Genética Molecular Medicina UCM 2012-2013

Universidad Complutense de Madrid
GENÉTICA
MOLECULAR 2012/2013
HUMANA
Zhao Hui Chen
Segundo de Medicina 1ª
Profesora: Consuelo Calle

Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
CONTENIDO
1. Concepto de genoma. Niveles de organización estructural del DNA. Estructura

primaria. Estructura secundaria: reglas de Chargaff, modelo de la doble hélice de Watson y
Crick. Otros tipos de hélices. DNasas: Tipos.
2. Estructuras terciarias del DNA: superenrollamientos positivos y negativos.
Concepto de topoisomeros. Tipos y mecanismo de acción de las topoisomerasas
3. Estructura de la cromatina. Condensación del DNA en nucleosomas y desarrollo de
estructuras de compactación superiores.
4. Características generales de la organización funcional del DNA nuclear y
mitocondrial.
5. Replicación del DNA. DNA polimerasas y otras proteínas implicadas.
6. Replicación y mantenimiento de los telomeros. Replicación del DNA mitocondrial.
Agentes inhibidores de la replicación.
7. Metodología en Genética Molecular (I): Tipos de vectores: plásmidos,
bacteriofagos, cósmidos, cromosomas bacterianos artificiales, cromosomas artificiales de
levadura. Utilización de enzimas de manipulación del DNA. Enzimas de restricción.
8. Metodología en Genética Molecular (II): Principales metodos de secuenciación del
DNA: Método de Maxam-Gilbert y metodo de Sanger. Proyecto genoma humano.
9. Ciclo celular: definición de las distintas fases. Papel de las ciclinas y quinasas
dependientes de ciclinas en la progresión del ciclo celular.
10. Complejo promotor de anafase: Componentes y función. Activación y mecanismos
de acción: regulación de la concentración de ciclinas de fase S, participación en el punto de
control del huso mitótico.
11. Metodología en Genética Molecular (III): Amplificación de secuencias de DNA.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Aplicaciones.
12. Mutación y daño del DNA. Tipos, procesos y agentes implicados. Mutaciones
mitocondriales.
13. Mecanismos de reparación del DNA por eliminación de bases alteradas o
malapareadas. DNA glicosilasas: Tipos y mecanismos de acción.
14. Mecanismos de reparación del DNA por escisión de nucleótidos: Reparación de
bases malapareadas: Enzimas y procesos implicados. Mutaciones de factores de reparación
asociados al cáncer.
15. Reparación de simples y dobles mellas del DNA. Procesos de recombinación
homóloga y no homóloga.
16. Recombinación genética específica de sitio. Recombinación genética de los genes
de las inmunoglobulinas. Aplicación a la inactivación genica “knockout”.
17. Mecanismos de control de las diversas fases del ciclo celular por los sistemas de
reconocimiento del daño del DNA: ATM (Ataxia Telangectasia Mutated) y ATR/ATRIP.
18. Transcripción del DNA. Tipos de genes y RNA polimerasas implicadas.
Transcripción de genes de tipo I y III.
19. Transcripción de genes de tipo II. Agentes inhibidores de la transcripción.
20. Modificaciones post-transcripcionales de los distintos tipos de RNAs.
21. Modificación post-transcripcional de los tránscritos primarios de mRNA por
ensamblaje de los exones y eliminación de intrones.
22. Metodología en Genética Molecular (IV): Transcripcón inversa del mRNA.
Obtención de cDNA. Librerias de cDNA.
23. Metodología en Genética Molecular (V): Técnicas de hibridación de DNA y RNA:
Southern, Northern, Micromatrices o “chips” de DNA. Utilidad clínica.
24. Metodología en Genética Molecular (VI): Polimorfismos del DNA: RFLPs,
VNTRs. Utilidad de los polimorfismos en la clínica.
1
25. Traducción del mensaje genético. Características generales del código genético.
Particularidades del código genético mitocondrial. Relación codon-anticodon. Efecto de las
mutaciones en el DNA sobre la proteína traducida.
26. Estructura secundaria y propiedades funcionales del RNA de transferencia.
Mecanismos de acción de las aminoacil-tRNA sintetasas.
27. Síntesis ribosómica de la cadena peptídica: estructura y composición de los
ribosomas. Etapas de la traducción y factores proteicos de regulación implicados. Agentes
inhibidores de la traducción.
28. Metodología en Genética Molecular (VII): Utilización de plasmidos y fagos como
vectores de clonación y reconocimiento por tests de resistencia a antibioticos. Clonación
de organismos superiores.
29. Regulación de la transcripción de genes de tipo II. Factores de transcripción
inducibles (activadores y represores). Concepto y función de coactivador, correpresor,
complejo remodelador de la cromatina.
30. Modificaciones covalentes de las histonas y el DNA: Mecanismos generales de
activación y represión de la transcripción. Silenciamiento génico, impronta genómica,
formación de heterocromatina.
31. Papel como factores de transcripción de la superfamilia de receptores nucleares
para hormonas, vitaminas y metabolitos: Aspectos estructurales, familias, ligandos y
elementos de respuesta.
32. Mecanismos de regulación post-transcripcionales: Corte y empalme alternativo del
mRNA. Degradación del mRNA. Interferencia del RNA.
33. Regulación de la traducción a nivel de la iniciación: Fosforilación del factor eIF2.
Señalización a través del sistema mTOR: Activación de 4EBP, y S6 -quinasa.
34. Metodología en Genética Molecular (VIII): Utilización de plásmidos como
vectores de expresión: productos de DNA recombinante usados en medicina.
35. Metodología en Genética Molecular (IX): Terapia génica. Terapia con células
madre. Terapia con anticuerpos anti-receptor.
36. Genética metabólica. Regulación de la expresión génica de los enzimas del
metabolismo de carbohidratos y lipidos. Receptores y ligandos naturales o sintéticos
relacionados.
37. Regulación del crecimiento y proliferación celular. Cascadas de señalización. Papel
de las quinasas y GTPasas.
38. Mecanismos generales de transformación tumoral: Mecanismos de activación de
proto-oncogenes: oncogenes celulares y virales.
39. Inactivación de genes supresores de tumores y su incidencia en el control del ciclo
celular.
40. Bases moleculares de algunas enfermedades cancerosas: neurofibromatosis,
retinoblastoma. cancer de mama. cancer colorectal.
41. Bases moleculares de enfermedades relacionadas con defectos en receptores proteicos:
hipercolesterolemia familiar. Con defectos en proteínas estructurales: distrofia muscular de
Duchenne.
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TEMA 1: CONCEPTO DE GENOMA

Genoma es la larga secuencia de DNA que porta el conjunto completo de información
hereditaria que tiene el organismo y requerido para sostener sus procesos vitales.
Genotipo: es la constitución genética de un organismo concreto.
Fenotipo: es el aspecto externo y otras características medibles de un organismo que son

consecuencia de la interacción entre el genotipo y el entorno.
El genoma en eucariotas incluye el DNA cromosómico y el DNA mitocondrial. El genoma

humano físicamente se divide en 23 pares de cromosomas y funcionalmente en genes
aproximadamente 25000. Gen es una secuencia más o menos grande del DNA que puede tras su
transcripción dar lugar a un mRNA, un tRNA o un rRNA.
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NIVELES DE ORGANIZACIÓN ESTRUCTURAL DEL ÁCIDO

DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA)
ESTRUCTURA PRIMARIA
El nucleótido es la base de todo DNA (ácido

nucleico). Está formado por tres elementos: base
nitrogenada (purina o pirimidina), una pentosa que
es la ribosa (si tiene un OH en la posición 2 es
ribosa) o desoxiribosa, y el fosfato.
Las bases son: purinas o pirimidinas. Las purinas

son dos ciclos. Las pirimidinas son un solo ciclo.
Las dos bases fundamentales son la adenina y
guanina (purinas)
*saberse las fórmulas de las bases.
Las pirimidinas: La citosina y la timina están en el

ADN. En el ARN, tenemos uracilo que es producto
de desmetilación de la timina.
Un nucleósido es un nucleótido sin el grupo

fosfato.
En la estructura secundaria, las bases pueden girar a

la derecha o la izquierda sobre el enlace beta-
glucosidico.
La forma “sin” es cuando la base está girada a la izquierda, mientras que la forma “anti”
es cuando está la base girada a la derecha.
La estructura primaria es una cadena de nucleótidos. La secuencia 5´ a 3´ colocadas de forma

anti y sin es la estructura primaria unidos por enlaces fosfodiester en la posición 5´.
El extremo 5ès la posición del fosfato colocado en el carbono 5`del nucleótido final. El
extremo 3ès la posición del OH en el carbono 3`del otro extremo. En un ácido nucleico
hablamos de 5à 3`.
PRIMEROS ESTUDIOS SOBRE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL DNA
En los años 20 del siglo XX, LEVENE había determinado que la 2-desoxiribosa era el azúcar de
los nucleótidos del DNA. Pero se equivocó al decir que mientras el DNA animal contenía
nucleótidos de desoxiribosa, el vegetal contenía nucleotidos de ribosa.
Además propuso un modelo para la conformación de los ácidos nucleicos: el tetranucleótido

plano, según el cual, el ácido nucleico estaba formado por planos apilados de 4 pentosas que
exponían al exterior sus bases nitrogenadas unidas mediante enlaces glucosídicos. Y las
pentosas a su vez unidas entre sí por enlaces fosfodiéster en el interior.
Este modelo sugería moléculas monótonas y rígidas que dificílmente podrían transmitir la
información genética.
4
Se pensó en las proteínas como transmisoras….
UN PASO ADELANTE: REGLAS DE CHARGAFF
El modelo para el DNA del Tetranucleotido plano de LEVENE empezó a ponerse en entredicho
cuando en 1950 CHARGAFF (1905-2002), en la Universidad de Columbia, describió sus leyes
de complementariedad de bases. Entre ellas:
- La cantidad total de nucleótidos pirimidínicos (T+C) es siempre igual a la cantidad total de

nucleótidos púricos (A+G).
- La cantidad de T, es siempre igual a la de A y la cantidad de C, es siempre igual a la de G.
OTRO PASO ADELANTE: ESTUDIOS DE DIFRACCIÓN DE RAYOS X
El pionero en la aplicación de esta técnica a la estructura del DNA fue ASBURY en 1938,
indicando que parecía una fibra periódica con un espaciado regular de las bases de 0.33 nm.
En los años 50, en el laboratorio de RANDALL, en el King’s College de Londres, FRANKLIN

(1920-1958) y WILKINS (1916-2004), habían observado que el DNA era largo y fino, que
estaba formado por dos partes que corrían paralelamente a lo largo de la molécula y que
formaban una estructura helicoidal con los fosfatos hacia el exterior.
Paralelamente PAULING había propuesto un modelo de triple hélice con los fosfatos hacia el
interior y las bases hacia fuera, con reminiscencias del modelo del Tetranucleótido.
ÚLTIMO PASO: ESTUDIOS CON MODELOS MOLECULARES
Todos los pasos anteriores que acabamos de comentar, ayudaran a WATSON (1928- ) y CRICK
(1916-2004) (Universidad de Cambridge) a descubrir en 1953 la estructura secundaria del DNA.
Lo publican en la revista Nature el 25 Abril 1953. (Nature 171:737,1953)
Obtienen junto con WILKINS el Premio Nóbel en Medicina en 1962.
INTERACCIONES MOLECULARES SUSTENATADORAS DE LA

ESTRUCTURA SECUNDARIA
- Puentes de H: Un DNA de doble hebra, un nucleótido de A con T se unen con dos

enlaces H. A tiene que ser anti y la T tiene que ser sin (por ejemplo). Entre C y G hay 3
enlaces de H. Básicamente si una base es en forma sin, la otra base tiene que tener
forma anti. Una base puede ser en una posición sin y en otra anti.
- Interacciones hidrofóbicas
- Fuerzas de van der Waals
- Interacciones electroestáticas etc.
TIPOS DE HÉLICES DE ESTRUCTURA SECUNDARIA
Existen diferentes tipos de hélices:
- Forma A: gira a la derecha: 26 Amstrong; pares de bases por vuelta de hélice: 11

- Forma B: gira a la derecha: 20; 10, 5
- Forma Z: gira a la izquierda: 18; 12.
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ENZIMAS NUCLEASAS
Son enzimas que hidrolizan los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos in vivo e in vitro.
Estas enzimas están presentes en todas las células de nuestro organismo. Su asentamiento
celular en los lisosomas. En mamíferos, el páncreas es un importante productor. Otro es el
intestino, donde llevan a cabo la digestión de los ácidos nucleicos de la dieta.
Clasificación principal:
- Desoxirribonucleasas (DNasas)
- Ribonucleasas (RNasas)
Los RNA, al ser cadenas simples, son más sensibles a la rotura de sus enlaces fosfodiester.
DESSOXIRRIBONUCLEASAS DNAasas
Hidrolizan los enlaces fosfodiester en el DNA. Si actúan sobre los enlaces externos se llaman
exonucleasas, sobre los internos endonucleasas.
Ej: Enzimas de restricción: son un tipo de desoxirribonucleasas-endonucleasas que actúan

especificamente sobre determinadas zonas palindrómicas del DNA. Ej: EcoR1:
5’-G†A-A-T-T-C- 3’
3’-C-T-T-A-A†G- 5’(las veremos en el Tema 7)
Ej: Topoisomerasas: son un tipo de desoxirribonucleasas-endonucleasas que afectan al DNA

en sus superenrrollamientos (las veremos en el Tema 2).
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TEMA 2: ESTRUCTURAS TERCIARIAS

El DNA es una molécula negativa porque tiene todos los grupos fosfatos fuera y es muy
negativo.
Los ácidos nucleicos tienen hasta una estructura terciaria, los RNA hasta 2.
Existen unos segmentos de DNA que pueden presentar

estructuras de orden terciaria como:
1- Formas cruciformes
Se puede formar si tenemos una estructura secundaria.
Cuando se da un acercamiento de palíndromo o similar,
cuando los extremos son pseudopalindromicos, se
sustentaría la estructura de cruz por puentes de hidrogeno
entre bases complementarias, sin embargo hay partes en
las que no se pueden formar puentes de hidrogeno y se
abre.
2- Triples hélices
Pueden formar una triple hélice, las secuencias de DNA de
solo purinas, unidas a otras de solo pirimidinas, utilizando
además de las uniones de Watson-Crick, las uniones
Hoogsteen.
El segmento de polipurinas que son solo purinas (AG)n,

enfrentado a un segmento de solo pirimidinas (TC)n, se
observa que en esas condiciones, se podían dar puentes de H
que contemplaban los cálculos de Watson y Crick y los de
Hoogsteen, según esto una base púrica como la adenina anti
según Crick con una timina a través de dos puentes de
hidrogeno que es lo tradicional. Pero resulta que a la misma
adenina por su otro lado puede formar con otra timina otros dos puentes de hidrogeno y esa
unión es de Hoogsteen. Así seguidamente se forman enlaces de Watson-Crick y Hoogsteen y se
da la forma de triple hélice. Cuando una secuencia es toda bases púricas, se mantiene por un
lado con uniones Watson y Crick y por otro mediante uniones Hoogsteen.
3- Superenrollamientos
Tipos de sobrenrollamiento:
- sobre proteínas: toroidal, espiral o de forma cilíndrica y con dos direcciones: dextrógiro que es
positivo o levógiro que es negativo.
- sobre sí mismo: plectonémico o interenroscado y también con dos direcciones pero con signos
al revés: dextrógiro que es negativo o levógiro que es positivo.
Nuestro DNA está en contacto con histonas (se enrollan sobre ellas) formando nucleosomas
tipo toroidal.
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LA MAYOR PARTE DE LOS DNA NATURALES
Están superenrollados plectonémicamente de forma dextrógira y signo (-), alterando la forma

global del DNA y constituyendo un depósito de energía libre en forma de tensión helicoidal.
Esta tensión cuando se relaja, permite la separación de las dos hebras en los procesos que se
necesita, como son la replicación ó la transcripción.
Una molécula de DNA superenrollada es más compacta que una molécula de DNA relajada de
la misma longitud. Por tanto, cuando se somete p. ej. a electroforesis ó a centrifugación el DNA
superenrollado, se desplaza más rápidamente al fondo del gel en un caso o del tubo en otro, que
el DNA relajado.
La forma fisiológica es la superenrollada. En una electroforesis el DNA relajado se va a arriba y
el superenrollado se va abajo.
Nº DE GIROS DE UN DNA
Recordemos que el DNA en la forma B tiene un giro cada 10,5 nucleótidos en su

estructura 2ª y que estos giros son dextrógiros (+).
Entonces, el nº de giros de un DNA = nº pares de bases/ 10,5

Así en un DNA de 378 pb, el nº de giros = 378/10,5 = 36
Los superenrollamientos de la doble hélice del DNA no modifican el número de giros
del DNA.
nº de enlace (Lk) = nº de giros + nº de superenrollamientos
Lk = Tw + Wr
Así, si queremos que Lk sea siempre 5
Sin superenrollamientos será:
5 = 5 (dex +) + 0 (DNA relajado)
Con superenrollamientos toroidales será p.e.:
5 = 2 (dex +) + 3 (dex +), es decir: [2+(3+)=5]
Con superenrollamientos plectonémicos será p.e.:
5 = 8 (dex +) + 3 (dex-), es decir: [8+(3-)=5]
Los superenrollamientos dextrógiros son los más fisiológicos, pero en laboratorio

podemos trabajar con los dos.
El nº de enlace va disminuyendo con un incremento sucesivo de superenrollamientos

plectonémicos
Lk = Tw + Wr
Sin superenrollamientos o relajado será por ej.:

5 = 5 (dex +) + 0
Con incremento sucesivo de superenrollamientos plectonémicos será:
4 = 5 (dex +) + 1 (dex-), es decir: [5+(1-)=4]
3 = 5 (dex +) + 2 (dex-), es decir: [5+(2-)=3]etc..
A medida que bajo en una electroforesis, el Lk disminuye. Por eso arriba del todo estarán los
relajados, sin superenrollamientos.
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LAS TOPOISOMERASAS
Hemos dicho en el tema 1 que son desoxirribonucleasas-endonucleasas. Desenrollan el
DNA superenrollado eliminando superenrollamientos.
Estas enzimas son: Top I y Top II en procariotas y eucariotas.
Las Top I: inducen roturas temporales en una hebra, lo que permite que la cadena no
cortada, pase a través de la rotura antes de que esta se repare. Se elimina un
superenrollamiento y se aumenta el nº de enlace (Lk) en 1.
Las Top II: inducen roturas temporales en ambas hebras a través de las cuales pasan un
segmento del DNA duplex no cortado antes de volver a sellar la rotura. Necesitan la
energía del ATP. Se eliminan dos superenrollamientos y se aumenta el nº de enlace en
2.
Así, las topoisomerasas cortan y reparan el DNA de manera continua hasta miles de
veces por segundo, dando lugar a topoisomeros mas desenrollados con un Lk más alto.
Acción de las Topoisomerasas sobre el

nº de enlace (LK)
Lk = Tw + Wr
Ej: 32 = 32 + 0 DNA relajado
32 = 36 +4(-) DNA con 4 superenroll plect
Top I Top II
33 = 36+3(-) 34 =36+2(-)
El Lk aumenta en 1 El Lk aumenta en 2
Serán Topoisomeros entre sí, los DNAs que varían en el nº de enlace Lk, es decir los
aquí presentes con Lk: 32, 33 y 34.
TOP I
Se sabe más de las Top I que las del Top II.

