Cultivos celulares

Tema 1. Principios y métodos básicos de cultivo celular

Prof. Mirja Rotinen

Departamento de Ciencias de la Salud
Universidad Pública de Navarra
Técnicas de cultivo celular (cell culture)
´ Consisten en el cultivo de células dispersas obtenidas de un tejido a partir
de disgregación mecánica, enzimática o química, o de líneas celulares
establecidas.
´ Denominación inicial: cultivo tisular (tissue culture).
´ Incluso utilizado para referirse al cultivos tridimensionales de téjidos no
desagregado (organ culture).

cultivo primario
 Un poco de historia…
´ 1885 Roux. Mantiene células embrionarias de pollo en solución salina durante varios
días.
´ 1907 Harrison. Cultiva médula espinal embrionaria de anfibios. Observa el
crecimiento de los axones de los neuroblastos, y establecé que el axón se formaba
por expansión a partir del cuerpo neuronal y no por fusió́n de una cadena de
células.
´ 1910 Burrows. Logra identificar un medio de cultivo adecuado (plasma) para nutrir
R. G. Harrison los explantes de tejidos embrionarios de pollo.
1870-1959
´ 1912 Burrows y Carrel. Comprueban que las células pueden crecer en cultivo.
´ 1916 Rous y Jones. Emplean por primera vez tripsina para disociar células.
´ 1952 Gey. Establece una línea celular continua de carcinoma cervical humano
conocida actualmente como “línea celular HeLa”.
´ 1954 Rita Levi-Montalcini. Establece que el factor de crecimiento nervioso (NGF)
estimula el crecimiento de los axones en tejidos en cultivo (Premio Nobel 1986).
´ 1955 Eagle. Realiza el primer estudio sistemático de los requerimientos nutricionales
R. Levi-Montalcini de las células en cultivo.
1909-2012
´ 1961 Hayflick y Moorhead. Comprueban que los fibroblastos humanos en cultivo
mueren tras un número limitado de divisiones.
Establecimiento de la línea celular HeLa (1952)

HeLa cells

HENRIETTA LACKS DR. GEORGE OTTO GEY

https://www.youtube.com/watch?v=EpfArSMnH1A
Ventajas de las técnicas de cultivo celular.
´ Control de las condiciones fisicoquímicas y fisiológicas.
Fisicoquímicas: pH, temperatura, presión osmótica, presión de oxígeno (O2) y de
dióxido de carbono (CO2).
Fisiológicas: composición del medio de cultivo en nutrientes, metabolitos,
hormonas, etc.
´ Muestra homogénea - - buena caracterización
´ Economía experimental (vs. in vivo).
´ Aspectos éticos (vs. in vivo).

Desventajas de las técnicas de cultivo celular.

´ Contaminaciones por microorganismos.
´ Coste elevado del equipamiento y material.
´ Desventajas biológicas (vs. in vivo):
• Inestabilidad de las poblaciones celulares (inestabilidad genética, desdiferenciación,
selección…)
• Falta de control nervioso y endocrino
• Ausencia de estructura 3D y de relaciones intercelulares específicas
• Cambios relacionados con el metabolismo energético
Características de la célula cultivada
´ Cultivo primario: se obtiene a partir de células procedentes de un tejido, por
disgregación (enzimática/mecánica/química) o migración.
• son células capaces de proliferar pese a haber perdido las interacciones célula-
célula y célula-matriz extracelular.
• se produce un proceso de selección.
• cuando ocupan toda la superficie disponible de la botella se dice que han
alcanzado la confluencia.
• en esta etapa, las células establecen contactos entre ellas que inhiben su
proliferación y el crecimiento se detiene.
• para mantener el cultivo es necesario transplantar la células a un nuevo soporte
(diluirlas en nuevo medio de cultivo y pasarlas a otros frascos) y realizar sucesivos
subcultivos. En este caso se habla ya de línea celular.
Ø Crecimiento en monocapa:
• Las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o vidrio).
• El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferación celular
• Es el modo normal de proliferación de la mayor parte de las células con
excepción de las células hematopoyéticas

