada adopte la forma oligomérica
animal that has
anormal (Pr Psc. ).
the same type of
endogenous PrPC
protein.
 IMPRINTING.

 CONCEPTO:

 Imprinting Genes o Genes Troquelados:

 Son genes que están controlados por metilación de secuencias que actúan en CIS, secuencias que son
vecinas a ellos y que se conocen como DMD differentially methylated domains o ICR imprinting control
region.

 Los individuos diploides contiene dos copias de cada gen o dos alelos. Uno del padre y el otro de la
madre. Ambos se expresan de forma similar.

 Hay casos en que uno de los dos alelos se expresan y el otro silenciado.
 LA METILACION DEL DNA ES RESPONSABLE DEL
IMPRINTING

 Los alelos del padre y de la madre pueden tener diferentes patrones de

metilación en el momento de la fertilización.

 La metilación del DNA se asocia con inactivación génica.

 Cuando los genes están diferencialmente troquelados la supervivencia

del embrión depende de que el mismo reciba el alelo funcional del
parental que lleve el alelo no metilado.

 La supervivencia del heterocigoto que lleva genes troquelados

depende la dirección del cruzamiento.

 Los genes troquelados se encuentran formando clusters que dependen

The typical pattern for imprinting is that a de un ICR en la que ocurre metilación de novo ( SE CRAN NUEVOS
methylated locus is inactive. PATRONES DE METILACION) a menos que se impida específicamente.
 IMPRINTING.

 Ejemplo: gen H19, (imprinted maternally expressed transcript, noncodign protein) y el gen Igf 2
(Insulin growth factor 2).

 SE LOCALIZAN EN EL CROMOSMA 11 Y ESTÁN CERCA UNO DEL OTRO.

 QUE SE OBSERVO?.....

 El gen H19 que está en el cromosoma materno está activado.

 El gen H19 que está en el cromosoma paterno está desactivado.

 El gen Igf2 que está en el cromosoma paterno está activado.

 El gen Igf2 que está en el cromosoma materno está desactivado.
 QUE SE NECESITA PARA QUE HAYA EXPRESION DIFERENCIAL DE ESTOS GENES?.

 Dos secuencias reguladoras :

 a. un amplificador localizado en el extremo 3´del gen H19.
 b. un aislador ICR entre los genes H19 e IGF2.

 El amplificador si tiene los activadores unidos puede activar tanto H19 como Igf2.

 PORQUE HAY ACTIVACION DIFERENCIAL?.

 Todo depende de ICR y su estado de metilación.

 En el cromosoma materno, el amplificador no activa al Igf2 materno porque el ICR fija una proteína CTCF que bloquea
los activadores del amplificador e impide la activación de Ifg2.

 En el cromosoma paterno ICR y el gen H19 están metilados. Por tanto ni el complejo de transcripción ni la proteína
CTCF pueden unirse al ICR. Por tanto el amplificador puede activar al gen Igf2.

 En el cromosoma materno , el gen H19 está metilado de forma adicional por la unión de una MBP a la ICR metilada.
MBP reclutan HATD que reprimen el promotor.
FIGURA 19-31. “Imprinting”. Se muestran dos ejemplos de genes controlados por “imprinting” o
impronta: Igf2 y H19 de mamífero. Como se describe en el texto, en una célula dada, el gen H19
solo se expresa desde el cromosoma materno y el Igf2 desde el paterno. El estado de metilación
del elemento aislador determina si la proteína de unión a la ICR (CTCF) puede unirse y bloquear
la activación del gen H19 desde el amplificador corriente abajo o no.