Actúa sobre el DNA, ese DNA en el extremo de la doble hélice de DNA no
puede girar en relación al otro extremo. Están sujetos sobre los extremos y
eso permite que se puedan superenrrollar.
Para la acción de las topoisomerasas rompe para eliminar los

superenrrollamientos.
La Top I tiene entre sus aa una tiroxina en su sitio activo ese es el aa

fundamental para Top I. La DNA topoisomerasa se une covalentemente a
un fosfato del DNA y rompe así un enlace fosfodiéster de la cadena del
DNA. Tras esa rotura, los dos extremos pueden girar uno respecto al otro
disipando así la tensión acumulada.
La energía del enlace fosfodiéster original se almacena en el enlace

fosfostirosina, lo que hace que la reacción sea reversible. Espontáneamente
se vuelve a formar el enlace fosfodiéster, regenerándose la hélice de DNA
como la DNA topoisomerasa no alterada y puede salir. De esta forma
elimina un superenrrollamiento y se recupera el DNA y su Lk aumenta en 1
al eliminar un superenrrollamiento.
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TOP II
La Top II rompe las dos hebras del DNA.
Partimos de dos dobles hélices de DNA circular entrelazadas. Una DNA

topoisomerasa de tipo II de manera covalente y reversible a las dos cadenas de
DNA, interrumpiendo la doble hélice naranja y generando una puerta proteica.
El azul de la TopII es la parte que tiene capacidad ATPasa. La Top IIse
introduce. Cuando una proteina entra en contcato con el dna se abre una pierta
proteica.
La puerta abierta por la topoisomerasa se abre y se cierra dejando pasar a la otra

hélice del DNA. La reacción inversa de la unión covalente de la topoisomerasa
restaura una doble hélice intacta. Las dos dobles hélices de DNA circular se han
separado.
LA ACTIVIDAD TOPOISOMERASA ESTÁ INCREMENTADA

EN PROCESOS TUMORALES
Mientras que en células sanas la actividad topoisomerasa está dentro de

la normalidad.
• Se sabe que en células tumorales, la actividad de las
topoisomerasas está muy incrementada. Esto produce:
- una pérdida de superenrollamientos que induce relajación del DNA
- un fuerte incremento del nivel de replicación, transcripción y
traducción de los genes
- un aumento del crecimiento celular de forma patológica.
• Estos hechos han llevado a la búsqueda farmacológica de
inhibidores de topoisomerasas que puedan inhibir estos procesos
y a la larga causar muerte celular ó “apoptosis”.
ALGUNOS INHIBIDORES DE TOPOISOMERASAS

Unos se usan como fármacos antitumorales fundamentalmente en neoplasias hematológicas
solos ó combinados, por ej:
- La camptotecina inhibe la top I humana, mediante la estabilización del complejo

enzima Top I-DNA.
- El M-Amsa y el etoposido inhiben a la top II humana, estabilizando el complejo Top
II-DNA.
En todo caso se inhibe el desenrollamiento del DNA y su replicación, lo que lleva a causar
muerte celular o apoptósis.
Otros inhibidores de topoisomerasas se usan como antibióticos contra topoisomerasas

bacterianas por ej: la novobiocina, o el ácido nalidixico, actúan especialmente sobre la
topoisomerasa bacteriana: DNA gírasa, inhibiendo su acción y por tanto dificultando la
replicación bacteriana y causando a la larga la muerte bacteriana.
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TEMA 3: ESTRUCTURA DE LA
CROMATINA
EL DNA PROCARIOTA
Recordemos que los procariotas no tienen núcleo y su DNA por tanto, no está delimitado en él.
El DNA de E. coli, es de doble hebra, circular y está superenrollado y comprimido formando un
complejo unido a un centro proteico llamado “nucleoide” a través de más de 40 sitios.
Este DNA tiene un tamaño de 4.639.221 pb ~4,6 x 10 6 pb (2 m) y 4.405 genes. Fue
secuenciado en 1997.
Su empaquetamiento se potencia más aún con la proteína HU que facilita el superenrollamiento.

También hay presentes poliaminas como la espermidina que están cargadas (+) y ayudan a
neutralizar la negatividad del esqueleto del DNA debida a los grupos fosfatos.
Pero es “desnudo” porque carece de proteínas formadoras de superestructuras, es decir de

histonas.
EL DNA EUCARIOTA ES “NO DESNUDO” Y CONSTITUYE PARTE DE LA

DENOMINADA CROMATINA
A diferencia de los procariotas que no tienen núcleo delimitado, los eucariotas si que poseen
núcleo delimitado por una membrana nuclear.
En ese núcleo y como sustancia amorfa dispersa en el, está la cromatina, que está formada por
una mezcla de DNA (35%), RNAa (5%) t proteínas (6%).
Las proteínas pueden ser del tipo histona: H1, H2A, H2B, H3, H4, o también del tipo no
histonico: como polimerasas de DNA y de RNA, topoisomerasas I, II; proteínas de regulación;
proteínas de citoesqueleto etc.
Hay dos constituciones de la cromatina:
- Heterocromatina: muy condensada formando los cromosomas. La condensación está

asociada a inactividad génica.
- Eucromatina: muy poco condensada que es la forma “activa”.
TAMAÑO DEL DNA HUMANO
3,2x 10^9pb ó 990 mm= 0,99m=1m (en formato haploide y 2 m (diploide).
Si suponemos aproximadamente 10^13 células en el organismo será aproximadamente

2mx10^13 cel=2x10^13m=2x10^10km=200x10^8km
Si la distancia entre el sol y la tierra es de 1,5x10^8km. 200/1,5=133 veces se podría ir al sol, o

la mitad de ida y vuelta.
Por tanto es un DNA muy grande que además de estar superenrollado tiene que compactarse
con las proteínas histónicas formando estructuras de orden superior que veremos a continuación.
11
TIPOS Y PROPIEDADES DE LAS HISTONAS
Las histonas son de las proteínas eucariotas más conservadas de la célula lo que indica su papel
fundamental en el control de la estructura de la cromatina.
Hay 5 tipos de histonas. Son proteínas pequeñas (entre 11-15 de peso molecular salvo la H1 que
es casi el doble) con distinto número de residuos de aa. La composición de las mismas es
importante porque tienen un contenido de aa básico altos: la lisina y arginina.
Los tamaños de las histonas varían de una especie a otra. Realmente el tamaño de las histonas
varía muy poco.
BIOSÍNTESIS DE LAS HISTONAS
Las proteínas histonas son sintetizadas en gran cantidad a partir de los múltiples genes que las
codifican como “genes de copias repetidas no en tandem”, que comentaremos en el tema 4.
En la replicación del DNA veremos que tanto las histonas viejas como las nuevas son repartidas
al azar entre las dos hebras del DNA, pero con muchas sutilezas….
ORGANIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LAS HISTONAS
Se forman dímeros por “apretón de manos”. La histona se retuerce con formato de hélice y con
esa conformación (conocido como formato alfa) permite que se formen dímeros entre H2A y
H2B, luego también H3 con H4.
La cola N-terminal es donde se acumulan los aa básicos. Estas colas al formar el nucleosoma
sobresalen y esas colas son las que contrarrestan la negatividad del esqueleto del DNA.
12
ESTRUCTURAS DE COMPACTACIÓN SUPERIORES
Un nucleosoma estaría formado por H2A, H2B, H3 y H4 formando

el octamero de histonas. El DNA que rodea a este octámero da 1
vuelta y tres cuartos que más o menos son 147pb aunque cambia de
especie y lo hace como hélice toroidal levógira (-).
Sobre esta unión se sitúa la H1 que es una histona de unión, las otras
se conocen como de nucleación.
La H1 es de unión no de nucleación y se une al DNA tras las vueltas

ayudando a empaquetar.
Así se forma el collar de nucleosomas. Hay un nucleosoma cada

200pb.
En el laboratorio, se puede hacer una disociación de los elementos de los

nucleosomas. Se actúa con una nucleasa DNAasa que digiere el DNA
espaciador y nos quedamos con las partículas de núcleo nucleosómico que se
disocia a elevada concentración de sal y se forma el núcleo histónico y la
doble hélice de DNA de 147 pares de bases. Luego se disocia las histonas y
obtenemos todas menos la H1.
ENSAMBLAJE DE UN NUCLEOSOMA
La H4 y la H3 que forman dos dímeros que en una primera fase dan lugar a un
tetrámero y es rodeado inicialmente por el DNA dejando libres a las colas de
las histonas y es después cuando la H2A y H2B formando 2 dímeros que
formarán un tetrámero y se introduce en el centro del nucleosoma y formando
el nucleosoma.
13
IMPORTANCIA DE LAS LISINAS DE LAS COLAS DE LAS HISTONAS Y SUS

CARGAS POSITIVAS
Con estas cargas positivas las histonas se unen a los grupos fosfato negativos del DNA
contrarrestando su negatividad.
Pero a menudo las histonas resultan modificadas por metilaciones, acetilaciones, fosforilaciones
etc.
Así, en los temas 29-30 hablaremos de la acetilación de las lisinas de las histonas por la acción
de las enzimas acetilasas.
Pero adelantaremos, que estas enzimas acetilasas catalizan la transferencia de grupos acetilo
desde el acetil-CoA al NH3- terminal de los residuos de lisina. La adición de este grupo acetilo
genera un grupo amida sin carga. Este cambia sobre las lisinas, reduce drásticamente la afinidad
de todo el complejo de histonas hacia el DNA, facilitando su disoación.
EL DNA DE UN NUCLEOSOMA ES MUY DINÁMICO
El nucleosomas envuelto existe durante unos 250 milisegundos, el nucleosoma desenvuelto

existe durante 10-50milisegundos, el nucleosoma vuelto a envolver.
También participan en el envolver y desenvolver, otras proteínas que son las remodeladores de
la cromatina que son proteínas de unión a DNA específica secundaria, al nucleosoma que
también afectación a la expresión de los genes.
Deslizamiento del nucleosoma catalizado por los complejos remodeladores de la cromatina: el

complejo remodelador de cromatina es dependiente de ATP que con el gasto de ATP cataliza el
deslizamiento del nucleosoma. El ATP determina que el complejo remodelador envuelva al
nucleosoma.
ESTRUCTURAS DE COMPACTACIÓN SUPERIORES
La fibra de 30nm es el solenoide. Los nucleosomas se agrupan en grupos de 4 y forman una

estructura de zigzag que forman una fibra de ese grosor. En esto participan las colas de las
histonas (eso parece). Las colas de las histonas también podrían participar en la formación del
solenoide. Por esas colas es como se enganchan para formar la estructura de zig-zag. Mediante
sus grupos positivos se unirán las colas a otras colas o cabezas dando lugar a la estructura en
zigzag.
La última estructura superior es el cromosoma. El solenoide se compacta para dar lugar al

cromosoma.
14
CARIOTIPO
La constitución cromosómica del ser humano: 23 pares. 22+1 sexual.
En el cromosoma, tenemos el brazo corto o p y el largo o q. Se suele dividir en

secciones y cada sección tiene subsecciones. El centrómero es el punto medio de unión
de las dos cromátidas hermanas.
15
TEMA 4: CARACTERISTERÍSTICAS
GENERALES DE LA ORGANIZACIÓN
FUNCIONAL DEL ADN NUCLEAR Y
MITOCONDRIAL
GENOTIPO Y FENOTIPO
El genotipo es la constitución genética de un organismo concreto.
El fenotipo es el aspecto externo y otras características mediables de un organismo que son

consecuencia de la interacción entre genotipo y el entorno.
ORGANIZACIÓN FUNCIONAL DEL DNA. COMPARACIÓN EUCARIOTAS-

PROCARIOTAS
En los eucariotas, la continuidad y capacidad codificadora: la mayoría de los genes eucariotas

son discontinuos con numerosos intrones y exones. Los intrones se replican y después se
eliminan en el proceso de “splicing” tras la transcripción primaria. Solo los exones llegan a
traducirse.
Agrupación y expresión genética. No existe la agrupación de los genes en operones. Tras la

transcripción de un gen, el mRNA resultante es monocistrónico es decir lleva exclusivamente el
mensaje de ese gen.
Otros contenidos de DNA. Los eucariotas siempre contienen mitocondrias, que poseen mtDNA,
distinto del genómico.
En los procariotas, la continuidad y capacidad codificadora: los genes procariotas son

compactos y continuos, no poseen intrones entre ellos: Prácticamente todo el DNA son genes
con capacidad codificadora.
Agrupación y expresión génica: los genes se agrupan en un alto porcentaje en operones

(conjunto de genes relacionados metabólicamente). Cuando se transcribe un operón a mRNA, el
mensaje es polistrónico es decir de todos esos genes que están relacionados.
Otros contenidos de DNA: los procariotas muy a menudo contienen plásmidos, que son
pequeños DNA, distintos del DNA genómico.
En las bacterias, hay una serie de enzimas que se encargan de llevar a cabo de utilización de la
lactosa y en el genoma están los genes agrupados y regulados de forma metabólica. Las enzimas
del ciclo de Krebs están difusas y confusas entre los genes de nuestro organismo, sin embargo
en las bacterias esas enzimas próximas se encuentran agrupadas en los genes. Concepto de
operón.
En los eucariotas, el mRNA sólo sirve la producción de un tipo de proteínas, mientras que en las
bacterias es polistrónico y da lugar tras la transcripción para la producción de distintos tipos de
proteínas.
16
El ADN mitocondrial lo heredamos completamente de la madre.
Los intrones están solo en los genes eucariotas. En cuanto vemos intrones sabemos que es
eucariota. Los exones se nombran con número.
ORGANIZACIÓN FUNCIONAL DEL DNA GENÓMICO EUCARIOTA:
El DNA nuclear o genómico eucariota: 3,2 x 10^9pb, va a estar constituido por tres tipos de
elementos principales:
- Genes: 30%. Los genes que codifican para proteínas son como el 1,5%.
- Secuencias repetitivas: 45%.
- Otros elementos o zonas: 25%.
LOS GENES (30%)
Tipos de genes:
- Genes de copia única o estructurales: suelen estar separados y cada uno codifica a un
mRNA que codifica a una proteína y suelen estar separados. Proporción 1,5%.
- Genes de muchas copias repetidas: suelen estar agrupados
o En tanden y se activan a la vez. Ej: los que codifican a los rRNAs.
o No en tanden sino con espaciadores. Ej: los que codifican a los tRNAs y a las
histonas. Estos últimos no poseen intrones. Proporción: 28%.
- Pseudogenes: carecen de intrones y se repiten moderadamente en el genoma, sin
función conocida. Proporción: 0,5%.
LOS PSEUDOGENES
Tenemos unos 20000 genes. Poseen una secuencia de nucleótidos muy parecida a la del gen
funcional pero que contiene muchas mutaciones que evitan su expresión adecuada.
La mayoría de los pseudogenes ha surgido de la duplicación de un gen funcional que

posteriormente ha acumulado mutaciones nocivas en una copia  pasa a ser no funcional.
LAS SECUENCIAS REPETITIVAS (45% DEL DNA EUCARIOTA)
El significado de estas secuencias repetitivas no codificantes no se conoce bien, vamos a ver

cuatro tipos:
1. Repeticiones en tanden (VNTRs) (DNA satélite) son múltiples copias dispuestas unas
a continuación de otras. La longitud varía desde 2 hasta 2000pb. Hay minisatélites de
25pb y microsatélites de 2-5pb. Son específicas de cada individuo y por ello se utilizan
como marcadores en investigaciones forenses o de enfermedades genéticas.
2. Repeticiones entremezcladas ampliamente (SINEs y LINEs) están dispersas por el
genoma. Muchas resultan de “transposición”: primero se duplican, a veces se
transcriben y después se mueven en el genoma como “transposones” (de origen viral y
móviles). Ej: secuencia Alu, 280pb, con 500000 copias.
3. Repeticiones en el centrómero: este elemento está en el centro del cromosoma e
interacciona con las fibras del huso durante la división celular. En el centrómero hay
una secuencia central de DNA muy repetida y rica en AT y asociada con proteínas no-
histónicas para formar el cinetocoro.
17
4. Repeticiones en los telómeros: estas son regiones del ADN de los extremos de los
cromosomas que poseen una secuencia repetitiva no codificadora que retrasa la pérdida
de secuencias codificadoras durante la replicación del DNA. En humanos es la
secuencia: 5`TTAGGG3`y se repite unas 2000 veces, veremos su importancia en el
tema 6 de replicación telomérica. La enzima que la replica se llama telomerasa y su
alteración puede producir cáncer.
OTROS ELEMENTOS O ZONAS (25%)
Está constituido por otras zonas también muy importantes como:
- Zona promotora o promotor: está situado delante de cada gen. Hay genes que tienen
más de un promotor.
- Zonas finales de los genes: son zonas que se transcriben pero no se traducen: 5ÙTR y
3ÙTR.
- Zonas de inicio de replicación: son zonas de reconocimiento para que se lleve a cabo
este proceso pero estas zonas no llegan a replicarse.
- Otras…
Un gen tiene exones, intrones entre medias, con la secuencia promotora o secuencia de DNA
reguladora. Los exones son los que por expresión darán lugar a las proteínas.
El gen más grande nuestro es como la cantidad de genes de un procariota. Pero el tamaño medio
de un gen es de 27000pb. El mínimo de exones es 1, pero el número máximo es de 178.
ESTUDIOS DE SINTÉNIA
Es el estudio de la conservación de los genes entre especies. Por

ejemplo entre el humano y el de ratón.
Se cree que ambos venimos de un ancestro común de hace 80 x10^6

años.
El genoma humano consta de 23 pares de cromosomas. El genoma de

ratón20 pares de cromosomas.
Cada cromosoma humano contiene regiones conservadas o de

“sinténia” con un determinado cromosoma del ratón.
Por ejemplo una parte del cromosoma humano 9 se relaciona con una
parte del cromosoma 2 del ratón etc.
En conjunto la concordancia génica entre el hombre y ratón es mayor

del 85%.
LAS MITOCONDRIAS
Las mitocondrias son orgánulos semi-autónomos con maquinaria genética propia que sintetiza:
su mtDNA, sus RNAs (2 rRNA 16 y 23 S de tamaño, 22tRNA) y algunas proteínas propias.
Tienen un aspecto oval de unos 2 micras de longitud y 0,5 micras de diámetro y doble
membrana.
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La membrana externa contiene poros que pueden dejar pasar grandes moléculas.
La membrana interna (crestas) es prácticamente impermeable, en ella tiene lugar:
- La producción de ATP (fosforilación oxidativa).

- La respiración celular (transporte electrónico)
En la matriz mitocondrial: ciclo de oxidación de los azúcares y la oxidación de los ácidos
grasos.
El DNA genómico del núcleo puede traducirse a RNA. El núcleo envía su RNA al citoplasma
para el síntesis de proteínas, mientras que la mitocondria con su DNA da lugar a RNA y es
capaz la propia mitocondria de sintetizar unas 13 proteínas sin necesidad de que salgan los
ARNs al citoplasma. El resto de las proteínas que necesita las importa del citoplasma.
Cada mitocondria se reproduce por fisión binaria durante la división de la célula que la contiene.
Antes, su mtDNA se replica y las moléculas de mtDNA filiales se separan en dos mitocondrias
que se transfieren aleatoriamente a las células hijas.
El origen del mtDNA es desconocido podrían ser vestigios del DNA de bacterias ancestrales
que invadieron el citoplasma de la células y se convirtieron…
De hecho las mitocondrias son susceptibles a ciertos antibióticos como el cloranfenicol y la

eritromicina, al igual que ciertas bacterias.
EL mtDNA humano
El mtDNA humano es de doble hebra circular de 16560pb y 37 genes. De estos genes, 28 están
localizados en la denominada cadena pesada H, y los otros 9, en la denominada cadena L.
La hebra H del mtDNA es rica en guaninas y la hebra L es rica en citosinas.
De los 37 genes:
- Hay 2 genes que codifican 2 rRNAs de 23S y 16S y están situados exclusivamente en la
cadena H.
- Otros 22 genes codifican 22tRNAs y están repartidos entre las dos hebras.
- Los restantes 13 genes, codifican 13 mRNAs que van a producir proteínas de la cadena
respiratoria y también están repartidas en ambas cadenas.
- Además, los genes mitocondriales no poseen intrones. Están muy empaquetados y con
cierta superposición.
19
TEMA 5: REPLICACIÓN DEL DNA

LA REPLICACIÓN ES SEMICONSERVATIVA EN TODOS
LOS ORGANISMOS
Cada hebra de DNA se separa y se duplica. El DNA hijo se compone de

una hebra antigua y una hebra moderna.
Meselson and Stahl lo demostraron en 1958 en E. Coli, usando DNA

paterno cuyos nucleótidos estaban marcados con N15 (pesado).
Seguidamente, el DNA de la primera y segunda generación fue
sintetizado usando nucleótidos de DNA marcados con N14 (ligero).
La centrifugación en gradiente de densidad demostró en la primera

generación solo el tipo: N14-N15 DNA (intermedio). Mientras que en la
segunda generación…
REPLICACIÓN DEL DNA
Los estudios se dispararon a finales de los años 50. Se quiere explicar el fenómeno
semiconservativo.
Hay una hebra que se replica que se la llama hebra patrón que es la que se replica de forma
complementaria y la hebra nueva es la cadena cebadora o hebra replicada. Es una hebra a partir
de la cual se va cebando con nucleótidos y creándose.
Las dos hebras se separan y se replican por separado en sentido 5à 3`. En organismos inferiores
a veces se replica una y luego la otra. En los tres procesos, siempre van a tomar esta dirección
de 5` a 3`. De forma universal, los nucleótidos que entran son desoxinucleósidos trifosfatos. La
cadena cebadora se va elongando o cebando por la entrada de nucleósido trifosfatos. Se forma el
enlace entre el 3`con el 5`para formar el enlace nucleotidido y sale pirofosfato.
La complementariedad de bases se cumple.
Las dos hebras se tiene que abrir a la par: es lo que se llama horquilla de replicación. Al abrirse
las dos hebras, la dirección de replicación es siempre 5à 3`. En una hebra que es la hebra
conductora la replicación es fácil de entender y es continua, pero en la otra se detectó que la otra
hebra se sintetiza de forma discontinua por fragmentos de Okazaki. Se vio que para los
procariotas esos fragmentos son de 1000-2000 nucleótidos para los procariotas mientras que
para los eucariotas son de 100-200 nucleótidos.
Aparte de haber DNA replicado había RNA que tiene un cometido. Ese RNA está en la hebra
conductora delante que solo tiene uno, pero en la hebra
retardada que es la que se sistema de forma discontinua,
tenemos los RNA delante de cada fragmento en el extremo
5`, es decir, tiene tantos ARN como fragmentos de
Okazaki haya.
20
ENZIMAS DE LA REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS
DNA polimerasas: hay al menos 12 tipos. Los más conocidos son 5: alfa, beta, delta, épsilon y
gamma.
La alfa inicia la síntesis de ambas hebras y también su elongación. Es decir, por poseer su
propia actividad primasas crea cebadores de RNA (uno o muchos según la hebra) y por su
actividad polimerizadora sintetiza fragmentos cortos de DNA. No tiene actividad exonucleasa
3à 5`.
Las tareas de la alfa se ceden luego a las delta y épsilon. La delta es responsable del resto de la
elongación y la épsilon de la eliminación de cebadores y reparación.
Ambas sí tienen actividad exonucleasa 3à 5`. Pueden reparar errores.
La beta participa solo en la reparación del DNA, no tiene actividad

exonucleasa 3à 5`.
La gamma (exclusiva de la replicación) replica el DNA mitocondrial,

tiene actividad polimerasa y también exonucleasa 3à 5`.
Una vez unido el nucleósido trifosfato, se produce la liberación de un

pirofosfato y el crecimiento de la cadena en sentido 5à 3`.
Las polimerasas o polimerizadoras abarcan al DNA que se replica.