Ø Crecimiento en suspensión:
• Son independientes de anclaje.
• Es propio de células hematopoyéticas, células madre, de algunas líneas
transformadas y de células tumorales.
 Cell Culture Basics Handbook (ThermoFisher Scientific)

Rotinen et al. “ONECUT2 is a targetable master regulator of lethal prostate cancer

that suppresses the androgen axis.” Nature medicine vol. 24,12 (2018): 1887-1898.
 Características de la célula cultivada
´ Líneas celulares finitas: dejan de dividirse tras un número limitado de divisiones en
cultivo (ej. fibroblastos, 25-40 divisiones). Superado ese límite, las células entran en una
etapa que se denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar
(supuestamente por el acortamiento de los telómeros) y mueren.
´ Líneas celulares continuas: sufren una transformación que les hace capaces de crecer
indefinidamente (ej. HeLa) • transformación espontánea
• transformación inducida (radiaciones, virus, agentes químicos…)

(finita)
 Características de las células transformadas in vitro
Relativas al núcleo
• Alta relación núcleo-citoplasma.
• Alteraciones cromosómicas (en número y estructura).

Relativas a la superficie celular

• Cambios en la membrana plasmática (transporte,
movilidad de proteínas, aumento de blebbing).
• Cambios antigénicos, de glucoproteínas de membrana.

Alteraciones de la adherencia
• Independencia de anclaje: disminución de la necesidad de adherencia a superficies.
• Disminución de la capa externa de fibronectina.
• Desorganización de las fibras de estrés (haces de filamentos de actina).
• Aumento de la producción de proteasas y, por tanto, incremento de la proteólisis extracelular.

Relativas al crecimiento y división

• No inhibición del crecimiento por densidad celular.
• Bajos requerimientos de factores de crecimiento.
• Inmortalidad.
• Capacidad de inducir tumores.
Datos tomados de Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. ElSevier Masson (2014) p.267.
 Cultivos histotípicos y organotípicos (cultivos 3D)
´ Cultivo histotípico: amplificación de un solo tipo celular en ambiente
tridimensional que mimetice la estructura original del tejido.
Esferoides: clusters de células formadas por reasociación de células en cultivo.
Pueden crecer en suspensión o en la parte superior de una matriz 3D.
Se pueden obtener por varios métodos:
• método de la superficie no adherente
• cultivo en suspensión: agitación/viscosidad del medio
• método de la gota colgante
*Esferoides multicelulares (MCTS: Multicellular tumor spheroids)

´ Cultivos organotípicos: se caracterizan porque constan de varios tipos celulares

que interaccionan entre sí de una forma que intenta ser lo más similar posible a
la original.
• Este tipo de cultivos persigue la creación “in vitro” de tejidos u órganos completamente
funcionales que puedan ser utilizados en injertos o en transplantes.
• Los cultivos organotípicos constituyen la base de la ingeniería de tejidos.
• Requieren el diseño de soportes especiales que crean una interfaz de aire/medio.
• Ojo! terminología francesa vs. anglosajona.
Esferoides y esferas líquidas. Cultivos celulares en 3D para mimetizar el ambiente de las células en el organismo. J
Meseguer, et al. Departamento de Biología Celular e Histología (Biología Celular), Universidad de Murcia.
Nath S, Devi GR. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacol Ther. 2016;163:94-108. doi:10.1016/j.pharmthera.2016.03.013
 Cultivos organotípicos (cultivos 3D): organs-on-a-chip

Huh D, Matthews BD, Mammoto A, Montoya-Zavala M, Hsin HY, Ingber DE. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 2010;328(5986):1662-1668. doi:10.1126/science.1188302
 Recap:

´ Cultivo de órganos
´ Explantes primarios
´ Cultivo celular primario
´ Líneas celulares
´ Cultivos histotípicos
´ Cultivos organotípicos
EL LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR
Tissue culture room
Tipos de laboratorio de cultivo celular:

´ Niveles de bioseguridad (BSL: biosafety level)

Atendiendo a los agentes biológicos con los que se va a trabajar, los
laboratorios se clasifican como:

• Laboratorio básico – nivel de bioseguridad 1 (BSL-1)

• Laboratorio básico – nivel de bioseguridad 2 (BSL-2)
• Laboratorio de contención – nivel de bioseguridad 3 (BSL-3)
• Laboratorio de contención máxima – nivel de bioseguridad 4 (BSL-4)

Las designaciones del nivel de bioseguridad se basan en una combinación

de las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo,
prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con
agentes biológicos de los distintos grupos de riesgo.
Agentes biológicos: microorganismos, con inclusión de los genéticamente modificados,
cultivos celulares y endoparásitos humanos, susceptibles de originar cualquier tipo de
infección, alergia o toxicidad.

´ Agente biológico del grupo 1: nula o escasa probabilidad de causar una

enfermedad al ser humano.
• Ejemplos: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, ciertas cepas de Escherichia coli.
´ Agente biológico del grupo 2: puede causar enfermedades (supone un riesgo para
los trabajadores) pero existe muy baja probabilidad de que se propague a la
comunidad y se dispone de profilaxis o un tratamiento eficaz.
• Ejemplos: Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii
´ Agente biológico del grupo 3: puede causar enfermedades graves (peligro serio
para los trabajadores) y la infección puede propagarse con cierta facilidad a la
comunidad, si bien existen posibles medidas preventivas o terapéuticas.
• Ejemplos: VIH, Coxiella burnetii, Mycobacterium tuberculosis.
´ Agente biológico del grupo 4: puede causar enfermedades graves (peligro serio
para los trabajadores) y la infección puede propagarse con cierta facilidad a la
comunidad. No existe profilaxis o un tratamiento eficaz disponible.
• Ejemplos: Virus del ébola, de Marburg y de Lassa.
Los básicos de un laboratorio de cultivo celular:
´ Cabina de flujo laminar
´ Incubador de CO2
´ Microscopio invertido
´ Centrífuga para tubos
´ Contador de células
´ Material estéril
´ Contenedor para desechar material
biológico
´ Baño termostático
´ Congeladores y depósito de N2 líquido
 La importancia de mantener una técnica aséptica para
evitar contaminaciones
´ Asepsia: ausencia absoluta de gérmenes. Sin infección o contaminación. Conjunto de
procedimientos o métodos para evitar la contaminación. Exclusión continua de
microorganismos contaminantes.
´ Esterilización: eliminación de toda forma de vida de un material o medio. Conjunto de
procedimientos que destruyen los gérmenes, impiden su desarrollo y evitan
contaminación.
´ Desinfección: conjunto de procedimientos para destruir o eliminar agentes
contaminantes de todo lo que no pueda esterilizarse (por ejemplo: mobiliario).

Click here: https://youtu.be/zXPiZ2XBUzE

levaduras
293 cells contaminated with yeast
Contaminantes de cultivo celulares:

´ Químicos: impurezas en el medio, suero o agua, incluyendo endotoxinas,

plásticos y detergentes.
´ Biológicos: bacterias, levaduras, hongos, micoplasma, virus y otras líneas
celulares.