Tiene capacidad polimerizadora pero también capacidad correctora (la
exonucleasa).
CAPACIDAD CORRECTORAS 3À 5`
La polimerasa incluye un nucleótido de forma errónea en la

replicación. El extremo 3`-OH no apareado de la cadena cebadora
bloquea su posterior alargamiento por acción de la DNA polimerasa.
La actividad de la exonucleasa correctora 3à 5ùnida a la DNA

polimerasa genera un extremo 3`-OH con bases apareadas en la
cadena cebadora.
La DNA polimerasa continua el proceso de adición de nucleótidos al

extremo 3`-OH de la cadena cebadora.
La replicación es en sentido 5à 3`mientras que la corrección se

produce de forma 3à 5`.
(La capacidad correctora es la exonucleasa; la capacidad de

elongación son las polimerizadoras).
OTRAS ENZIMAS
Las Mcm y la DNA ligasa funcionan básicamente como en procariotas. Las SSB y las ídem.
Las Mcm son helicasas que actúan en la separación de las dos hebras del DNA y la DNA ligasa
catalizando la formación de enlaces fosfodiéster 3`-5èn la hebra que se replica en fragmentos y
requiere un grupo hidroxilo libre en el extremo 3`de un fragmento y un grupo fosfato en el
21
extremo 5´del siguiente fragmento. También participan las polimerasas I y II ya comentadas en

el tema 2.
Las SSB (single strand binding) y la DNA ligasa funcionan básicamente como en proc.
Las SSB son helicasas que actuan en la separación de las dos hebras del DNA y la DNA ligasa
catalizando la formación de enlaces fosfodiéster 3’-5’en la hebra que se replica en fragmentos y
requiere un grupo hidroxilo libre en el extremo 3’de un fragmento y un grupo fosfato en el
extremo 5’del siguiente fragmento. También participan las polimerasas I y II ya comentadas en
el tema 2.
CICLO CELULAR
La replicación a nivel celular. La replicación se produce en la fase S del ciclo celular. Toda
célula tiene en su ciclo celular: G1, S, G2 y M. Entre M y S están las fases G1 y G2 que son de
reposo activo. En la fase de replicación S, la célula tiene un mensaje para dividirse (de
replicación), tiene que estar en la fase G1 previamente (se prepara) o en una fase G0 (de
latencia) que son células que no se dividen.
Si llega la orden de replicación, entran en la fase S.
ORÍGENES DE LA REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS
En los múltiples orígenes de replicación en eucariotas (ORCs) es necesaria la asociación de

determinadas proteínas o factores de replicación antes de que comience la síntesis de DNA. Los
organismos procariotas solo tienen un ORCs.
1. En G1 se forma primero el complejo pre-replicativo, en un proceso que requiere Cdt1 y

Cdc6 y la asociación de las proteínas Mcm 2-7 a ese ORC.
2. Las proteínas Mcm2-7 proporcionan actividad helicasa.
3. El comienzo de la síntesis de DNA (fase S) requiere la acción de 2 proteínas quinasas
(CdK y Cdc 7), que permiten la asociación de otras proteínas en el origen, como Cdc45
y GINS.
4. Después se agregan en este orden las DNA polimerasas alfa, delta y épsilon y comienza
la síntesis.
5. Durante la replicación, las proteínas Mcm 2-7 se alejan del origen impidiendo la
formación de nuevos complejos pre-replicativos. Esto asegura que la síntesis ocurra una
sola vez por cada ciclo celular.
22
ORC Y COMPLEJO PREREPLICATIVO EN EUCARIOTAS
Cuando empieza la replicación en un ORC le llegan las Cdc 6 y Cdt1 que

reconocen unas secuencias en el DNA no demasiado específicas, pero que si
que presentan dímero AT. Las proteínas helicasas también unen y se forma el
complejo prereplicativo. Se necesitan proteínas externas que son las proteínas
trans que reconocen secuencias y que con enzimas helicasas juntas favorecen
la separación de las dos hebras.
Para entrar en el proceso prereplicativo, tiene que introducirse las enzimas

Cdks. Produce la fosforilación de Cdc6 y ORC y separación de Cdc6 y Cdt1.
Cdc6 fosforilada se degrada.
Cuando tenemos las dos hebras separados, Mcm se separan para que no haya
proceso duplicado de replicación. Se produce la replicación del DNA.
Es decir, existe en la fase G1 una fase prereplicativa que necesitan de muchas

enzimas como las ciclinas que nos controlan el proceso.
RECOPILACIÓN REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS
1. Es semiconservativa al igual que en procariotas.

2. Número de replicones: son múltiples (30000 en humanos), que hacen que la replicación
se haga en pocas horas. Hay definidas secuencias vagamente ricas en AT en esos
lugares donde se ensamblan los complejos de origen de replicación (ORC). También
hay varias proteínas homólogas alas DnaA procariota como las Cdc y las helicasas
Mcm que forman parte del complejo prereplicativo.
3. Fragmentos de Okazaki: son aproximadamente 10 veces más cortos: 100-200
nucleótidos de largo.
4. Velocidad de replicación es aproximadamente 10 veces más lenta que en procariotas: 50
nucleótidos /s por horquilla de replicación.
5. Tiene lugar solo una vez por ciclo celular antes de cada división celular, exactamente en
la fase S.
PAPEL DE LOS NUCLEOSOMAS EN LA REPLICACIÓN EUCARIOTA
El DNA eucariota está empaquetado formando nucleosomas como primera estructura de

compactación celular. Los nucleosomas están distribuidos a lo largo del DNA a intervalos de
Okazaki de 200 pb pero no 2.000 como en procariotas. Estos nucleosomas también frenan el
desplazamiento de las moléculas de DNA polimerasa, lo que explicaría que la velocidad de
polimerización en eucariotas es una décima parte de la velocidad procariota.
23
El aparato de replicación parece tener una capacidad intrínseca poco conocida de pasar a través
de los nucleosomas sin desplazarlos del DNA. De hecho, estamos empezando a aprender cómo
se duplica un nucleosoma.
HAY DISTRIBUCIÓN DE LAS HISTONAS PATERNAS DETRÁS DE LA

HORQUILLA DE REPLICACIÓN EUCARIOTA
El octámero de histonas del nucleosoma se reparte entre las dos hebras del DNA en la
replicación. Cuando la horquilla de replicación atraviesa un nucleosoma el octámero de histonas
se rompe en un tetrámero H3-H4 y dos dímeros H2A-H2B.
Algunos tetrámeros H3-H4 permanecen asociados al DNA viejo al azar mientras que todos los
dímeros H2A-H2B se liberan del DNA viejo a medida que la horquilla de replicación avanza.
ORDENAMIENTO Y RÁPIDA ADICIÓN DE NUEVOS TETRÁMEROS H3-H4

Y DÍMEROS H2A-H2B DETRÁS DE LA HORQUILLA DE REPLICACIÓN
Se forman H3-H4 nuevos que se unen al DNA replicado nuevo llenando los “espacios” libres.
En cuanto a los dímeros H2A-H2B la mitad van a ser nuevos pero la otra mitad son viejos.
Ambos tipos de dímeros se añaden al azar completando los nucleosomas.
Para ello, son necesarias las chaperonas de histonas o “factores ensambladores de

cromatina”. Estas chaperonas son complejos proteicos de múltiples subunidades que unen las
24
histonas y también las liberan, ensamblándolas solo en contexto apropiado. Ej, NAP1 que
transporta y carga dímeros (H2A-H2B) y CAF1 que carga tetrámeros (H3-H4 recién
sintetizado)
Estas chaperonas de histonas con la carga histónica (+) que transportan, son dirigidas hacia el
DNA recién replicado mediante interacción específica con la denominada “abrazadera
deslizante eucariota PCNA”. Estas abrazaderas se liberan detrás de la horquilla de replicación
y permanecen en el DNA el tiempo suficiente para que las chaperonas finalicen su función.
El trabajo de carga y descarga es continuo en nuestro organismo y sobretodo en las células que
se están dividiendo, se lleva a cabo por las chaperonas de histonas.
25
TEMA 6: REPLICACIÓN Y
MANTENIMIENTO DE LOS
TELÓMEROS
Los telómeros (telos: final; meros: parte) son los extremos de los cromosomas eucariotas. Son
regiones de ADN no codificante cuya función principal es la estabilidad estructural de los
cromosomas en las células eucariotas, protegiéndolos del ataque de nucleasas y evitando las
fusiones entre ellos.
Están formados por una secuencia repetitiva de DNA (en humanos es 5’ TTAGGG 3’ que se
repite unas 2.000 veces) y proteínas especializadas. El extremo 3’ de telómero no tiene cadena
complementaria y se denomina saliente 3’.
Secuencia
repetida del
telómero
Saliente 3’
¿Por qué no se puede hacer una cadena complementaria 5’ – 3’ a ese saliente 3’? pues, porque
antes allí ha habido un cebador de RNA creado por la DNA polimerasa alfa para inicio de
replicación 5’ - 3’ y posteriormente eliminado por la DNA polimerasa épsilon.
La cadena hija tiene así un extremo 5’ más corto tras la replicación y por ellos los cromosomas
irían acortándose progresivamente a lo largo de la vida.
Cuando se vuelve a replicar necesita otro cebador que después es eliminado y así la hebra
replicada es más corta. Es uno de los hechos que denotan el envejecimiento de nuestras células.
Esto nos pasa de forma natural.
La telomerasa evita el acortamiento de los cromosomas
Es una ribonucleoproteína formada por:
 Una subunidad de RNA llamada TERC “Telomere RNA Component” que proporciona
un molde 3’ AAUCCC 5’ (en mamíferos) para emparejar a la secuencia 5’ TTAGGG 3’
presente en el telómero.
 Y otra subunidad que es una enzima llamada TERT “Telomere Reverse Transcriptase”
que proporciona la actividad enzimática
 Por tanto la telomerasa es una transcriptasa inversa especializada que lleva su propio
molde de RNA y es capaz de sintetizar DNA a partir de RNA
 La primeras transcriptasas inversas fueron descubiertas en retrovirus
26
Acción de la telomerasa:
1. La telomerasa se une a la repetición con su 3’ AAUCCC 5’(unidad repetida). Se

engancha en una zona de engancha, sobre el TTA que es el extremo del saliente 3’.
2. La telomerasa sintetiza secuencia complementaria completa de DNA de 6 nucleótidos.
Crea DNA complementario empezando en 5’ GGGTTA 3’
3. La telomerasa avanza hacia la derecha y comienza a sintetizar otra secuencia repetida
de DNA de 6 nucleótidos
4. Después la actividad primasa de la DNA polimerasa alfa, sintetiza un cebador de RNA
cerca del final del telómero y sintetiza una cadena complementaria que es sellada por
una ligasa (con un enlace fosfodiéster)
Hemos conseguido alargar (n veces) el extremo de la hebra 5’ – 3’, es decir, que actúa sobre el
saliente 3’ ha salido la telomerasa que hace unas 8 repeticiones.
IMPORTANCIA DE LA TELOMERASA
Los científicos Elizabeth H. Blackburn, Carol W. Greider y Jack W. Szostack fueron

galardonados con el premio nobel de fisiología y Medicina (2009) por sus descubrimientos
sobre los mecanismos de actuación de la enzima telomerasa en los telómeros de los
cromosomas.
La científica española María A. Blasco realizo su postdoctorado en el laboratorio de la profesora

Greider desarrollando un ratón transgénico sin RNA telomerasa (TERC) (1997). Y desde
entonces continua investigando los telómeros y su implicación en cáncer y envejecimiento en
nuestro país, actualmente es directora de CNIO.
La acción de la telomerasa añadiendo DNA nuevo en los telómeros es muy llamativa. Choca
con la idea de que un individuo nace y muere con la misma cantidad de DNA. Efectivamente no
es DNA codificante de genes, pero es DNA.
27
TELÓMEROS, ENVEJECIMIENTO Y CÁNCER
La telomerasa se encuentra activa en células germinales, en las somáticas que se dividen

rápidamente y en algunas células madre. Pero es inactiva en la mayoría de las células somáticas,
diferenciadas y postmitóticas.
Cuando es inactiva los telómeros se acortan después de cada división celular hasta el momento
en que la célula deja de dividirse y muere. Es un hecho de envejecimiento.
Además se ha visto que la telomerasa está activa en el 90% de todos los tipos de cáncer,
contribuyendo así a la “inmortalidad” de esas células cancerosas. Mientras que la no actividad
telomerasa funciona como un mecanismo antitumoral en ratones.
En ciertas patologías como la PROGERIA (enfermedad caracterizada por envejecimiento rápido

y prematuro y muerte en la niñez). Los fibroblastos de estos pacientes presentan telómeros
cortos, y estos fibroblastos en cultivo tienen menor capacidad de proliferación.
INHIBIDORES DE LA REPLICACIÓN
Hay dos grupos principales de agentes inhibidores de la replicación que se usan como agentes
antitumorales:
- Los inhibidores de las topoisomerasas I y II
De estos ya hemos hablado en el tema 2, estos agentes inhiben la actividad topoisomerasa que
está incrementada en procesos tumorales uniéndose a estas enzimas de forma irreversible, así
impidiendo la eliminación de los sobrecruzamientos del DNA, su desenrolle, y por tanto su
replicación.
- Los inhibidores de la telomerasa:
Estos agentes disminuyen la actividad telomerasa que también está incrementada en procesos
tumorales.
Los dos grupos de inhibidores favorecen por tanto la muerte celular.
El más estudiado es un lípido con una secuencia parecida a la que se repite en los telómeros y
puede competir con la secuencia de los telómeros. Están estudiando si son capaces de inhibir la
acción de la telomerasa eliminando esos elementos. Los otros son ciclos más o menos grandes
que son como una especie de vacunas contra la telomerasa. Está en fases experimentales y no se
utilizan en humanos.
REPLICACIÓN DEL DNA MITOCONDRIAL
Se lleva a cabo por la DNA polimerasa gamma que es la específicamente mitocondrial. Tiene
actividad polimerasa y también exonucleasa correctora 3à 5`.
En la mayor parte de las células, la replicación del mtDNA no tiene lugar exclusivamente en la
fase S celular como en el DNA nuclear, sino que ocurre a lo largo de todo el ciclo celular.
No obstante, el número total de moléculas de DNA del orgánulo se debe multiplicar en cada
ciclo celular para mantener constante el DNA del orgánulo.
28
Hay dos orígenes de replicación uno para cada cadena O H y OL (Origen de la cadena pesada y
origen de la cadena ligera respectivamente).
El proceso de replicación completo tarda horas.
En el DNA mitocondrial, la replicación de la O H y OL. El OH va por fuera replicándose y

copiando toda la cadena H, mientras que el O L está en el interior va por dentro copiando otra
segunda cadena del DNAmt. PH es el origen de transcripción de la cadena H (por fuera) y P L es
el origen se la cadena L (por dentro)(ver dibujo tema 4).
29
TEMA 7: METODOLOGÍA EN
GENÉTICA MOLECULAR (I)
¿QUÉ ES UN VECTOR?
Es un nombre genérico para determinados DNA de tamaño variable capaces de ser insertados
con un fragmento de otro DNA foráneo o exógeno “inserto”. Los fines pueden ser múltiples,
entre ellos la “clonación” de ese inserto.
Una clasificación por el tamaño del inserto que pueden acoger:
- Inserto pequeño (10-48Kb): plásmidos, bacteriófagos y cósmidos.

- Inserto grande (300Kb-1Mb): cromosomas artificiales de bacterias y levaduras.
Un vector no puede replicarse por sí mismo, necesita introducirse en determinada célula

“hospedadora” como puede ser una bacteria o una levadura.
El ADN vector presenta una zona sensible a la enzima de restricción donde se incorpora el
inserto del DNA exógeno. Puede tener varios insertos.
PLÁSMIDOS
Son pequeños DNA de doble cadena que inicialmente se encontraron

en bacterias y después se sintetizaron artificialmente en el
laboratorio.
Presentan zonas sensibles a enzimas de restricción, que pueden

formar parte o no, de las denominadas zonas de resistencia a ciertos
antibióticos.
Los plásmidos son los vectores más comunes para clonar. Pueden
integrar DNA exógeno de tamaños entre 1-2Kb, con un límite de
10Kb.
Se replican dentro de la célula “hospedadora” utilizando su

maquinaria genética.
Polinker que es una zona muy sensible. Zona de ADN que tiene una secuencia que coincide con
la sensibilidad a distintas enzimas de restricción (puede afectarse por varias)
El plásmido más sencillo tiene un DNA de doble hebra, con un origen de replicación teórico y
tiene una zona de resistencia a la tetraciclina, una zona de resistencia a la ampicilina que es una
plásmido de resistencia a dos antibióticos. Las S o serpientes son el corte de tres enzimas de
restricción diferentes que se llaman EcoRI, SALI y PSTI
La zona es sensible a varias enzimas que es un Polinker. Hay zonas sensibles a distintas enzimas
de restricción y abajo está la secuencia completa del polinker.
En un fragmento corto del ADN es sensible a EcoRI, ……
30
En el primer plásmido, es sensible a tres enzimas de restricción, pero no tiene polinker, si

cortamos a PstI nos cargamos la resistencia al antibiótico.
Si la zona de restricción está en la zona de resistencia al antibiótico, al cortar la secuencia se

pierde la zona de resistencia.
BACTERIÓFAGOS O FAGOS
Son virus de bacterias.
Recordemos que los virus son elementos genéticos encerrados en cubiertas proteicas. Se pueden
desplazar de una célula a otra, pero no son capaces de crecer de forma independiente ya que no
tienen maquinaria para la biosíntesis proteica y tienen que utilizar el de la célula que les
hospeda. Hay virus de DNA y virus de RNA.
Hay varios bacteriófagos muy utilizados como vectores, por ejemplo: el fago lambda y el fago
M13:
- El fago lambda: presenta una cabeza que contiene el DNA, porque este ADN finaliza en
sitios “cos” que son reconocidos por el sistema de empaquetamiento de la cabeza, el
cual procede a seccionarlos y a insertar el DNA. Este fago presenta también una cola
que le permitirá unirse a la célula hospedadora bacteriana.
Ambos fagos pueden integrar fragmentos de hasta 20kb.
El fago lambda es un fago de DNA de doble hebra de 48Kb que contiene varias docenas de
genes, la parte central no es indispensable para la multiplicación y puede ser reemplazada por un
DNA foráneo.
- Puede multiplicarse dentro de un hospedador lisándolo (vía lítica): el DNA con el

inserto se reproduce dentro de la célula hospedadora y da a multitud de fagos lambda y
tenemos muchas repeticiones (clones).
- Puede integrar su DNA en el genoma del hospedador (vía liso génica) permaneciendo
así latente hasta que se activa. Cuando se integra en el DNA de la célula hospedadora y
se queda retenido en el formato de profago.
31
CÓSMIDOS
Los cósmidos son vectores artificiales híbridos entre plásmidos y fago lambda.
Un cósmido utiliza el mecanismo de empaquetamiento del DNA del fago lambda mediante la
incorporación de sitios “cos”. Estos sitios sirven para que el cósmido pueda ser empaquetado en
la cabeza del fago lambda.
Por tanto, un cosmido puede entrar por ejemplo en E. coli como un fago lambda y después
multiplicarse como un plásmido.
Los cosmidos presentan genes de resistencia a antibióticos como los de los plásmidos sitios de
restricción en los que se puede incorporar un DNA foráneo de hasta 48Kb. Se usan porque se
pueden insertar insertos más grandes.
VECTORES YAC Y BAC
El cromosoma artificial de levadura (YAC) y el cromosoma artificial de bacterias (BAC), son

vectores que se usan sobretodo en la clonación de grandes fragmentos de DNA.
Los YAC poseen un origen de replicación, un centrómero que garantiza la segregación y

telomeros que confieren estabilidad.
Como vectores de clonación los YAC poseen mayor capacidad de inserción (1Mb) que los
BAC.
Los BAC están basados en plásmidos y pueden insertar DNA de menor longitud 300Kb, pero
son más estables que los YAC.
Ambos han sido fundamentales en el desarrollo del Proyecto Genoma Humano.
YAC
Tiene un origen de replicación, un centrómero, y zonas teloméricas. Además tiene una 3 zona
sensible a enzima de restricción. Su primer paso sería cortar por aquí y se separar una primera
parte del YAC (brazo izquierdo) y nos quedaría un telomero, zona A, ori y cen, luego
tendríamos otra zona (brazo derecho) que contiene el gen B y otra zona telomérica. Entre estos
dos fragmentos (brazos) es donde se introduce una megabase para clonarlo.
BAC
Se parece al plásmido. Por tanto, tiene un origen de replicación y zonas sensibles antibióticos.
Zonas de plásmido F que les da estabilidad. Cuando se corta en una zona, incluye un gen que se
utiliza después en transducción, se abre y se introduce el adn inserto que queramos. Como es
más pequeño, pues es más estable, pero puede incluir tamaños mucho más pequeños que el
YAC.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las primeras enzimas de restricción se aislaron de bacterias, ya que estas las fabrican para
defenderse contra los virus de DNA que quieren parasitarlas.
32
Las bacterias mediante estas enzimas cortan determinados enlaces fosfodiéster en zonas
palindrómicas del DNA del virus. Además, para no cortar su propio ADN, lo metilan (sobre C y
A).
Es decir las enzimas de restricción reconocen secuencias cortas de DNA bicatenario como
dianas para la escisión. Cada enzima de restricción posee una diana particular, por lo general
entre 4-6pb.
El corte tiene lugar sobre determinado enlace fosfodiester en cada una de las cadenas.
Consiguiéndose extremos desiguales o iguales (romos) (se cortan enlaces uno frente al otro).
Un palíndromo: se lee lo mismo que del 5à 3`como del 3à 5`. Tiene un eje de simetría. La
EcoRI tiene una secuencia 5`GAATTC3`con 3`CTTAAGG5´. El corte es donde está la flecha
roja y es un corte desigual. Pero en la HaeIII tenemos un corte romo igual.
En ejemplo, la zona palindrómico es sensible a EcoRI, su corte es dando a extremos desiguales.

Después se juntan con la otra enzima que es la DNA ligasa que es importante en la replicación.
• Las primeras enzimas de restricción se aislaron de bacterias, ya que estas las fabrican
para defenderse contra virus de DNA que quieren parasitarlas.
• Las bacterias cortan mediante estas enzimas, determinados enlaces fosfodiester en

zonas palindrómicas del DNA del virus. Además, para no cortar su propio DNA, lo
metilan (sobre C y A).
• Hay 2 tipos principales de enzimas de restricción:
• Tipo I: pueden cortar determinado enlace fosfodiester de una zona palíndromica del
DNA si este no está metilado. Pero también pueden solo metilarlo. Es decir pueden
cortar y metilar.
• Tipo II: solo cortan determinado enlace fosfodiester de una zona palindrómica del DNA
si este no está metilado.
Los extremos iguales se agarran peor con la ADN ligasa (dificultan su acción), se ligan mejor
los extremos desiguales.
ADN LIGASA
Tras la acción de una enzima de restricción puede venir la acción de una DNA lígasa. O también
directamente para unir determinado fragmento a los extremos como por ejemplo en la
replicación.
La DNA ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster 3’-5’en cada una de las hebras de
un DNA y requiere un grupo hidroxilo libre en el extremo 3’ y un grupo fosfato en el extremo
5’.
Las enzimas de restricción y la DNA lígasa son

instrumentos esenciales para formar moléculas
recombinantes de DNA.
33
Como cortamos con EcoRI introducimos un oligo con la secuencia de sensibilidad a la EcoRI.
Ese oligo se introduce y después cortar a través de él por su sensibilidad. Se une con T4 ligasa,
la ligasa forma enlaces fosfodiéster. Tenemos que saber hacer el enlace fosfodiéster 5à 3`. El
otro paso es saber cortar, cortamos como si fueramos EcoRI, con extremos desiguales. Este
nuevo corte que no tenía antes sensibilidad a EcoRI, ahora sí y se puede introducir en un vector
con la sensibilidad EcoRI. La sensibilidad del oligo y el vector tienen que coincidir.
Se quiere introducir el oligo, tiene sensibilidad a EcoRI, pero también una zona palindrómica
sensible a la PvuII que corta igual. Se corta por la EcoRI, luego se corta con PuvII y se forma un
extremo romo. En el vector que queremos introducirlo tiene que haber esa misma característica
para poder introducirlo. Es decir, que el vector sea sensible a la EcoRI y la PuvII, así en
presencia de la ADN ligasa podamos introducir el oligo en el vector.
Teóricamente es mejor con lados desiguales porque se enganchan mejor.
Se quiere introducir un polilinker. Introducimos un polilinker para después cortar a través del
polilinker, secuencia de ADN sensible a diferentes enzimas de restricción. Utilizamos de vector,
si queremos introdroducir con EcoRI, el vector tiene que ser sensible a EcoRI, el vector se ha
cortado y se ha abierto y queda abierto para introducir el polilinker, cuyos extremos han de ser
sensibles tambiéna EcoRI. Después la ADN ligasa encaja los extremos. Entonces el polilinker
puede ser útil para cortarlo después con otras enzimas.
Tras el corte con enzimas de restricción, podemos hacer una electroforesis e introducir esa
muestra del tubo que se corta con enzimas diferentes en los tres tubos. Vamos a obtener
diferentes tamaños de corte.
En electroforesis, en el gel de agarosa se mueven más rápido cuanto más pequeños los
fragmentos. El tamaño lo determina la enzima de restricción de cada uno.
Podemos identificar la acción de las enzimas sobre el DNA y hacernos una idea de las
posibilidades de actuación de las enzimas de restricción. Se tiñe después con bromuro de etidio.
Se observa de color rosita cuando induce la luz ulatravioleta.
ESQUEMA DE CLONACIÓN
Clonación en un plásmido que es sensible a EcoRI. Partimos del vector que es un plásmido, del
DNA que nos interesa cortarlo con EcoRI y se forman unos fragmentos. El plásmido se corta
con la EcoRI y se nos abre por los extremos desiguales. Entonces el DNA la cortamos con la
misma enzima de restricción y obtenemos unos fragmentos.
Al azar, por la acción de la ADN ligasa el vector ha unido con sensibilidad a EcoRI un
fragmento del DNA. Ese vector con el fragmento de ADN se llama vector recombinante. Es la
tegnología del ADN recombinante.
Este vector recombinante se introduce en una célula hospedadora como E. coli. En laboratorio
se hace mediante dos métodos:
34
- Se la hace en una solución con Cl2Ca y se abren los poros y la célula hospedadora
puede captar el vector. Cruza la membrana plasmática por los poros y se introduce en la
célula. Se obtiene poca introducción.
- Se hace más la electroporación: se da una descarga eléctrica intensa pero corta en esas
condiciones se abren los poros y dejan pasar el vector. Casi siempre se utiliza la
electroporación con mayor eficacia.
La transfección es la utilización de este tipo de bacterias (utilización de plásmido). El siguiente

paso es cultivar la E. Coli en tanques si es industrial, pero en laboratorio en matraces. En la
transfección se puede introducir más de un inserto.
Al final, tenemos que se reproducen pero en presencia de un antibiótico solo crecen las bacterias
que lleven en el plásmido el gen de resistencia a ese antibiótico.
Rompemos las células que sean, queremos tener separa el ADN del plásmido del de la bacteria.
Pasar separar el plásmido, es mediante por centrifugación que es sencillo. El ADN del plásmido
es más pequeño que el de la bacteria, luego en el tubo de centrifugación el ADN del plásmido
queda arriba. Luego, podemos sacarlo con EcoRI y tenemos toneladas de plásmidos con el
inserto que nos interesa. Hemos podido clonar el gen determinado utilizando el vector.
35
GENÉTICA MOLECULAR (II)
Por ambos métodos MAXAM Y GILBERT y SANGER, obtienen el premio Nobel en 1980.
Sanger era su segundo premio Nobel por la secuenciación de la primera proteína que fue la
insulina.
MÉTODO DE SECUENCIAÓN DE MAXAM-GILBERT: MÉTODO QUÍMICO
Utiliza reactivos químicos. Consiste en que se parte de DNA bicatenario y el primer paso es un
ADN pequeño de doble cadena. El primer procedimiento es la separación de las dos hebras del
DNA, subiendo la temperatura del medio se puede separar el DNA que es la desnaturalización
del DNA que aguanta altas temperaturas (a partir de 70º ya se desnaturaliza). Nos quedamos
con la hebra 5` a 3`.Entonces se marca la cadena con P32 con una técnica en el extremo 5`. A
continuación, se utilizan 4 reactivos que rompen de forma específica los 4 nucleótidos del DNA.
Un reactivo elimina las G.
El DNA se divide en 4 tubos. En un tubo, las que elimina las G, otras que elimina las A, las T y
otro que eliminas las C. Tenemos cuatro tubos, hacemos una electroforesis en gel de agarosa y
36
en cada uno de los agujeritos introducimos la muestra de un tubo. Tienen radioactividad porque
está marcado el extremo 5`. Si ponemos el gel en contacto con una película fotográfica y
aparecen una serie de manchas. La primera mancha es igual en todas que es un control negativo
que no ha funciona el reactivo en cierto grado. Después, tenemos unas manchas distintas y las
leemos: sabemos el tamaño porque conocemos el tamaño del fragmento partida. Numeramos,
vamos leyendo y leemos de abajo a arriba es decir, de los más pequeños a los grandes. Leemos
de forma que la base que ha sido atacada por el reactivo tiene que ver con T o C y el primero se
desconoce, pero los siguientes podemos conocerlos según el tubo en el que se ha tratado.
Primero ataca G, segundo ataca mayor A y en parte G, tercero a T y en parte a C, el ultimo ataca
a C solo.
CONSIDERACIONES A TENER EN CUENTA EN LA LECTURA DE LA

SECUENCIA
Empezamos a leer nucleótidos desde el extremo 5`situado en el fondo.
El de 1 nucleótido lo desconocemos, pero si aparece como el primero, tiene que ser que el
segundo nucleótido se destruya con el reactivo de ese tubo.
El de 2 nucleótidos, tiene que ser que el tercer nucleótido se destruya con el reactiva de ese tubo
y así sucesivamente.
5`X-T-T-G-…..3`
MÉTODO DE SANGER
Se basa en la replicación de una cadena patrón 3` a 5`. El primer es RNA, también conocido
como cebador. Sobre el pequeño DNA que es el complementario de la que se replica se alagar
con nucleótidos trifosfato y se forman enlaces fosfodiester y se separa pirofosfato y la hebra se
elonga y se polimeriza. Si hablamos de eucariotas, las enzimas que hacen esto son la polimerasa
alfa. Realmente se hacen polimerasa procariotas que se utilizaba como un fragmento.
37
Este método nos va a poder ayudar en la determinación inicial de la hebra que se replica. Se
basa en la polimerasa creadora, en la hebra cebadora, y la inicial.
Se puede alargar siempre que entren nucleótidos trifosfato.
Sanger consiguió parar la replicación. Utilizó un nucleótido trifosfato que es el ddNTP que no
tenía OH sino un H solo de forma que al entrar este nucleótido, la hebra se encuentra que ya no
se puede seguir uniendo más trifosfatos nucleótidos. La cadena se paraliza.
Utilizamos una hebra 3à 5`que va a ser copiada con un primer o cebador y se señaliza en rojo el
cebador porque se compra marcado la posición 5`. Se utilizan los nucleótidos trifosfato para
crear DNA y se utiliza los didesoxi y se añade en diferentes tubos: ddATP, aaCTP, ddGTP,
ddTTP. Luego al llegar al nucleótido correspondiente, la cadena de replicación se para detrás
del nucleótido didesoxi.
Cargamos el gel y dejamos que corran las muestras y cargamos el tubo. Lo único que vemos es
que podemos cuantificarlos porque tenemos un control de tamaños y empezamos a ver desde el
5`. Lo que tenemos es que si encontramos un primer será el tubo que acaba en ddCTP y por
tanto será G, así sucesivamente. Esta hebra nueva es la hebra replicada y está escrita en
dirección de 5à 3`.
CON ESTE MÉTODO SE LEE INICIALMENTE LA HEBRA

REPLICADA
Si la hebra replicada es: 5’GATTCGAGCTGA 3’
La hebra original será la complementaria: 3’CTAAGCTCGACT 5’
Pero escrita en la dirección correcta 5à 3´: 5’TCAGCTCGAATC 3’
38
TEMA 9: CICLO CELULAR

El ciclo celular se compone de:
- G1: pre síntesis. Aunque es una fase en las

que las células no se repliquen y entonces se
llama G0. Tiene una duración variable de
horas hasta toda la vida de la célula.
- S: replicación del ADN. Cuando la célula
recibe los mandatos celulares está como unas
8 horas.
- G2: es una fase corta con unas 4-6 horas.
- Mitosis: fase más corta con 1-3 horas.
Mientras el número de cromosoma es el mismo, pero

el contenido de ADN del ciclo cambia. En la
replicación se duplica el contenido ADN, se
mantiene en la G2 y en la mitosis se vuelve en el original de 2C.
EL CICLO CELULAR EUCARIOTA
El ciclo celular eucariota es la transición entre dos divisiones o mitosis sucesivas.
El número de veces que una célula entra en este ciclo para dividirse es muy variable y depende
de múltiples factores, así, las células hamtopoyéticas o epiteliales tienen división casi continua;
las células hepáticas cada 30 días, las células del endotelio de vasos sanguíneo cada 3años,
etc…
Las células especializadas en la formación de gametos (células germinales) a diferencia del

resto (células somáticas), se dividen por otro mecanismos (meiosis) pero también precedido de
un ciclo celular.
VARIACIONES EN EL CONTENIDO EN DNA DE LA CORMATINA EN EL

CICLO CELULAR
Al progresar G1, la cromatina se descondensa gradualmente (heterocromatina eucromatina)

es decir: de cromosomasestructuras superioressolenoidenucleosomasa la forma
extendida de DNA de doble hebra (2n, 2C).
En S cada hebra sirve de síntesis de otra nueva en el proceso de replicación. Las dos moléculas
de DNA permanecen unidas por el centrómero, dando lugar a 4 hebras, cada doble hebra
constituye una cromátida. Así, el número de cromosomas permanece constante, aunque se
duplica el contenido de DNA (2n, 4C).
En G2, se inicia la recondensación gradual de la cromatina (2n, 4C).
En M antes de la división se completa, dando lugar a cromosoma muy visibles de 2 cromátidas

(2n, 4C2n, 2C).
39
CONTROL DEL CICLO CELULAR
Los puntos de control del ciclo celular son tres y están al final de las fases G1, G2 y M
impidiendo que la célula entre en la fase siguiente hasta que se complete la fase anterior y solo
cuando las condiciones sean óptimas:
1. Punto de control en G1/S (de inicio). (a punto de acabar G1 y pasar a S)

2. Punto de control en G2/M. (a punto de acabar G2 y pasar a M)
3. Punto de control en M (en la transición de la metafase a la anafase)
Si la célula está en los puntos de control, los utiliza

como sistema de verificación. Alguna pregunta que
se puede hacer para seguir adelante o no.
En el primer punto: ¿El entorno es favorable?.

Entrada en el ciclo celular y progresión hacia la fase
S.
En el segundo punto: ¿Se ha replicado todo el DNA?,

¿el entorno sigue siendo favorable?. Entrada en
mitosis.
En el tercer punto (transición de la metafase a la

anafase): ¿Están todos los cromosomas unidos al
huso?. Puesta en marcha de la anafase y progresión
hacia la citocinesis.
CICLINAS
La progresión del ciclo celular se realiza por una maquinaria molecular compleja cuyos
componentes fundamentales son proteínas de dos tipos: ciclinas y quinasas dependientes de
ciclinas (Cdk).
Las ciclinas sin las reguladoras más importantes de las Cdk. En ausencia de las ciclinas, las Cdk
no pueden realizar su actividad proteínas quinasa.
La concentración de ciclinas experimenta un ciclo de síntesis y de degradación en cada ciclo

celular, de ahí su nombre.
Estos cambios cíclicos producen variaciones en el ensamblaje y activación de los complejos

Cdk-ciclina. La activación / desactivación sucesiva, desencadena los acontecimientos del ciclo
celular. Sin estos cambios el ciclo no avanza.
En vertebrados hay 4 tipos de ciclinas:
- Ciclina de G1 o tipo D (D1, D2, D3).