(Hoechst: colorante fluorescente que tiñe núcleos y el micoplasma)

hongos
 Click here: https://www.youtube.com/watch?v=P4dTbKVDIZ4&feature=emb_rel_end

Tips:
• Observar cuidadosamente los cultivos visualmente y al microscopio invertido
• Mantener los cultivos libres de antibióticos para poder evidenciar contaminaciones ocultas.
• Verificar la esterilidad de los reactivos antes de usarlos.
• No compartir medios o reactivos con otros usuarios.
• No usar los frascos de medio u otro reactivo para diferentes líneas celulares.
• Mantener el estándar de esterilidad todo el tiempo.
Elementos del ambiente aséptico:
• Área tranquila
Si no se tiene una campana de flujo laminar, se necesita un cuarto estéril o por lo menos un espacio tranquilo con poco
movimiento de personal. Si se tiene flujo laminar, debe estar libre de corrientes de aire de puertas y ventanas. No debe
tener cerca equipo que genere corrientes de aire, como centrífugas, refrigeradores, congeladores.
• Superficie de trabajo
La superficie de trabajo debe estar limpia y ordenada. Hay que limpiarla con alcohol al 70%. Sólo colocar en la mesa el
material para utilizar en el procedimiento. Tener una superficie de trabajo al centro, libre de equipos y cosas que
puedan contaminar. Si algo se derrama, hay que limpiarlo inmediatamente con alcohol.
• Higiene personal
Las manos deben lavarse frecuentemente. Usar guantes quirúrgicos cuando haya riesgo o peligro. De acuerdo a la
Food and Drug Administration (FDA), para Good manufacturing Practices (GMP) es necesario usar gorro, mascarilla y
ropa quirúrgica. No es necesario si se tiene campana de flujo laminar, pero se debe usar bata y recoger el cabello.
• Reactivos y medio
Limpiar las superficies externas con alcohol. Hay que quitar las envolturas antes de colocar los frascos en la campana.
• Cultivos
Si vienen de otros laboratorios hay un alto riesgo de que estén contaminados ya sea por su fuente o por el tránsito.
TÉCNICAS DE CULTIVOS CELULARES E INGENIERÍA DE TEJIDOS (ISBN 978-607-28-0688-7)
Más consejos:
1. Usa frascos de cultivo sellados siempre que sea posible, especialmente para cultivos por largo tiempo.
2. Evita verter (decantar) medio de cultivo, en su lugar, usa pipetas. Si no se puede evitar verter, usa gasa estéril
para eliminar el medio de cultivo que haya quedado en el cuello del frasco.
3. No uses la campana como área de almacenamiento: las cajas, botellas, etc., además de agregar carga
microbiana, alteran el patrón laminar del aire.
4. Usa bata de laboratorio limpia para proteger el cultivo de contaminantes provenientes de la piel o de la ropa. Su
uso debe ser restringido al área de cultivo celular.
5. Trabaja en la campana sólo con una línea celular a la vez. Para evitar posibles contaminaciones cruzadas, usa
recipientes separados de medios para cada línea celular. Usa desinfectante para limpiar la superficie de trabajo
entre líneas celulares.
6. Transporta tus cultivos no sellados en bandejas, para minimizar el contacto con contaminantes transportados por
aire.
7. Usa medio de cultivo libre de antibiótico para el mantenimiento rutinario.
8. Mantén los recipientes abiertos tan poco tiempo como sea posible.
9. Haz alícuotas de soluciones estériles con volúmenes pequeños para reducir el número de veces que debe ser
abierto.
10. Deja el flujo laminar encendido durante el día. Apágalo sólo cuando no sea usado por periodos extensos.
11. Si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir.
12. Reduce los accidentes marcando cuidadosamente los cultivos y las soluciones. Indica si han sido esterilizados.
13. Mantén el área limpia

TÉCNICAS DE CULTIVOS CELULARES E INGENIERÍA DE TEJIDOS (ISBN 978-607-28-0688-7)

 Cabinas de flujo laminar:
´ La función principal de un flujo unidireccional/laminar es proporcionar un área de trabajo libre de
partículas y contaminación.
´ Esto se consigue gracias a la ausencia de partículas al ser filtrado el aire por un filtro de alta eficiencia HEPA
(high efficiency particulate air). El filtro HEPA retiene partículas desde un tamaño de 0.3 µm con una
eficiencia del 99,97%.
´ Filtros ULPA (Ultra Low Penetration Air): 99,9995% de eficiencia para la filtración de partículas MMPS (0,1 –
0,25 micras).
´ El aire impulsado debe tener una uniformidad de velocidad controlada acorde a la normativa a cumplir.