- Ciclinas de G1/S o tipo E
- Ciclina S o tipo A
- Ciclinas M o tipo B
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QUINASAS DEPENDIENTES DE CICLINAS (CDK)
La actividad de estas Cdks aumenta o disminuye a medida que la celula progresa a través del
ciclo celular, provocando cambios cíclicos en la fosforilación de diversas proteínas
intracelulares que inician o regulan los principales acontecimientos de ese ciclo.
Pero hay que resaltar que los niveles de las proteínas Cdk son constantes.
En vertebrados hay 4 tipos de Cdks:
- Asociadas a ciclinas de G1: Cdk4, Cdk6

- Asociadas a ciclinas G1/S: Cdk2
- Asociadas a ciclinas S: Cdk2, Cdk1
- Asociadas a ciclinas M: Cdk1
VARIACIONES DE LAS CICLINAS Y FORMACIÓN DE LOS COMPLEJOS

CDK-CICLINA EN EL CICLO CELULAR
En relación con el punto M, tenemos un punto APC/C.
Las concentraciones de Cdks no varían. Las ciclinas G1 ayudan a controlar las actividades de
las ciclinas G1/S.
41
En G1, en el punto de inicio se elevan las ciclinas de G1/S que le indica a la célula que el
entorno está bien para seguir. Rápidamente y antes de llegar antes se activan y se bajan y su
contenido se mantiene bajo hasta que comiendo G1 de nuevo.
La ciclina S cuando la célula pregunta si puede replicarse, la ciclina S se eleva y se mantiene en

S, en G2 hasta llegar al punto M donde bajo la producción de estas ciclinas.
Por último, las ciclinas M que son cuando célula pregunta si los cromosomas están unidos al
huso, se produce una subida ene l comienzo de G2 y una vez que estamos en M en relación con
APC/C disminuye. La activación de las ciclinas determinadas son las que producen el avance.
ACTIVACIÓN DE LOS COMPLEJOS Cdk-CICLINA
El aumento o el descenso de los niveles de ciclinas es el principal determinante de la

activación/desactivación de los complejos Cdk-ciclina.
A nivel estructural los pasos de activación son:
a) En ausencia de la ciclina, el sitio activo de la Cdk se encuentra parcialmente bloqueado

por una región denominada asa T.
b) La unión de la ciclina hace que esa asa T desaloje el sitio activo provocando la
activación parcial de la Cdk.
c) La activación total del complejo tiene lugar por una quinasa distinta: la quinasa
activadora de Cdk (CAK) que fosforila un aa próximo a la entrada al sitio activo
(treonina del asa T). esto induce un cambio conformacional de la forma del asa T, que
activa aún más a la Cdk, mejorando su capacidad para fosforilar proteínas diana que
llevan a cabo acontecimientos específicos del ciclo celular.
En el formato totalmente activo es como se estimulan los pasos completos celulares en los que
participan los complejos celulares.
Por ejemplo: un aumento de la actividad Cdk en el punto de control G2/M a través del complejo
Cdk-M aumenta la fosforilación de las proteínas que controlan:
- La condensación de los cromosomas

- La desorganización de la envoltura nuclear
42
- El ensamblaje del huso mitótico

- Otros acontecimientos que suceden al comienzo de la mitosis
INHIBICIÓN DE LOS COMPLEJOS CDK-CICLINA
La primera vía es por fosforilación de dos aas situados en el

centro activo de la Cdk inhibiendo la actividad del complejo
Cdk-ciclina. Esto lo lleva a cabo la proteína quinasa Wee1.
Pero una vez se haya inhibido el complejo, se puede producir lo
contrario, la defosforilación de estos residuos por la fosfatasa
Cdc25, y así aumentar la actividad Cdk. Ambos mecanismos
tienen lugar en el control de la actividad del complejo Cdk-M
durante el inicio de la mitosis.
La segunda vía tiene lugar por la unión de proteínas inhibidoras de Cdk (CK1) como p27. La
unión de CKI induce una reorganización de la estructura del sitio activo de la Cdk volviéndola
inactiva. Este mecanismo se utiliza fundamentalmente en la regulación de los complejos Cdk-
G1/S y Cdk-S.
La p27 es una CKI que se une a ambos componentes deformando el sitio activo de la Cdk.
Además se inserta en el sitio de unión del ATP inhibiendo aún más la actividad del enzima.
INTERRELACIONES CON LA REPLICACIÓN EUCARIOTA
Tras formar el complejo pre-replicativo, el complejo Cdk-S estimula el ensamblaje de varias

proteínas adicionales en el origen ORC formando el complejo de preiniciación.
La DNA polimerasa alfa y otras proteínas de replicación son reclutadas en el ORG, los
componentes anulares de las helicasas McM se activan como tales y el desenrollamiento del
DNA por las polimerasas I y II permite que empiece su replicación.
El complejo Cdk-S también bloquea la doble replicación al inducir la degradación de Cdc6 y la

inactivación del ORC.
La fosforilación mediada por Cdk-S específicos de esta fase del ciclo y se activan por
fosforilación. Participan procesos de degradación. A posteriori por las vías comentadas.
La Cdk-S, la degradación de la Cdc6, podemos hablar de introducción de otras proteínas que

fosforilan al ORC.
43
TEMA 10: COMPLEJO PROMOTOR DE

ANAFASE. COMPONENTESY
FUNCIÓN
En la mitosis, hay una mitosis del núcleo y la mitosis del citoplasma o citocinesis. Primero se
divide el núcleo y después el citoplasma.
COMPLEJO PROMORTOR DE LA ANAFASE (APC/C)
Hemos visto que la activación mediante fosforilaciones de los complejos Cdk-ciclina

específicos dirige la progresión del ciclo celular a través de los puntos de control de Inicio y de
G2/M.
Aquí vamos a ver que el punto de control M, localizado entre metafaseanafase no se

desencadena mediante la fosforilación de proteínas sino mediante la degradación proteica
(proteolisis), conduciendo a las etapas finales de la división celular.
El regulador clave es el complejo promotor de la anafase o ciclosoma (APC/C) anaphase

promoting complex.
Este APC es un miembro de la familia de las enzimas ubiquitina ligasa que estimulan la
degradación de proteínas reguladoras específicas. Esto lo hacen transfiriendo a esas proteínas
varias copias de la pequeña proteína ubiquitina y así provocan su degradación proteolítica en los
proteosomas.
CONTROL DE LA DEGRADACIÓN DE CICLINAS POR EL APC/C
El APC/C es un gran complejo proteico.
- Se activa en la mitosis al asociarse con la subunidad activadora Cdc20 concretamente

durante la anafase, o con la subunidad activadora Cdh1 durante la parte última de la
mitosis hasta la G1 temprana. Estas asociaciones ayudan al APC/C a reconocer
secuencias específicas de aas de la ciclina M y de otras proteínas diana.
- Con la colaboración de otras dos proteínas adicionales: E1 y E2, el APC/C transfiere
numerosas moléculas de ubiquitina a la ciclina M u otras proteínas diana. Tras esto, la
ciclina u otra diana poliubiquitinada es reconocida y degradada en el proteosoma y la
Cdk inactivada.
- Como la activación del APC/C durante la mitosis se alarga hasta la G1 temprana, así se
consigue un periodo estable de inactividad Cdk.
- A finales de G1, cuando el complejo Cdk-G1/S se activa, entonces el APC/C se
inactiva, permitiendo así el aumento de la concentración de ciclinas para empezar el
siguiente ciclo celular.
Este APC/C controla la fase de anafase. Controla el complejo Cdk-M. Tras unirse con otras
proteínas: Cdc20, el APC/C se activa. Tras activarse es cuando necesita la ayuda de E1 y E2 y
44
de las unidades X de ubiquitina, en presencia de ellos se une a la cilina M todas las unidades de
ubiquitina y se provoca la degradación de la ciclina M en el proteosoma.
PRINCIPALES PROTEÍNAS DIANA DEL APC/C
Además de la cilina M, también la ciclina S.
Cuando ambas ciclinas son degradadas, la mayoría de las Cdk de la célula se inactivan.
Entonces, muchas proteínas fosforiladas de la Cdk, son defosforiladas por diferentes fosfatasas
presentes en la anafase. Esta defosforilación es necesaria para la finalización de la fase M en las
últimas etapas de la mitosis y la citocinesis.
Otra proteína diana es la segurina. Esta proteína protege los enlaces proteicos que mantienen
unidas a las cromátidas hermanas al comienzo de la mitosis. La degradación de la segurina en la
transición metafaseanafase, activa una proteasa que separa a la cromátidas hermanas y
desencadena la anafase.
VISIÓN DE CONJUNTO DE LA REGULACIÓN DEL CICLO CELULAR
45
En G1, tenemos que estar en un medio que sea favorable para la célula y en esas condiciones
son idóneas para que se forme el complejo inicial de las Cdk-G1, que ayudan al formato de
síntesis de las G1/S que estimula la síntesis de las ciclinas G1/S que son fundamentales para
pasar a la fase S. Cuando se facilita esta vía hay una síntesis de las ciclinas S que se favorece el
paso a S.
Esto se inhibe cuando hay un daño en el DNA cuando hay mutaciones y cualquier otra razón. Si
avanza, los complejos Cdk-M que puede ser inhibido porque no haya habido replicación del
DNA o con daño del DNA. El APC/C al final controla el final de mitosis y el comienzo de G1
luego el control de la síntesis de las ciclinas en la fase G1.
46
TEMA 12: MUTACIÓN Y DAÑO DEL

DNA
MUTACIONES
Las mutaciones son errores de copia de bases puricas o piridimidinicas de los nucleótidos del
DNA durante el proceso de replicación. Como consecuencia, el DNA replicado no es una
réplica exacta del DNA parental.
Pueden ser espontaneas es decir en ausencia de cualquier agente inductor o inducidas por
agentes mutagénicos.
La frecuencia de mutación espontanea en el DNA es muy baja de aproximadamente 1 por cada

30x10^6 nucleótidos.
Esta baja frecuencia de mutación del DNA se debe fundamentalmente a la acción correctora
llevada a cabo por la exonucleasa 3`5`de algunas DNA polimerasas como delta y épsilon. Y
en el caso del mtDNA la gamma.
Ya veremos más adelante como estos cambios a nivel de replicación afectan la traducción
(alteración en proteínas).
TIPOS DE MUTACIONES
Por sustitución: por cambio de un par de bases por otro.
- Transición: sustitución de una purina por otra purina, o de una pirimidina por otra
pirimidina.
- Transversión: por sustitución de una purina por una pirimidina o viceversa.
Por inserción: por introducción de uno o más pares de bases.
Por eliminación: por deleción de uno o más pares de bases.
POR SUSTITUCIÓN
Transiciones: Transversiones:
A-T T-A A-T T-A
G-C C-G C-G G-C
47
AGENTES QUÍMICOS-FÍSICOS QUE INDUCEN ALTERACIÓN DE BASES
Por acción de agentes químicos como el ácido nitroso, hidroxilamina y agentes alquilantes
como el dimetil sulfosido se pueden inducir modificación de bases que producen mutaciones:
- Tautomerización: interconversión entre dos isómeros que solo se diferencian en la

posición de los dobles enlaces. Ej: T-AC-At (tautómero)C-G (transición)
- Desaminación: se puede inducir desaminación de A Hipoxantina.Ej: A-TH-

CG-C. Se pueda dar de forma espontánea o forzada en el laboratorio. La
hipoxantina es una base que de manera natural es rara pero de forma forzada no lo es
tanto. La hipoxantina no se puede unir a timina sino que se una a C, tras la replicación
la citosina se une a una guanina ya que es su base complementaria, así se consigue una
mutación por transición.
Por radiación ultravioleta o rayos X: se pueden inducir dímeros de timina en la misma hebra
de DNA.
Por agentes intercalantes: como la naranja de acridina, bromuro de etidio etc, se puede
producir estiramiento de las hebras del DNA y desparejamiento. No con el Gel Red.
TAUTOMERIZACIÓN
T-AC-AtC-G Esto provoca finalmente una transición.
En la adenina, el grupo amino se ha convertido en un grupo imino lo que

provoca la pérdida de dobles enlaces.
DESAMINACIÓN
El tratamiento del DNA con HNO2 produce desaminación

de la adenina en hipoxantina. La hipoxantina se empareja
con la C en lugar de T lo que provoca una transición A-
TH-CG-C.
LA LUZ ULTRAVIOLERA Y RAYOS X PRODUCEN DÍMEROS
Este dímero no puede acomodarse en una doble hélice y por tanto la

replicación se bloquea.
Cuando dos timinas consecutivas de la cadena (por tanto una sin y la

otra anti) están expuestas a UV pueden tomar la posición para
enfrentarse y formar uniones entre carbonos por la pérdida de dobles
enlaces y se forman dímeros de timina que tiene lugar en la misma
hebra.
Si tenemos una hebra con timinas, entre dos timinas, una de ellas se gira y se forman los enlaces
entre carbonos y se da la formación de dímeros de timina. Por lo que impiden la formación de
los enlaces de Watson y Crick, luego impiden la replicación posterior.
48
LOS AGENTES INTERCALANTES PRODUCEN ESTIRAMIENTO
Estos se intercalan en el DNA entre pares de bases adyacentes y producen estiramiento de la

hélice y corrimiento del marco de lectura.
MUTAGÉNESIS Y CARCINOGÉNESIS
Mutagénesis: es producir mutaciones.
Carcinogénesis: es producir cáncer.
Hoy en día se considera que ambas son manifestaciones implicadas en un mismo fenómeno
subyacente, es decir, al modificación estructural del DNA.
Por ello existe una prueba “test de Ames” que mide la tasa de mutación experimentaba por
bacterias expuestas a sustancias químicas sospechosas de ser carcinogénicas. Esto ahorra mucho
tiempo y el dinero que costaría al hacerlo en animales superiores.
Sin embargo, la extrapolación al hombre, siempre es conflictiva.
COMPUESTOS COTIDIANOS DE GRAN TOXICIDAD
ADITIVOS DE LOS ALIMENTOS
• Los E100 son colorantes:
E102:tartrazina; E104:amarillo de quinoleina.
E110: amarillo ocaso; E122: azorrubina; E124: ponceau4R;
E129: rojo allura; E128: colorante rojo que se usaba para colorear la carne de hamburgesas y
salchichas ha sido prohibido.
• Los E200 son conservantes
E211: benzoato de sodio; E214-219: parabenes, de ellos los E216,17 propil-paraben se usan
en cosmética.
E249-E252: nitratos-nitritos, se usan en charcutería.
• Los E300 son antioxidantes y antiranciedad
• E320-321: derivados bencénicos
• Los E400 son emulsificántes y gasificántes
En suma: Hay que evitar comprar productos con más de 3”E”
TÓXICOS MEDIO-AMBIENTALES
Cerca de 3 millones de personas se envenenan cada año en el mundo por exposición directa a
agrotóxicos (pesticidas).
La presencia de residuos de pesticidas en alimentos, en el agua, en el aire, en el interior de

edificios, trenes o aviones supone una carga tóxica cuyas secuelas ignoramos. El DDT se
49
prohibió en 1975 porque dejaba estériles a las aves, pero todavía hoy se detecta en el 88% de la
población.
El parlamento europeo prohibió en 2009 el uso de 22 sustancias que en exposición directa

actúan como cancerígenas, mutagénicas, o que afectan a la reproducción. Entre ellos la atracina,
que produce infertilidad en peces, reptiles, aves y batracios, sin embargo sigue usándose en
USA como herbicida en muchos cultivos, incluso maíz.
En los pescados uno de los problemas es la concentración de metales como el mercurio. Otro,
los bifenilospoliclorados (a continuación), prohibidos hace tiempo pero presentes en muchos
mares.
ALGUNOS COMPUESTOS TÓXICOS A LOS QUE ESTAMOS EXPUESTOS

DIARIAMENTE
Las venzofenonas, presentes en los filtros UV de las cremas solares.
Los parabenes de productos cosméticos y champús.
El bisfenol A (BPA) presente en plásticos y resinas epoxi. Dosis de este, equivalente a niveles
de exposición cotidianos, actúan de forma estrogénica contribuyendo al desarrollo de obesidad,
dislipémia y resistencia a la insulina produciendo diabetes de tipo II.
HERENCIA MITOCONDRIAL
UN embrión hereda el DNA genómico tanto del núcleo del espermatozoide como del núcleo del
óvulo en la fecundación. Mientras que el mtDNA solo lo hereda del citoplasma del óvulo
porque el espermatozoide no tiene mitocondrias.
Por tanto, la herencia mitocondrial solo la transmite la madre a través del citoplasma del óvulo y
también las enfermedades relacionadas, mientras que los varones no las transmiten.
Los óvulos tienen alrededor de 100000copias del mtDNA (que representan el 30% del DNA del
óvulo). El número de copias de mtDNA de otras células varían entre 1000-10000.
Alrededor de 1 cada 200 niños presenta mutaciones en el mtDNA al nacer, pero en la mayoría
de los casos sólo padecen enfermedades leves o asintomáticas. Sin embargo, en uno de cada
6500 niños estas mutaciones inducen importantes patologíascitopatías mitocondriales.
CITOPATÍAS MITOCONDRIALES
Son enfermedades mitocondriales humanas que se deben a mutaciones puntuales, delecciones, o

duplicaciones de los genes que codifican a las enzimas del transporte electrónico y producen
defectos en la producción del ATP mitocondrial. Provocan serios problemas cardiológicos, fallo
hepático, desordenes cerebrales, ceguera o síndromes relacionados con debilidad muscular.
Algunas citopatías mitocondriales:
- (MERRF): epilepsia mioclónica y enfermedad de las fibras rojas desordenadas. (gen:

ATP 8).
- (LHON): neuropatía óptica hereditaria de Leber (genes: ND1, ND4, CYB).
50
- (NARP): debilidad muscular neurogénica, ataxia, y retinitis pigmentosa. (gen: ATP 6).
- (MELAS): encefalomiopatía mitocondrial. Acidosis láctica y síntomas semejantes a la

apoplejía. Es un tipo de diabetes que no es de tipo I, menos común y poco estudiada.
Con base microbiana.
- (MMC): miopatía y cardiopatía heredada maternalmente.
HETEROPLÁSMIA Y MOSAICO
Desde el punto de vista del contenido en mtDNA las células de un organismo pueden ser:
homoplásmicas cuando todas tienen el mismo mtDNA o heteroplásmicas cuando contienen una
población mixta de mtDNA normal y patológico, ambos transmitidos a través de la madre. A
esto último se le llama heteroplasmia y complica la relación entre genotipo y fenotipo en las
mutaciones mitocondriales.
La heteroplasmia es distinta del mosaico. Este será relacionado con el DNA genómico y es
cuando un organismo tiene una mezcla de células con genotipos diferentes pero que se han
desarrollado a partir de un mismo zigoto. Los mosaicos pueden aparecer de forma natural como
resultado de una mutación en células que dan lugar a nuevos tejidos o pueden generarse en
laboratorio.
51
TEMA 13: MECANISMOS DE

REPARACIÓN DEL DNA
MECANISMOS GENERALES DE REPARACIÓN DEL DNA
Hay tres tipos de reparaciones:
- Reparación directa: que no se da en humanos.
- Reparación por eliminación de bases.
- Reparación por eliminación de nucleótidos.
REPARACIÓN DIRECTA (NO EN HUMANOS)
La reparación directa implica la regeneración de la base dañada. Pero este mecanismo, aunque
es factible en muchas especies incluidos reptiles, anfibios y mamíferos marsupiales, no lo es en
mamíferos placentarios como los humanos.
En los animales que se da reparación directa, por ejemplo, la reparación de los dímeros de
timina formados por la luz UV, esta se basa en el reconocimiento del dímero por la enzima
fotoliasa que los escinde fotoquímicamente, mediante una reacción de transferencia electrónica
iniciada por la absorción de luz visible, recuperándose así las dos bases originales. La fotoliasa
tiene como coenzimas al FADH2 y a un cromóforo que absorbe la luz e inicia la transferencia
de electrones.
En condiciones de oscuridad, existen otros sistemas de reparación directa en los que no

entramos.
VÍAS DE REPARACIÓN DEL DNA EN HUMANOS
Por eliminación de bases
Por eliminación de nucleótidos.
REPARACIÓN POR ELIMINACIÓN DE BASES
El primer paso implica la actuación de las enzimas DNA glicosidadas.
- Estas enzimas reconocen bases alteradas en el DNA (por ejemplo por desaminación) y
catalizan su eliminación por hidrólisis.
- Se desplazan a lo largo del DNA y utilizan su capacidad de “darle la vuelta a la base”

para evaluar su estado.
- Cuando encuentran una base dañada hidrolizan su enlace N-glicosídico con la

desoxirribosa, dando lugar a un sitio apurínico o apirimidínico, según el caso.
El segundo paso implica la actuación de la enzima AP endonucleasa (por lo sitios apurínicos o

apirimidínicos que la endonucleasa deja en la cadena de DNA).
52
- El hueco creado por la DNA glicosidasa es reconocido por esta enzima que elimina,
junto con la fosfodiesteresa, el enlace fosfodiéster originando una mella.
El tercer paso implica la maquinaria replicativa con las DNA polimerasas (delta y epsilon) y
con la DNA ligasa terminando de cerrar el hueco.
El resultado neto es que se empieza por ejemplo con una desaminación de una C y se termina
restaurando esa C.
DESAMINACIÓN DE LAS BASES DEL DNA
La adenina por desaminación nos da la hipoxantina. El ácido nitroso

como agente químico que lo fuerza o por desaminación natural. La
hipoxantina en la replicación se detecta una mutación por transición.
La guanina se puede desaminar a xantina. La citosina también se

puede desaminar y da uracilo. El uracilo también se puede obtener de
otras maneras. Una base pirimidina puede dar una base de RNA.
Nuestro DNA puede tener bases de RNA de forma espontánea. La
timina no se puede desaminar.
En nuestro DNA tenemos 5-metil citosina en alta

proporción. Se puede desaminar a timina.
El reconocimiento de un nucleótido mutado “dándole la

vuelta”. Las glicosidasas sacan una vez cortado a la base
y le dan la vuelta. Es una forma que sigue el proceso que
llama la atención que pide reparación.
REPARACIÓN POR ELIMINACIÓN DE BASE: resumen
Se produce una desaminación en una citosina lo que da lugar a un uracilo. Esto es

detectado por la glucosidasa que en este caso son específicos para los uracilos. Lo
detecta y lo asca cortando el primer enlace beta-glucosídico. La AP endonucleasa
y la fosfodiesterasa eliminan el azúcar fosfato. El tercer paso es que las DNA
polimerasas añaden nuevos nucleótidos y la DNA ligasa sella la muesca.
EN RELACIÓN CON LA REPARACIÓN DE LA MUTACIÓN CAUSADA POR

DESAMINACIÓN DE LA CITOSINA (CU)
Hemos visto que la lleva a cabo una enzima muy específica: la uracilo DNA glucosidasa que
recorre el DNA reconociendo como extraño el uracilo formado por la desaminación de la
citosina.
No actúa sobre residuos U del RNA.
Si el DNA estuviese formado por U en lugar de T sería imposible diferenciar los residuos U
formados a partir de C, de los naturales y la mutación CU no podría repararse. Así que este
mecanismo de reparación se considera como una ventaja evolutiva.
53
Además, en las células se reduce la posibilidad de que U se incorpore en la síntesis del DNA
gracias a otra enzima dUTP pirofosfatasa que elimina este nucleótido precursor
(UTPUMP+PPi).
EN RELACIÓN CON LA REPARACIÓN DE LA MUTACIÓN CAUSADA POR

DESAMINACIÓN DE LA 5-METIL-CITOSINA (5mCT)
De entrada hay que resaltar que los nucleótidos C-metilados representan alrededor del 3% en
humanos y las mutaciones de estos nucleótidos constituyen una tercera parte de las mutaciones
de una sola base que se han observador en enfermedades hereditarias humanas.
Hemos visto que la mutación por desaminación de la 5-metil-citosina produce T. este en

principio no puede distinguirse del nucleótido T natural del DNA, pero los T así formados, se
aparean después erróneamente con el nucleótido G de la otra cadena de DNA.
La reparación de estos nucleótidos metilados la lleva a cabo una DNA glicosidasas especial.
Para su reconocimiento por esta enzima hay un hecho y es que las 5-metil-citosinas se presentan
con mucha frecuencia en secuencias o isletas CG repetitivas y la glicosidasa especial reconoce
los apareamientos de bases erróneos cuando las C-metiladas por desaminación producen T que
se aparean con G y elimina estos T.
54
TEMA 14: REPARACIÓN DEL DNA (II)

REPARACIÓN POR ELIMINACIÓN DE NUCLEÓTIDOS
Este tipo de reparación elimina grandes lesiones en el DNA que originan importantes cambios
en la estructura de la doble hélice del DNA como dímeros de pirimidina T-T, T-C, C-C
generados por la acción UV de la luz solar, enlaces covalentes con grandes moléculas de
hidrocarbonos como el compuesto carcinógeno benzopireno, etc.
En esta vía, un gran complejo multienzimático de múltiples subunidades polipeptídicas

rastrea en el DNA buscando más que cambios en bases, distorsiones en la doble hélice.
Cuando se detecta una gran lesión, el esqueleto fosfodiester de la cadena que lo presenta es
cortado a cada lado de la distorsión por las enzimas endonucleasas del complejo (escinucleasas
o nucleasas de eliminación) y una DNA helicasa asociada al complejo, elimina toda esa zona
dañada.
A continuación entra la maquinaria replicativa de la DNA polimerasa (δ y ε) que rellena el

hueco dejado por la escinucleasa mediante la elongación del extremo 3’OH usando la otra
hebra como molde y una DNA ligasa une extremos cerrando la mella.
MÁS SOBRE EL GRAN COMPLEJO ENZIMÁTICO
Este gran complejo posee varias proteínas de reconocimiento de la lesión en el DNA y posterior
unión a esa lesión como las proteínas: XPA, XPC, HHR, RPA etc.
Además este gran complejo incluye endonucleasas especiales como la escinucleasa que
hidrolizan sendos enlaces fosfodiéster a ambos lados de la zona lesionada (concretamente a -22
y +6 en humanos). La escisionasa humana está formada por 6 subunidades funcionales que se
van asociando y separando durante el proceso
La siguiente actividad enzimática incluida en el complejo es la de helicasa favoreciendo la

separación del oligonucleótido liberado (~28 nucl en humanos).
Resaltamos que algunas de las subunidades de la escisionasa del gran complejo permanecen en
el tramo monocatenario hasta ser desplazadas por las DNA polimerasas apropiadas según el
tamaño de la lesión y que seguidamente comentaremos.
REPARACIÓN POR ELIMINACIÓN DE NUCLEÓTIDOS
En la distorsión hay unas proteínas de reconocimiento que se sitúan sobre la hebra dañada y
reconocen el fragmento que puede ser cortado. La nucleasa de eliminación o escisionasa que
corta y con la actividad de la DNA helicasa obtienen un fragmento que en parte está dañado y
no. En la hebra no dañada siguen las esciosionasas vigilando para que las DNA polimerasas
repliquen el fragmento correctamente y después participa una DNA ligasa y se terminado el
proceso.
55
HAY DNA POLIMERASAS ESPECIALES PARA REPARAR EL DNA

GRAVEMENTE DAÑADO
Si el DNA está gravemente dañado en una gran extensión, los mecanismos de reparación de los
que hemos hablado resultan insuficientes.
En este caso, en la parte final de esta reparación, la célula utiliza DNA polimerasas “menos
estrictas” y menos precisas para reparar ese DNA dañado.
En humanos hay varios tipos de DNA polimerasas haciendo esto (incluido la beta comentada en
el tema 5) que carecen de actividad exonucleasa 3`5` pero son poco discriminantes con el
nucleótido que deben incorporar y así se equivocan menos. Se cree que por estos motivos estas
DNA polimerasas solo actúan añadiendo muy pocos nucleótidos. Están en estudio.
EL DNA QUE SE VA A TRANSCRIBIR SE REPARA MAS URGENTEMENTE
Aunque toda el DNA está bajo constante vigilancia para su reparación, el que está a punto de
transcribirse se repara antes: “transcripción acoplada a la reparación”, es decir, funcionan
rápidamente los dos sistemas de reparación (por base o por nucleótido) que hemos visto pero
solo en la cadena que se está transcribiendo.
La RNA polimerasa, enzima que transcribe el DNARNA (ya veremos, cuando estudiemos
estudiando la transcripción a partir del tema 18), reconoce la lesión del DNA y mediante unas
proteínas acopladas, dirige la maquinaria hacia esos sitios.
SÍNDROME POR DEFECTOS DE REPARACIÓN DEL DNA
SÍNDROME DE COCKAYNE
La importancia de la transcripción acoplada a la reparación queda reflejada en este síndrome.
En estos enfermos, la RNA polimerasa no puede actuar y se queda parada de forma permanente
en los sitios de DNA dañado correspondientes a los genes CSA o CSB.
Estos enfermos cursan con retraso en el crecimiento, anormalidades esqueléticas y retraso

neuronal progresivo causado por desmielinización y sensibilidad severa a la luz del sol.
CÁNCER DE COLÓN HEREDITARIO NO ASOCIADO A POLIPOSIS

(HNPCC)
Al cáncer de colón le vamos a dedicar una parte del tema 40.
Ahora diremos que es uno de los tipos de cáncer hereditario más comunes. Está causado entre
otros, por defectos en los genes MSH2, MLH1.
Estos genes son responsables de la reparación de emparejamientos incorrectos y aquí no

funcionan.
Se puede detectar por análisis de polimorfismo tipo VNTR que veremos en el tema 24.
56
XERODERMIA PIGMENTARIA O DE KAPOSI (XP)
Rara enfermedad humana de la piel que la hace extremadamente sensible a la luz solar. Desde la
infancia la piel se va volviendo más seca y atrófica. Aparece la queratosis, los párpados se
agrietan y se producen úlceras en la córnea. Con frecuencia se desarrolló cáncer de piel en
muchas zonas.
Muchos pacientes mueren antes de los 30 años debido a metástasis de esos tumores.
Se ha demostrado la existencia de mutaciones en genes que codifican componentes de la

escisionasa que participa en la vía de reparación del DNA mediante escisión de nucleótidos.
Se ha detectado una gran acumulación de dímeros de timina en estos enfermos.
Los genes relacionados son: XPA, B, C, D, F, G y ERCC1.
57
TEMA 15: REPARACIÓN DE DOBLES

MELLAS DEL DNA
REPARACIÓN DE ROTURAS EN LAS DOS HEBRAS DEL DNA
Cuando las dos cadenas de DNA se rompen, se produce un tipo de alteración muy peligroso ya
que no queda ninguna cadena patrón que permita la reparación precisa. Si esta doble rotura se
dejara de reparar, nos llevaría al fraccionamiento de los cromosomas en pequeños trozos.
Hay dos mecanismos de reparación de roturas dobles:
- La recombinación no homologa o unión de extremos no homólogos
- La recombinación homologa, utilizando la cromátida hermana del DNA recién

duplicado.
Muchos organismos utilizan ambos mecanismos de reparación, también los humanos
Hay que indicar que la recombinación aparte de reparar el daño del DNA, también puede ser
una herramienta de intercambio de información genética.
PROTEÍNAS DE REPARACIÓN POR RECOMBINACIÓN
Las proteínas que llevan a cabo la reparación por recombinación. Se sintetizan en grandes
cantidades en loa eucariotas y están dispersas por todo el núcleo. Aunque todavía se conoce
poco de ellas.
En respuesta al daño en el DNA estas proteínas convergen rápidamente en los sitios dañados y
forman “fábricas de reparación” en las que reparan conjuntamente estos daños.
Esta rápida movilización de proteínas de reparación hacia estos sitios, está estrechamente
controlada por la célula y requiere de otras proteínas adicionales que si estuvieran alteradas por
ejemplo en ciertos cánceres, causarían una reparación deficiente.
RECOMBINACIÓN NO HOMOLOGA
Suele presentarse por mutaciones tipo deleciones o inserciones cortas.
Es común en las células somáticas de los mamíferos y se puede considerar como una solución
rápida y “sucia”.
“Sucia” porque consiste en que los extremos rotos se vuelven a unir con la perdida de uno o más
nucleótidos. Esto parece asumible por la célula, al igual que vimos que se usan DNA
polimerasas “poco precisas” en la reparación de nucleótidos en una sola hebra.
Es posible, porque la porción del genoma que codifica proteínas (genes de copia única o
estructurales) es muy baja (aproximadamente 1,5%) y seguramente el daño no está incluido en
esa parte.
Se calcula que el hombre puede tener a la vejez > 2000 de esos daños en el DNA.
58
La proteína que se estudia que actúa de forma

sucia en la reparación no homologa es la
proteína Ku que sujeta los extremos del
cromosoma roto.
Se produce una rotura de la doble cadena. La

proteínas es capaz de reconocer los extremos
rotos a través de su estructura heterodimerica.
Se sitúa a los dos extremos de la rotura doble
del DNA. A continuación participan unas
proteínas adicionales de las que se conocen
menos que se sitúan para mantener juntos los
extremos rotos mientras son procesados. Hay cierta capacidad polimerasa pequeña de síntesis y
eso parece que en algunas de las subunidades de la proteína Ku son capaces de hacerlo. Parece
que podría estar actuando las DNA ligasas. Se unen los extremos por una DNA ligasa
perdiéndose algunos nucleótidos.
LA RECOMBINACIÓN HOMOLOGA
Repara las roturas en la doble cadena que aparecen poco después de la replicación del DNA,
cuando las cromátidas hermanas todavía están unidas, restaurando así la secuencia original del
DNA.
Tiene lugar entre dos determinados segmentos de las dos cromátidas del DNA de secuencias
nucleotídica similar. Este proceso es esencial para la reparación sin errores del daño
cromosómico en todas las células.
Pero además, esta recombinación homóloga puede reorganizar las secuencias del DNA,
alterando el momento y el nivel de expresión del gen o genes relacionados.
Este intercambio de información genética o “mezclado de genes” es crucial para facilitar la

evolución de los organismos en respuesta a cambios del ambiente.
La recombinación homóloga primeramente se estudió como el responsable del entrecruzamiento

que tiene lugar durante la meiosis, pero en este tema no entramos.
59
Se necesita la presencia de las cromátidas hermanas y la rotura se produce en una cromátida y la

otra está intacta. Esta pérdida de nucleótidos por degradación como por hechos físicos como la
radiactividad o altos niveles de radiación ultravioleta. El daño es reparado con exactitud.
Primero sobre la rotura inicial producida por hechos físicos,

parece que actuarían unas exonucleasas aumentado esa rotura
inicial. La exonucleasa degrada el extremo 5`.
El siguiente paso es la invasión de la cadena: se ha demostrado

que la cadena en dirección 5`3ìnvade la cadena intacta y se
forma un punto de bifurcación. Esto es para copiar de la
cromátida hermana la zona dañada por la exonucleasa.
Se sintetiza una nueva hebra complementaria a una de las

hebras de la cromátida intacta. Hay una migración del punto de
bifurcación. La hebra nueva sale y se sitúa en su sitio en la
cromátida dañada y a continuación se crea una cadena
complementaria a la nueva hebra.
La invasión como la síntesis y migración son funciones de las

proteínas de reparación. Una vez formadas las hebras, participa
la ADN ligasa uniéndolas.
PROTEÍNAS SSBs EN LA REPARACIÓN POR

RECOMBINACIÓN HOMOLOGA
Los fenómenos de recombinación homologa están dirigidos por

un conjunto de proteínas de reparación del DNA (proteínas
SSB: single-strand DNA-binding proteins) que ya vimos en la
replicación del DNA.
Las SSB son helicasas que actúan en la separación de las dos

hebras del DNA. Se unen con fuerza de forma cooperativa al
esqueleto azúcar-fosfato de cualquier región de una sola cadena
de DNA, colocándola en una conformación extendida con sus
bases asequibles. Así se pueden formar pares de bases con secciones complementarias a la otra
cadena de DNA.
En la cromátida supeior, la cadena 5`3èn su extremo 3` tiene contacto con las proteínas
RecA en procariotas o su homologa Rad51 en eucariotas que la dirigen hacia la invasión del
dúplex inferior homologo.
Estas SSB se unen con fuerza en los largos agregados cooperativos a ese extremo 3`formando
un filamento de nucleoproteínas que sujeta una cadena sencilla y una doble hélice. Después
localizan una secuencia homóloga y la copian. El resultado es un heteroduplex
Tras esto, hay una migración de cadenas. Puede ser espontánea o ayudada por otras proteínas,
en este caso requiere energía en forma de ATP.
60
PROTEÍNAS RecA
La hebra que migra hacia abajo está representado como 5`3`,

el heteroduplex está formado por la que entra y se pega.
Sustentado todo por muchas subunidades de las SSB. Hay
un momento que son tres cadenas que no se conocen muy
bien.
La Rad 51 humana tiene forma de donut y está compuesta

por 11 subunidades. Su eliminación conduce a la muerte
celular.
DEFICIENCIAS EN LA RECOMBINACIÓN PUEDEN INDUCIR

CÁNCER
Una secuencia de DNA en un cromosoma homologo puede quedarse como “no funcional”
después de repararse utilizando el otro cromosoma homologo como patrón. A esto se le
llama “pérdida de heterozigosidad” y es un desafortunado efecto secundario de la versatilidad
de esta recombinación y puede darse en algunos cánceres humanos.
En humanos, las proteínas brca1 y brca2 codificados con los genes BRCA1 y BRCA2 a su vez
relacionados con el cáncer de mama, son proteínas de reparación adicionales. Se ha observado
que son capaces de unirse a las proteínas Rad51 esencial para la recombinación homóloga. Se
cree brca2 colabora en el transporte rápido de Rad51 a los lugares de daño y una vez en el sitio
adecuado la libera en su forma activa.
Una unión alterada de estas proteínas con Rad51 puede hacer que repare deficientemente o a
inactivarla. La acumulación de daño en el DNA puede, en una pequeña acumulación de células
dar lugar a un cáncer.
61
TEMA 16: RECOMBINACIÓN

GENÉTICA DE SITIO
RECOMBINACIÓN GENÉTICA ESPECÍFICA DE SITIO
Se trata de un mecanismo de recombinación de elementos genéticos distinta a la recombinación

no homologa o homologa para reparación de doble roturas en el DNA que vimos en el tema
anterior o de la recombinación por transposones (elementos genéticos móviles) que no está
incluida en el programa.
La recombinación específica de sitio necesita secuencias especializadas de DNA tanto en el

DNA aceptor como en el DNA dador, de ahí su nombre “específica de sitio”. Estas secuencias
especializadas contienen lugares de reconocimiento para la recombinación particular que se
lleva a cabo en esta reordenación.
Los mecanismos de reacción incluyen a las enzimas recombinasas (integrasas) que forman
uniones covalentes de gran energía y transitoriedad con el DNA aceptor para completar su
reordenación.
RECOMBINACIÓN DEL DNA CIRCULAR DEL FAGO LAMDA CON EL DNA

BACTERIANO
Es el ejemplo más estudiado que se conoce. Cuando este fago penetra en una bacteria dirige la
síntesis de una recombinasa codificada por el mismo: la integrasa lambda.
Esta integrasa se une a una secuencia específica del DNA del fago y también a una secuencia
del DNA de la bacteria con sitios de reconocimiento en ambos.
La integrasa cataliza el proceso de corte y unión necesario para la recombinación. En el punto

de intercambio hay una pequeña unión heteroduplex que luego se separa en dos creando los
extremos.
En respuesta a señales específicas, otro mecanismo permite que el DNA del fago salga de su
lugar de integración en el DNA de la bacteria y se multiplique rápidamente dentro de la
bacteria. Para ello se necesita otra enzima, la escisionasa.
Tenemos el bacteriófago lambda con unos extremos cos determinados. El cromosoma de E. coli
con extremos complementarios a los cos. Tras la introducción del fago en E. coli, participa la
integrasa que es capaz de poner en contacto del fago y E.coli. Se forma algunas uniones
heteroduplex y también hay una catálisis del corte y unión de la doble cadena. La integrasa sale
y se integra el DNA del fago en el cromosoma de E.coli.
CICLO VITAL DEL BACTERIÓFAGO LAMBDA
La vía de la integración y de la escisión. E.coli infectado por un virus lambda. Por la actividad
integrasa del fago hace que se integre en el DNA de la bacteria el del virus y quede como un
profago. Es una vía de profago tranquila. Pero en un momento determinado, hay una inducción
y el DNA integrado se separa por la escisionasa y entonces ese DNA del fago hace que se
produzcan enzimas y proteínas infectivas. Esta es la vía lítica.
62
APLICACIÓN DE LA RECOMBINACIÓN GENÉTICA ESPECÍFICA DE

SITIO A LA INACTIVACIÓN GÉNICA “KNOCKOUT”
Esta recombinación se puede utilizar para activar y también para desactivar genes (inactivación
“knockout”)
Hemos visto que cuando los lugares reconocidos en la recombinación especifica de sitio están
orientados de forma natural hay una integración y después puede haber o no una escisión.
Ahora vamos a ver que cuando esos lugares de reconocimiento están orientados de forma
inversa, la secuencia de DNA entre ellos es preferentemente invertida en lugar de escindida.
Muchas bacterias utilizan este tipo de inversión de la secuencia de DNA para controlar
inactivando la expresión de algunos de sus genes.
Por eso, las recombinasas bacterianas o víricas específicas de sitio como las integrasas y
escisionasas se han convertido en herramientas muy útiles en ingeniería genética.
VARIOS TIPOS DE REORDENAMIENTO DEL DNA POR RECOMBINACIÓN

GENÉTICA ESPECÍFICA DE SITIO
En algunas condiciones, puede haber una escisión

produciendo esa enzima la maquinaria genética de la célula
hospedadora dando lugar a la posibilidad de recombinación.
Hay bacterias que tienen unos sitios del genoma que son sitios
de inversión. Cuando tenemos los sitios de inversión, una
secuencia inicial introducida como A-B, al integrarse en esos
sitios de inversión lo hace de forma contraria B-A,
produciendo inactivación del DNA y en algunos casos pueden
ser sacados por escisionasas.
COMO SE ELIMINA UN GEN ESPECÍFICA DE UN TEJIDO DETERMINADO