Elsevier Masson 2ª Edición.

Montuenga L. Técnicas en histología y biología celular. Ed.
´ Configuración de las cabinas:
• Vertical: protección del operador y del medioambiente.
Para trabajar con patógenos.
• Horizontal: protección de la muestra.

´ Recomendaciones:
• Encender lámpara ultravioleta 30 minutos antes (germicida).

• No generar corrientes de aire.

• Cambiar periódicamente los filtros.
 ´ Clase I
Tipos de cabinas: ´ Clase II: A1, A2, B1 y B2
´ Clase III

Clase II Clase III

Clase I

Clase I: protección al operador y al ambiente. Clase III: protección al operador, a la muestra y al

No protége el producto con el que se trabaja. ambiente
Cabina totalmente sellada.
Clase II: protección al operador, a la muestra y al Adecuada para trabajar con agentes del grupo 4
ambiente.
Adecuada para trabajar con agentes del grupo 1, 2 y 3
 ´ temperatura

Incubador de CO2: control de ´ humedad

´ presión parcial de CO2
• La T óptima depende de la temperatura corporal del animal del que
proceden las células. También varía según el tejido (ej. testículo).

El hombre y la mayoría de animales de sangre caliente: 36,5-37ºC

Excepciones: aves (39-40ºC), cerdos (38,5ºC)

• La humedad es elevada para evitar la evaporación del medio de

cultivo.

• El nivel de CO2 suele ser de en torno al 5%.

El CO2 en la fase gaseosa se disuelve en el medio, estableciéndose un

equilibrio con los iones de bicarbonato y estabilizando el pH.

La mayoría de las líneas celulares crecen bien a pH de 7.4, pero el pH

óptimo para una determinada línea celular puede variar: fibroblastos
(7,4-7,7), células transformadas (7-7,4).

• El nivel de O2 es variable. La presión atmosférica (21%) es suficiente para

células en cultivo.

El requerimiento es mayor en el cultivo de órganos (hasta un 95%).

La profundidad del medio de cultivo puede influir en la tasa de

*En los más modernos: + filtro HEPA difusión del O2 a las células (aconsejable 2-5 mm altura; 0,2 a 0,5
+ inyección agua filtrada mL/cm2).
Microscopio invertido:
fuente de luz y ´ Su amplia distancia de trabajo permite observar
condensador especímenes o muestras gruesas, como células
creciendo en medios de cultivo de varios milímetros de
espesor.
´ Permiten observar las muestras situadas en el fondo de
un recipiente. Esto es muy útil para mantener
revólver las muestras hidratadas y permite hacer observaciones
de muestras vivas durante largos periodos de tiempo.
´ La platina se encuentra en posición fija. Para enfocar la
muestra lo que se mueven son los objetivos.
´ El contraste de fases, la fluorescencia, o de interferencia
diferencial… son algunos de las técnicas de observación
usadas con los microscopios invertidos para el estudio de
las células vivas.
´ Se utilizan para las técnicas de fecundación in vitro.
microscopio
invertido con monitor
en vez de oculares
Recuento celular: hemocitómetro

https://www.youtube.com/watch?v=pP0xERLUhyc
&list=TLPQMTAwODIwMjBVl6Mh5_il6w&index=2
 Recuento celular automatizado: contador electrónico y análisis de imagen