DE RATÓN (POR EJEMPLO EL HÍGADO)
Se requiere la inserción en la línea germinal del animal para que sea heredable, de dos
moléculas de DNA, diseñadas específicamente:
- Un DNA que contenga el gen de la recombinasa bajo control de un promotor específico

de tejido que asegura que ese enzima solo se exprese en ese tejido (por ejemplo en
hígado) donde queremos anularle.
- Otro DNA que contenga el gen de interés a eliminar flanqueado por sitios de
reconocimiento (IoxP) para la recombinasa. Este DNA tiene que haber sido previamente
manipulado.
El ratón debe estar previamente modificado de tal manera que el gen de la recombinasa que se
le inserta, sea el único gen capaz de codificar este enzima. Es decir, hay que quitarle “el
natural”.
63
En el momento adecuado, el gen que codifica la recombinasa puede activarse y reordenar

invirtiendo la secuencia del DNA que contiene el gen. Este reordenamiento elimina el gen del
hígado.
Hay que tener en cuenta que si el gen de la recombinasa solo se expresa en hígado, el gen de
interés solo se elimina de allí y no de otros tejidos.
INACTIVACIÓN DE GENES MEDIANTE INVERSIONES DEL DNA EN

BACTERIAS
La inversión es prácticamente un promotor entero. Luego la regulación del promotor sobre las
proteínas de ese promotor son inactivadas.
De manera general un promotor que da lugar a un mensajero policistrónico que da lugar por la
traducción a la proteínas H2 y la proteína represora que es capaz de bloquear la activación de
otros genes. Pero la inversión del promotor bacteriano de formas artificiales no actúa como tal y
los dos genes resultan inactivos y no se genera el mensajero policistrónico. Luego al no
formarse la proteína represora no se inhiben los genes correspondientes.
APROXIMACIÓN A LA ELIMINACIÓN DE UN GEN ESPECÍFICO DE UN

TEJIDO DETERMINADO DE RATÓN (POR EJEMPLO EL HÍGADO)
Primeramente se requiere la creación de dos líneas de ratones transgénicos:
- Una que contenga el gen de la recombinasa Cre (bacteriana) bajo control de un

promotor específico de tejido que asegura que ese enzima solo se exprese en ese tejido
(por ejemplo, hígado).
- Otra que contenga el gen de interés, manipulado previamente para que esté flanqueado
por sitios de reconocimiento (loxP) para la recombinasa.
- A continuación cruzaremos ratones de ambas líneas hasta tener heterocigotos para

ambos genes. Se cruzaron sucesivamente hasta conseguir homocigotos para ambos
genes.
En un homocigoto en un momento dado, el gen que codifica la recombinasa puede activarse y

reordenar la secuencia del DNA que contiene el gen de interés. Una inversión podría inactivar el
gen del hígado (inactivación “knockout”) pero no en otros tejidos de ese animal.
PARA ELIMINAR UN GEN ESPECÍFICO DE UN DETERMINADO TEJIDO
Estamos en un tejido específico, tenemos el gen de la recombinasa que tiene una zona
promotora y con una secuencia determinada para que sea propio del tejido en este caso del
hígado. Se activa el gen y por transcripción se forma un mensajero que fabrica la recombinasa
que se sintetiza solo en las células hepáticas.
El gen de interés que queremos eliminar, el gen de interés tiene los sitos loxP sitos de
reconocimiento de las recombinasas. La recombinasa activado es capaz de actuar sobre esos
genes de interés actuando sobre los sitios loxP y hace una escisión específica por recombinación
específica de sitio por inversión. El gen de interés es eliminado del cromosoma y se pierde
cuando la célula se divide.
64
En otros tejidos, el gen de la recombinasa es inactivo y el promotor específico de lugar solo se

activa en hígado porque solo es activo en el hígado y esa recombinasa de hígado no se forma,
luego el gen de interés que queremos eliminar no se elimina porque hay recombinasa luego por
transcripción del gen de interés se forman las proteínas de interés.
RECOMBINACIÓN GENÉTICA DE LOS GENES DE LAS

INMUNOGLOBULINAS
LOS DOS TIPOS PRINCIPALES DE RESPUESTAS INMUNITARIAS

ADQUIRIDAS
Cuando un organismo es atacado produce una respuesta inmunitaria natural, pero también una
adquirida: mediada por anticuerpos que es una respuesta humoral, respuesta mediada por
linfocitos T que es la respuesta celular.
Los anticuerpos humanos: M, D, G, A y E. Las cadenas pesadas pueden ser de 5 tipos y las
cadenas ligeras pueden ser de dos tipos.
En cada cadena hay una región variable y otra constante.
La cadena ligera tiene unos 110 aa para las regiones varibles, la región constante son unos 110
aa para la cadena ligera, pero la cadena constante de la cadena pesada es de 330-440aa.
Las cadenas ligeras tienen dos dominios, pero las cadenas pesadas tienen 4 dominios. La
regiones variables se llaman VL para la ligera y VH para la cadena pesada. Las regiones
variables son las zonas de unión de antígenos. Las IgM y las IgE no presentan región bisagra y
tienen un dominio CH4 adicional.
MÁS CARACTERÍSTICAS DE UNA INMUNOGLOBULINA
La similitud existente entre los diferentes dominios sugiere que probablemente las cadenas de
anticuerpo surgieron durante la evolución gracias a una serie de duplicaciones génicas,
empezando por un gen primordial que codificaba un único dominio de 110aas de función
desconocida.
Esta hipótesis se ve favorecida por el hecho de que cada dominio de la región constante de una
cadena pesada y también la región bisagra está codificado por una secuencia codificante aislada
(exón) separadas por secuencias no-codificantes (intrón).
Se cree que la presencia de intrones puede haber facilitado las duplicaciones accidentales de
segmentos de DNA, que en el transcurso de la evolución, han dado lugar a los genes de los
anticuerpos.
ORGANIZACIÓN DE LAS SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN LA

REGIÓN CONSTANTE DE LAS CADENAS PESADAS DE LAS IgG
Estamos en el terminal CHO. Nos podemos encontrar que el primer CH1 constantes, dominio
CH2 y CH3. Delante la región variable. Se transcribe todo el DNA, es decir, tanto los intrones
como los exones. El RNA primario tiene intrones y exones. Se necesita una elaboración gracias
al splicing de corte y empalme, ese proceso se eliminan los intrones.
65
Tras la maduración del RNA nos queda solo el RNA maduro sin intrones. Tras la traducción
conseguimos la región constante de la cadena pesada. La parte anterior es la región variable, a
nivel de gen es más grande que incluiría el gen de la zona variable. Es decir, hablamos de genes
que incluyen la parte variable y constante aunque tienen entidad para transcribirse de forma
independiente.
GENERACIÓN DE LA DIVERSIDAD DE LOS ANTICUERPOS
El ser humano puede producir > 10 12 moléculas diferentes de anticuerpos en una situación
preinmune en ausencia de estimulación por antígenos.
Como los anticuerpos son proteínas y éstas codificadas por genes ¿Cómo puede el hombre
producir más anticuerpos que genes hay en su genoma?.
Un acercamiento a esto sería decir que debido a que las regiones variables de las cadenas ligeras
y pesadas de los anticuerpos se combinan formando el lugar de unión al antigeno, un animal que
tuviera 1000 genes que codifiquen cadenas ligeras y 1000 genes que codifiquen pesadas podría
combinar sus productos de 1000 x 1000 maneras diferentes formando 10 6 lugares de unión al
antígeno distintos.
Pero el hecho es que hay mecanismos genéticos únicos que dan esa diversidad y que veremos a
continuación:
MECANISMOS GENÉTICOS DE CREACIÓN DE ANTICUERPOS
En ratones y humanos, engloban dos etapas:
1) Antes de la estimulación por un antígeno, los linfocitos B en desarrollo unen segmentos

génicos separados en el DNA, generando los genes que codifican el repertorio primario
de anticuerpos de baja afinidad: IgM e IgD.
2) Tras la estimulación por un antígeno, dichos genes pueden sufrir dos cambios
adicionales: mutaciones que aumentan la afinidad del lugar de unión al antígeno y
reordenaciones del DNA que cambian la clase de anticuerpo fabricada, originándose así
el repertorio secundario de anticuerpos IgG, IgA e IgE de alta afinidad.
Vamos a empezar con el repertorio primario que implica ensamblaje de segmentos génicos…
ENSAMBLAJE Y REORDENACIÓN DE SEGMENTOS GÉNICOS
Cada tipo de cadena pesada y ligera esta codificado por un locus diferente situado en un
cromosoma diferente.
Cada locus contiene un gran número de segmentos génicos codifícantes de la región V de la

cadena del anticuerpo, y uno o más segmentos génicos codificantes de la región C.
Durante el desarrollo de un linfocito B en la medula ósea (o en el hígado fetal) se ensambla una

secuencia codificante completa para cada una de las dos cadenas de anticuerpo, mediante
recombinación genética especifica de lugar.
Estas reordenaciones, además de reunir los segmentos génicos individuales del gen que codifica
un anticuerpo, también activan la transcripción a partir del promotor del gen, mediante cambios
en las posiciones relativas de las secuencias activadoras y silenciadoras que actúan sobre el gen.
66
Por tanto, una cadena completa de anticuerpo solo se puede sintetizar después de que se
produzca una reordenación del DNA.
Reordenación VJC en la producción de una cadena ligera k humana
Se ha observado que en una cadena ligera tenemos unos segmentos en la zona variable que son
los V (1-40) que engloba todo el dominio variable. Todos esos segmentos están formados por
zonas exónicas e intrónicas. En una cadena ligera nos encontramos segmentos de la zona
bisagra que son los segmentos J (1-5) y en una cadena ligera tenemos un dominio C constante
solo que puede tener más de un segmento.
Sobre los segmentos génicos, es donde tiene la recombinación génica específica de sitio. Hay un
reordenamiento del DNA durante el desarrollo de los linfocitos B.
Tenemos una reordenación previa y nos quedamos con V1, V2 y V3, tres zonas J: J3, J4 y J5; y
nos quedamos con la zona constante. Seguimos teniendo exones e intrones. Se produce una
transcripción especial con la creación de un transcrito primeria con solo la V3, J3, J4, J5 y C. Se
produce un splicing y se obtiene un mensajero sin intrones que solo tiene J3, V3 y C3 y ya
después por traducción se forma la inmunoglobulina de tipo cadena ligera.
REORDENACIÓN DE SEGMENTOS DE UNA CADENA PESADA HUMANA
Los mecanismos genéticos de producción de una cadena pesada son similares a los vistos para
una ligera. Pero aquí se necesitan además dos etapas de reordenación del DNA en lugar de una.
Inicialmente tenemos 40 segmentos V, 25 D (este segmento y parte del J, codifican la parte más
variable de la región V), 6 y un grupo de secuencias codificantes de la región C.
Cada uno de las reordenaciones posibles codifica una clase diferente de cadenas pesadas.
En cuanto a las dos etapas:
1) Un segmento D se une a un segmento J por reordenación genética específica de sitio.
2) Un segmento V se une a los segmentos DJ reordenados previamente teniendo lugar más

reordenación genética.
CÁLCULOS DE LA RECOMBINACIÓN V(D)J PARA LAS REGIONES

VARIABLES V
En una cadena ligera: cualquiera de los 40 segmentos V se pueden unir a los 5 segmentos J, de
forma que dicho locus puede codificar al menos 40x5=200 regiones variables V diferentes de
cadena ligera.
En una cadena pesada: cualquiera de los 40 segmentos V se pueden unir a cualquiera de los 25
segmentos D y a cualquiera de los 6 segmentos J, pudiendo codificar como mínimo
40x25x6=6000 regiones V diferentes de cadena pesada.
Se estima que un humano podría producir 320 regiones V, ligeras diferentes (200 k (kappa) y
120 lambda) y 6000 regiones VH pesadas diferentes. Estas regiones podrían luego combinarse
entre sí produciendo 320 x6000=1,9x10^6 lugares diferentes de unión al antígeno.
67
LAS PROTEÍNAS RAG1 Y PAG2
Las uniones que tienen lugar entre segmentos génicos durante la recombinación VDJ, tiene en
cuenta las señales de recombinación que hay entre los segmentos y están mediadas por un
complejo enzimático denominado recombinasa VDJ del que forman parte dos proteínas
específicas de los linfocitos en desarrollo (Rag 1 y Rag2) así como enzimas reparadoras del
DNA dañado.
Las proteínas Rag 1 y Rag2 están codificadas por los genes del mismo nombre (RAG1 y
RAG2): recombinación activating gene).
Para llevarlo a cabo la recombinación VDJ, las dos proteínas se asocian entre sí, forma ndo el
complejo RAG que actúa como una endonucleasa introduciendo discontinuidades en la doble
cadena entre los segmentos génicos que deben unirse y sus secuencias de recombinación
flanqueantes.
A continuación. RAG inicia el proceso de unión y recluta enzimas de reparación que unen
extremos no homologos del DNA de doble cadena. A veces se pierde un numero variable de
nucleótidos de los extremos de los segmentos a recombinar. Esto aumenta la diversificación de
la unión y el peligro de no funcionalidad.
Las secuencias señal de recombinación son reconocidas por el complejo enzimático

denominado recombinasa VDJ.
Junto al segmento V tenemos una reordenación entre V1 y J1, entre ellos deben existir unas
secuencias donde se apoyan las Rag. SE ha visto que tienen un mensaje cuantitativo: primero 7
pb, 23pb y 9pb. Esto es un mensaje cercano a V1. La región J1 a su vez es algo diferente donde
en la zona más anterior tiene una secuencia señal: 9pb, 12pb y 7pb.
Las proteínas Rag son capaces de unirse a esas secuencias de señal: una a la parte de V1 y otra a
la parte de J1. Se ha visto que tras esto hay un apareamiento de las proteínas Rag para llevar a
cabo la reordenación. A continuación el complejo Rag tiene capacidad endonucleasa y corta las
secuencias señales y nos quedan las secuencias V1 y J1. También actúan como enzimas
reparadoras y nos encontramos que también actúa como enzimas que unen los extremos no
homologos y así se reordenada V1 con J1.
SÍNDROME DE INMUNODEFICIENCIA COMBINADA GRAVE (SCID)
Los humanos deficientes en alguno de los dos genes RAG o en los de enzimas de reparación de
extremos no homologos, son muy susceptibles a las infecciones ya que son incapaces de realizar
la recombinación VDJ.
A esta patología se le denomina (inmunodeficiencia combinada grave (SCID: severe combinaed

inmunodeficiency) ya que no disponen de linfocitos B funcionales.
PRINCIPALES MECANISMOS IMPLICADOS EN LA DIVERSIFICACIÓN DE

LOS ANTICUERPOS
Unión aleatoria de segmentos génicosdiversificación en la unión de segmentos

génicosunión aleatoria de las cadenas H y L todo esto en el desarrollo de los linfocitos B
Hipermutación somática más recombinación de clasedespués de unirse con el antígeno.
68
TEMA 17: MECANISMO DE CONTROL

DEL CICLO CELULAR POR LOS
SISTEMAS DE RECONOCIMIENTO
DEL DAÑO DEL DNA
¿QUÉ SUCEDE CUANDO EL DAÑO EN EL DNA ES TAN GRAVE QUE NO SE
PUEDE REPARAR?
La respuesta varía en función del organismo.
Los organismos unicelulares detienen de forma transitoria su ciclo celular e intentan reparar el
daño. Aunque no pueden repararlo todo, el ciclo celular se reanuda porque para ellos
aparentemente la vida con mutaciones, es mejor que no vivir.
En los organismos pluricelulares sin embargo, la salud del organismo tiene preferencias sobre la
vida de una célula. Así las células con graves daños en el DNA no intentan dividirse, sino que
se autoeliminan induciendo su muerte o apoptosis.
El control está: al comienzo de la fase S y en el punto de entrada a la mitosis.
EL DAÑO EN EL DNA DETIENE EL CICLO CELULAR INACTIVANDO LOS

COMPLEJOS Cdk-G1 y Cdk-S
Cuando el DNA resulta muy dañado, varias proteínas quinasas son reclutadas en el lugar del
daño e inician una vía de señalización que provoca la detención del ciclo celular.
Las primeras quinasas que se localizan en el lugar del daño son ATM (proteína mutada de ataxia
telangiectasia) o ATR (proteína relacionada con la ataxia telangiectasia).
A continuación se reclutan y se activan por fosforilación de las anteriores, las proteínas quinasas
adicionales: Cjk1 y Chk2 dando lugar a la fosforilación de
la proteína reguladora de genes p53.
Normalmente la ubiquitina ligasa Mdm2 se une a p53 e

induce su ubiquitinización y su posterior degradación en
los proteosomas. Por ello p53 está normalmente a muy
baja concentración.
Pero la fosforilación de p53 bloquea su unión a Mdm2 y

entonces p53 se acumulan en grandes cantidades y se
estimula la transcripción del gen que codifica la proteína
inhibidora Ck1 (p21).Esta proteína p21 se une e inactiva a
los complejos Cdk-G1/S y Cdk-S deteniendo a la célula en
G1.
69
Tenemos el DNA dañado. La primera acción es la activación de las quinasas ATM y ATR y
después las quinasas Chk1 y Chk2 que a su vez estas tienen otro mecanismo que controlan los
complejos de ciclinas no a nivel en el desarrollo de S sino en el desarrollo de la entrada en M.
La fosforilación de p53 y se activa y actúa como un anticancerígeno. Normalmente está
combinado con la ubiquitina Mdm2. La ubiquitina da lugar a un proceso de degradación.
Cuando el p53 se fosforila expulsa a la ubiquitina Mdm2, el p53 activo actúa sobre el promotor
de la proteína de p21 estimulando su producción y se obtiene el p21 que se une a los complejos
Cdk y los inactiva.
EL SÍNDROME DE LA ATAXIA TELANGIECTASIA (AT)
Es un defecto en el gen que codifica la proteína ATM produciendo su deficiencia.
ATM es una de las proteínas quínasas que se activa en respuesta al daño en el DNA inducido
por diferentes radiaciones.
Los enfermos que padecen esta enfermedad son muy sensibles a los rayos X y cursan con
neurodegeneración, predisposición al cáncer e inestabilidad del genoma por falta de reparación
del DNA.
LAS PROTEÍNAS QUINASA CHK1 Y CJK2 TAMBIÉN PUEDEN ACTUAR

POR OTRO MECANISMO:
Fosforilar miembros de la familia de proteínas fosfatasas Cdc25, inhibiendo así su función

activadora del complejo CdkM al comienzo de la mitosis.
Este mecanismo de la Cdc25 lo vimos en el tema 9.
Ahora decimos que el daño en el DNA puede producir la inhibición de la actividad activadora
de la Cdc25 impidiendo la entrada en mitosis.
ULTIMAS CONSIDERACIONES
La función de detención del ciclo celular por p53 es un hecho fundamental de protección contra
el cáncer.
Si la respuesta de la célula al daño del DNA no funciona, este se acumula y lleva a un aumento
de la frecuencia de mutaciones y este cáncer.
Por lo menos en la mitad de todos los cánceres humanos se han identificado mutaciones en el
gen p53.
Por lo tanto, a menos que el daño en el DNA sea reparado, la respuesta al daño puede conducir a
la detención del ciclo celular y a la muerte celular.
70
TEMA 18: TRANSCRIPCIÓN DEL DNA
La hebra no tiene que transcribirse entera, solo ciertos genes, más o menos separados que se
necesitan en el momento. Por ejemplo si es necesario mucha proteína se transcribe mucho gen
que la codifica. Puede que también el gen se transcriba mucho menos porque solo necesitamos
una copia. En la transcripción no se necesita cebador. La primera base 5’ suele ser pppG ó
pppA.
El preRNA transcrito primario se madura en un proceso de tres fases en los mensajeros mientras
que los ribosómicos y de transferencia el proceso es más sencillo. El preRNA es una sola hebra
con enlaces fosfodiéster y 4 bases (A, C, G, U). La pentosa son ribosas completas (con OH en
2’). El preRNA tiene una estructura longitudinal única en la que se establecen puentes de
hidrógeno entre bases (por ejemplo entre A y U). va a presentar una estructura terciaria pero
forzada.
Los mensajeros suelen ser muy lineales (estructura lineal) mientras que los ribosómicos o de
transferencia tienen estructura secundaria. Al igual que en el DNA las bases que se unen deben
ser una anti y otra sin
71
*Son estructuras subnucleares que participan en el ensamblaje y reciclaje: nucléolo, cuerpo de

cajal, agregados de gránulos intercromatínicos.
Polimerasa de RNA: polimerizan añaden nucleótidos por enlace fosfodiéster formando nuevos
RNA.
La RNA polimerasa I es únicamente para ribosómicos. No sintetiza la 5S.
La RNA polimerasa II: posiblemente la más importante.
Las RNA polimerasas

- Son estructuralmente entre si y comparten subunidades comunes (incluso con la
bacteriana)
- Necesitan a los factores generales de transcripción para funcionar.
72
- Deben superar el empaquetamiento del DNA en nucleosomas.