´ Contadores coulter
´ Análisis de imagen
´ Citometría de flujo

Esquema contador Coulter

Recipientes de cultivo y sustratos:
´ Las células hematopoyéticas y algunas células transformadas pueden proliferar sin adherirse al
sustrato. Crecen en suspension.
´ La mayoría de células son dependientes de anclaje: necesitan adherirse al sustrato (matriz o base
sólida) para dividirse.
´ Originalmente se utilizó el vidrio (barato, fácil de lavar, esterilizable, opticamente claro). Hoy en
día se utiliza plástico (poliestireno) con una superficie totalmente plana y propiedades ópticas
superiores.
´ El poliestireno es hidrofóbico, no adecuado para la adhesión celular, por eso debe recibir un
tratamiento químico o con radiación γ, para producir una superficie con carga y capaz de
humedecerse.
´ En algunos casos se usan recubrimientos de proteína de la matriz extracelular para mejorar la
adherencia (colágeno, fibronectina, laminina).
Los medios de cultivo:
Composición de un medio típico adecuado para el cultivo de células de mamífero

Aminoácidos Vitaminas Sales Varios Proteínas

Arginina Biotina NaCl Glucosa Insulina
Cisteína Colina KCl Penicilina Transferrina
Glutamina Folato NaH2PO4 Estreptomicina Factores de
Histidina Nicotinamida NaHCO3 Anfotericina B crecimiento
Isoleucina Pantotenato CaCl2 Rojo fenol específicos
Leucina Piridoxal MgC2 Suero
Lisina Tiamina
Metionina Riboflavina
Fenilalanina
Treonina
Triptófano
Tirosina
Valina
Datos tomados de Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. ElSevier Masson 2ºEdición (2014) p. 274
Los medios de cultivo:
´ Las formulaciones más comunes:
• MEM o EMEM: medio esencial mínimo de Eagle, Eagle´s minimum essential medium
• DMEM: medio de Eagle modificado por Dulbecco, Dulbecco´s modified Eagle medium
• RPMI: formulación de Roswell Park Memorial Institute
• Otros: F12 (Ham´s nutrient mixture), Opti-MEM, Media 199

´ Soluciones salinas: ej. PBS (Phosphate-Buffered Saline)

• Contienen sales inorgánicas y en algunos casos, glucosa y bicarbonato
• Para diluir medios, hacer lavados e incubaciones cortas (no más de 4h siempre y cuando
lleven glucosa)
• Son soluciones isotónicas pero no necesariamente nutrientes

´ Suero (5-20%)
• Los más comunes: FBS (suero fetal bovino), el de ternera recién nacida, de caballo y
humano.
• Contiene factores de crecimiento y factores de adhesión.
• Fuente de minerales, lípidos (vitaminas liposolubles) y hormonas.
• Obtención: coagulación-filtrado-control-inactivación
• Importancia de la adquisición de lotes completos para evitar varibilidad en los resultados
Los medios de cultivo:

Componentes del suero

Proteínas Factores de Hormonas Lípidos Minerales

crecimiento
Fibronectina PDGF Insulina Ácido oleico Zinc
Albúmina GH Hidrocortisona Ácido linolénico Hierro
Transferrina EGF Etanolamina Selenio
α2-macroglobulina FGF Fosfatidiletanolamina Cobre
VEGF Colesterol
IGF-1 Prostaglandinas
Congelación:
´ Las células en cultivo de mamífero no toleran aumentos de más de 2ºC por encima
de su temperatura óptima (las humanas mueren rápidamente a 40ºC).
´ En cambio, pueden tolerar disminuciones de temperatura: pueden sobrevivir varios
días a 4ºC o ser congeladas (-80ºC; -196ºC en nitrógeno líquido).
´ Para su congelación necesitan se agentes crioprotectores (DMSO o glicerina) para
evitar la formación de cristales de hielo.
Aplicaciones del cultivo celular:

Cell Culture Basics Handbook (ThermoFisher Scientific)

VIDEOS

https://www.youtube.com/watch?v=CA5fVLK5zAE

https://www.youtube.com/watch?v=ON2e1VsBhJk

https://www.youtube.com/watch?v=CMRKKl9XSDU