- No necesitan cebador
- La transcripción es menos exacta que la replicación: 1 error cada 104 nucleotidos
incorporados al RNA. En la replicación es de aproximadamente 1 error cada 30
millones de nucleótidos.
La información del RNA no se almacena de forma permanente (horas incluso solo minutos) por
eso es de menor gravedad que nos equivoquemos. La RNA polimerasa tiene una cierta
información correctora, si se equivoca puede retroceder y su centro activo lleva acabo una
reacción de escisión del nucleótido equivocado
En eucariota la unidad de transcripción es un gen que codifica un único RNA. La RNA

polimerasa tiene también en su centro activo la actividad helicasa, que separa las dos cadenas de
DNA. Posee un canal de salida del transcrito primario. Las hebras se vuelven a unir y se
recupera la doble de DNA. Hay también una vía de entrada de nucleótidos.
La velocidad de transcripción en humanos (eucariotas) es de 20 nucleótidos por segundo. La

velocidad de replicación en humanos es de 50 nucleótidos por segundo y por horquilla de
replicación.
PROTOTIPO DEL PROMOTOR EUCARIOTA: LAS SECUENCIAS ESTÁN EN CIS Y LOS

FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN EN TRANS
Se encuentra delante del inicio del gen que se va a transcribir. Sus secuencias pueden estar en
las dos cadenas. El promotor está formada por varias secuencias:
La secuencia señal de inicio (INR) (zona +1) que puede ser distinto en las diferentes especies. A
la izquierda de esta secuencia (decir a la izquierda es lo mismo que decir “aguas arriba”)
podemos encontrar la secuencia TATA (-30), que no tiene que estar siempre. Esta caja TATA
ayuda al promotor a ser reconocida por la polimerasa (los promotores sin TATA suelen tener
una INR fuerte). También “aguas arriba” encontramos la secuencia BRE (-35)
“Aguas abajo”, a la derecha, encontramos la secuencia DPE (+30) pero es más rara.
73
Existen una serie de factores generales de la transcripción que tienen que reconocer las
secuencias de la zona promotora para que la RNA polimerasa II cree mensajeros.
 Reconoce BRE
 Es un subfactor de TFD (TFIID). Reconoce la caja TATA
 Es el primero que entra, reconoce INR
 Puede reconocer también DPE
TFIIH: permite que la RNA polimerasa acabe su acción.
TFIIF, TFIIE y TFIIH actúan una vez se han reconocido las secuencias principales TATA y
BRE.
INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN DE UN GEN EUCARIOTA POR PARTE DE LA RNA

POL II
Empezamos en el inicio de la transcripción y la caja TATA. El TBP se sitúa sobre la hebra que
va a ser replicada y facilita la entrada de TFIIB. Ambas se unen al centro promotor permitiendo
74
la unión de RNA polimerasa II. Esta RNA polimerasa II tiene una

secuencia CTD (cola) que contiene 52 repeticiones en tándem de
secuencias de 7 aa con 2 serinas en cada repetición. Será el lugar
donde se formará la caperuza. Se une la RNA polimerasa a la
hebra. Entran TFIIE y TFIIH. La TFIIH tiene actividad helicasa y
lleva a cabo la fosforilación CTD (la serina 5 es la más
fosforilada). Se produce la separación de la mayoría de los
factores generales de la transcripción.
PROMOTOR DEL GEN DEL RECEPTOR DE

INSULINA HUMANO. FACTORES DE
TRANSCRIPCIÓN (ACTIVADORES Y
REPRESORES)
El SP1 es una proteína que llega en trans. C/EBP tiene funciones

de caracterizar determinados tejidos. NF-1. IRNF. HTFIR. LF A1.
GR. AP-2. ER.
Algunos que son elementos que se unen a secuencias que son

elementos que responden a hormonas. Los receptores de estas
hormonas funcionan como factores de transcripción. El GR es el receptor del grupo corticoides.
Es un promotor que controla la expresión de esos genes. Esos genes son sensibles a la acción de
glucocorticoides. MIR es el receptor de mineralocorticoides. Los glucocorticoides como los
minerolocorticoides son esteroides y son factores de transcripción importantes. El MR se une en
zonas cercanas de GR. VDR es de la vitamina D. Existe en el reconocimiento de los receptores
hormonales en las secuencias de DNA.
La caja TATA. Este promotor no tiene caja TATA. La secuencia de inicio de la transcripción
sería más potente. A ese nivel reconoce un determinado triplete, cuando no hay caja TATA la
polimerasa reconoce y se engancha mejor a la secuencia de inicio.
OTROS AGENTES PARA EL COMIENZO DE LA TRANSCRIPCIÓN
Sabemos que el DNA de las células eucariotas está empaquetado en nucleosomas, que a su vez,
están organizados en estructuras de cromatina de orden superior.
Por ello, para que tenga lugar el inicio de la transcripción se requiere el reclutamiento de otras
muchas proteínas que veremos en temas posteriores como:
- Los activadores/inhibidores transcripcionales que tras su unión a sus secuencias

específicas, conducen a la RNA polimerasa II hacia el punto de inicio de la
transcripción.
- El mediador que permite que las proteínas activadoras se comuniquen correctamente

con la RNA pol II y con los factores generales de transcripción.
- Las enzimas modificadoras de la cromatina que incluyen complejos remodeladores

de la cromatina y enzimas que modifican las histonas.
Se les podría considerar como agentes epigenéticos.
75
SE NECESITAN MÁS PROTEÍNAS PARA EL INICIO DE LA

TRANSCRIPCIÓN
Los genes están en el DNA, pero los agentes epigenéticos controlan su expresión. La RNA
polimerasa con todos los factores de transcripción necesarios. Tenemos que en la zona
promotora que actúan los factores activadores o inhibidores. El mediador que informa.
Tenemos los elementos remodeladores que actúan sobre el DNA.
76
TEMA 19: MODIFICACIONES POST-

TRANSCRIPCIONALES DE LOS
TRANSCRITOS PRIMARIOS DE LOS
RNAm
MODIFICACIONES PRINCIPALES DE UN PRE-MRNA (TRANSCRITO
PRIMARIO) EUCARIOTA
En un transcrito primario se han transcrito tanto los exones como los intrones.
El proceso siguiente es la maduración del transcrito primario y en el que participan tres

mecanismos:
- Formación de una caperuza o “cap” en extremo 5`.
- Eliminación de los intrones por “corte y empalme” o “splicing”.
- Formación de una cola poli-A (poliadenilación) al extremo 3`.
Estos mecanismos de maduración están en relación con la fosforilación de la cola (CTD: C-

terminal domain) de la RNA Pol II en las Ser5 de las repeticiones en tanden de 7aas. Esta
fosforilación es gradual a medida que se desplaza a lo largo del DNA que se transcribe y
permite que se asocien una nueva serie de proteínas a las Ser2 de esas repeticiones de la cola.
Posteriormente esas proteínas van a ser transferidas para participar en la formación de la cap 5’,
en la maduración de ese transcrito primario y en la poliadenilación de la cola 3’.
RNA POL II CREANDO UN TRANSCRITO PRIMARIO mRNA
La CTD contiene 52 repeticiones en tándem de secuencias de 7aas con dos Ser en cada
repetición.
77
FORMACIÓN DEL CAP EN EL EXTREMO 5`DEL PRE-mRNA
Tiene lugar cuando la RNA pol II ha transcrito ~ 25 nucleótidos y ha emergido de ella el

extremo 5’.
A la cola fosforilada de la RNA pol II en la posición de la Ser5 (hecho llevado a cabo por el
factor TFIIH) se unen tres enzimas que van siendo transferidas al mRNA naciente en el
momento adecuado:
- 1.- una enzima fosfatasa que elimina un grupo fosfato del extremo 5’ del RNA naciente.
- 2.-una guanil transferasa que añade un GMP mediante un enlace poco común 5’-5’ en vez
de 5’-3’ habitual.
- 3.- una metil transferasa que añade un grupo metilo a la guanosina.
Si el mRNA no presenta la cap en 5èstá desprotegido y es degradado por una

5`3èxonucleasa que es también transportada por la cola de la RNA Pol II.
La cap se une a un complejo proteico (CBC: cap binding complex) que ayuda al mRNA a ser
procesado correctamente y exportado al citosol.
La cap 5’ metilada tiene también un importante papel en la traducción de los mRNA maduros en
el cítosol como ya veremos.
REACCIONES PARA LA FORMACIÓN DEL CAP EN 5`
Tenemos un transcripto naciente. Es una terminación ortodoxo de cualquier RNAm. Primero

actúa la fosfatasa que elimina el Pi externo, después actúa la guanil transferasa que introduce el
GTP en el extremo 5`. Tenemos una metil transferasa que añade una CH3 a la guanina.
En algunas especies, se podría añadir otro metilo en la base inicial del mRNA.
ELMININACIÓN DE LOS INTRONES O SPLICING
SECUENCIAS CONSENSO DE NUCLEÓTIDOS DE RNA QUE INDICAN EL

INICIO Y EL FINALD E LA MAYORÍA DE LOS INTRONES EN HUMANOS
Los exones e intrones se reconocen porque se sabe que todo exón acaba en AG y empieza
generalmente en G. Se sabe que los intrones tienen tres tipos de secuencias:
- La posición 5`: GURAGU (R: purinas; Y:pirimidinas)
- Extremos 3`: GACNYYYYYYYYY
- Secuencia intermedia: YURAC.
El reconocimiento es fundamental para la eliminación de los intrones por splicing. Cuando se

elimina, los dos exones se unen. Mientras los exones tienen un tamaño pequeño de 150
nucleótidos aproximadamente, el de los intrones es enorme de unos 10-1000000nucleótidos.
78
MOLÉCULAS ESPECIALIZADAS DE RNA RECONOCEN LAS SECUENCIAS

DE NUCLEÓTIDOS PARA EL SPLICING
Son los RNA nucleares pequeños snRNA ricos en U y con un tamaño relativamente pequeño ~
200 nucleótidos.
Para el splicing principal 5 tipos: U1, U2, y el U4/U6*U5 en formato triple. Hay un segundo
splicing en el que no entramos.
Cada uno de estos snRNA, forma un complejo con al menos siete subunidades proteicas
(Complejos de ribonucleoproteínas snRNP: small nuclear ribonucleoprotein).
Los complejos snRNP se denominan con el nombre del snRNA unido al complejo de proteínas.
Por Ej: U1snRNP.
Los complejos snRNP constituyen el núcleo del espliceosoma que lleva a cabo el splicing.
Se ha observado que los snRNA pueden actuar solo como ribozimas (palabra de la contracción
de ácido ribonucleico y enzima). Altman y Cech (PN de química 1989) por el descubrimiento
de los ribozimas.
Estos ribozimas llevan a cabo reacciones de trans-esterificación.
El espliceosoma utiliza hidrólisis de ATP para provocar reordenamientos RNA-RNA.
La G del extremo 5`-OH del intrón se une a través de su grupo fosfato al 2`de la ribosa de la A
del mismo intrón generando un lazo.
79
El extremo 3`-OH libre del exón 1

reacciona con el inicio del exón 2
uniéndose.
ETAPAS PRINCIPALES DEL PROCESO DE FORMACIÓN DE LA COLA

POLI A EN 3`
Las señales de finalización son transcritas a RNA cuando la RNA pol II
pasa sobre ellas y entonces son reconocidas como RNA por una serie de
proteínas de unión al RNA y enzimas procesadoras del RNA.
En el proceso de reconocimiento participan dos complejos:
- el CstF o factor F (cleavaje stimulation factor F) que reconoce
AAUAAA
- y el CPSF (cleavaje and polyadenylation specify factor) que
reconoce al elemento rico en GU.
Ambos complejos viajan en la cola de la RNA pol II y son transferidos
al extremo 3’ de la molécula de RNA cuando este RNA emerge de la
RNA pol II.
A la secuencia CA intermedia se le une un tercer factor (endonucleasa
específica) necesario para el corte. Después una poli-A polimerasa
(PAP) va añadiendo uno por uno nucleótidos de A sin necesitar molde.
Por tanto esta cola no está directamente codificada por el genoma.
En el alargamiento de la cola se necesita ATP y se forman enlaces 5’-3’.
Se unen proteínas de unión al poli-A que por mecanismos poco
conocidos determinan la longitud final de la cola.
Algunas de estas proteínas permanecen unidas a la cola cuando el
mRNA viaja al citoplasma y parece que contribuyen a la síntesis de la
proteína en los ribosomas.
80
Dicha cola actúa como regulador de la vida meda de estos mensajeros, cuanta más larga es la
cola, más larga es la vida del mensajero (horas).
MADURACIÓN DE LOS PRE-RNA EUCARIOTAS EN EL NÚCLEO Y SU

EXPORTACIÓN AL CITOPLASMA:
Cuando el RNA posee los tres elementos que hemos visto en este tema puede ser exportado al
citoplasma para poder ser traducido con su mensaje monocistrónico para dar una determina
proteína.
Los RNA maduros en el núcleo son transmisores del mensaje genético del DNA. Son los menos
abundantes (3-5%) del total de los RNA de una célula. Su vida media es muy corta 8horas), su
formato es lineal y lleva un mensaje monocistrónico. Su tamaño varía mucho en función de la
proteína que se traduce de él.
81
TEMA 20: TRANSCRIPCION DE

GENES DE TIPO I Y III.
MODIFICACIONES POST-
TRANSCRIPCIONALES
LOS PRODUCTOS DE LA TRANSCRIPCIÓN DE LA RNAPOL I
Los principales son los rRNA. Estos constituyen la parte más abundante (80%) de los RNA de
una célula y constituyen el componente esencial de los ribosomas.
Estructuralmente, la RNA pol I es bastante similar a la pol II ya comentada, pero carece de cola
(CTD) con lo que en parte se explica que los transcritos de esta RNA pol I carezcan de cap 5ý
de cola poli-A.
Los RNAs sin esos atributos son no codificadores mientras los que lo poseen son mRNA
codificadores.
Esto ayuda a la célula a distinguir estor rRNA como productos génicos finales.
Los eucariotas tenemos 4 tipos de mRNA y en los ribosomas hay una copia de cada uno de
ellos. Tres (28S, 18S, 5.8S) se obtienen mediante modificación química y escisión de un único
RRNA precursor. El cuarto rRNA de 5S, es el más pequeño y se sintetiza a partir de un grupo
diferente de genes y de una diferente polimerasa la RNA pol III, y no requiere ninguna
modificación química.
Entre las modificaciones están
o 100 metilaciones en los 2’ OH de las ribosas de los nucleótidos

o 100 isomerizaciones de pasi U -> Pseudo U
LOS GENES DE rRNA EN LOS CROMOSOMAS HUMANOS

Una célula de mamífero debe sintetizar en cada ciclo celular
aproximadamente 10 millones de copias de cada tipo de rRNA
para fabricar unos 10 millones de ribosomas. Solo se puede
hacer esto porque la célula contiene muchas copias de los genes
de rRNA.
Las células humanas contienen aproximadamente 200 copias de

cada gen de rRNA por genoma haploide, distribuidas por grupos
en cinco cromosomas diferentes 13, 14, 15, 21 y 22.
Las protuberancias rojas en los cromosomas indican la posición de los genes que codifican los
rRNA. Estos patrones se han obtenido mediante tinción de los cromosomas con la solución
Giemsa y pueden observarse con el microscopio óptico.
82
La RNA pol I da lugar a un

rRNA precursor de 45S.
Está demostrado que los tres
proceden de un precursor común de
45S, que contiene unos 13.000
nucleótidos.
Posteriormente modificaciones
químicas y roturas producidas sobre
la estructura de los nucleótidos que
forman parte de ese RNA ribosómico
inicial. Regiones de rotura entre
medias.
MODIFICACIONES QUÍMICAS
Metilación a nivel del azúcar. Introducciones de metilos en la posición 2´ de la ribosa. Se han
observado alrededor de 100 nucleotidos metilados.
Pseudouridina. Es una modificación del uracilo. La

ribosa, en lugar de situarse en la posición 1 del uracilo por
un enlace beta-glucosídico, está en la posición 5.
Alteración considerable y todavía no muy bien conocida.
Hay más de 100 modificaciones en ese precursor que en
lugar de uracilos son pseudouracilos.
No se conoce el porqué de tantas alteraciones. Lo que se empieza a conocer es que esas

modificaciones son producidas en parte por unas proteínas y en parte por unos complejos de
snoRNA (RNAs pequeños de tipo nucleolar). Para que se den estas alteraciones, sobre todo la
segunda mencionada, se necesita una serie de formación de complejos que parten de los
snoRNA, y dentro de ellos unos que se llaman RNA guías.
Todo ellos son mecanismos que están en estudios. Los RNA guía son miembros de los RNA
nucleoares pequeños (snoRNA). Los snRNA están unidos a
proteínas formando complejos snoRNP y contienen tanto las
secuencias guía como las enzimas modificadoras de rRNA, y
las que provocan la escisión del precursor hacia los tres
ribosomas maduros.
A continuación actúan una serie de enzimas que están relacionadas en parte con actividades de
la RNA pol I. Rompen el RNA y se obtienen los diferentes rRNA. El de 18S es el típico de la
subunidad pequeña, y el 28S, el 5.8S y el 5S conforman la subunidad grande.
83
El nucleolo:
El nucleolo es el lugar donde se procesan los rRNA y donde se ensamblan, formando las
subunidades de los ribosomas. El nucleolo no tiene membrana, sino que consiste en una gran
agregado de macromoléculas incluyendo:
-los genes rRNA
-el rRNA precursor
-los rRNA maduros (3 tipos)
-las enzimas procesadoras del rRNA
-los snoRNP
-las proteínas de los ribosomas
-algunos ribosomas parcialmente ensamblados.
El tamaño del nucleolo refleja el número de ribosomas que está fabricando la célula. En el
nucleolo se fabrica también otros RNA y se ensamblan complejos RNA-proteína: como el
U6snRNP, el de la telomerasa, etc.
PAPEL DEL NÚCLEO/NUCLEOLO EN EL CICLO CELULAR:
Los genes rRNA también desempeñan un papel mportante e la formación del nucloelo.
- Durante la interfase, los cromosomas que tienen estos genes contribuye a las asas del
DNA del nucléolo.
- En M, cuando los cromosomas se condensan, el nucléolo desaparece.
- En la telofase, cuando los cromosomas recuperan su estad semidisperso, los extremos
de los cromosomas se reúnen (“coalescen”) y se vuelve a formar el nucléolo.
Para que tenga lugar este proceso es necesaria la transcripción de los genes rRNA mediante la
RNA polimerasa I.
Hay una relación entre el núcleo y el nucleolo, de tal manera que el núcleo transmite la
información del DNA y el nucleolo la usa para crear los ribosomas y el RNA.
FUNCIÓN DEL NUCLEOLO EN LA SÍNTESIS DE 5, 8, 18 Y 28S rRNA Y DE

LAS SUBUNIDADES DEL RIBOSOMA
El RNAr de 5S se sintetiza en el núcleo y pasa al núcleo y pasa a la formación de las
subunidades de los ribosomas. El RNAr llevará el de 18S y la mayor un RNA 28, 5,8 y el de 5S
para que en el citoplasma formen los ribosomas.
LOS GENES DE TRNA EN LOS CORMOSOMAS HUMANOS
Los humanos tenemos alrededor de 500 genes de tRNA repartidos por nuestrp genoma.
Son genes de muchas copias repetidas, como los de los RNAs, pero en lugar de estar como ellos
en tanden y activarse a la vez, estos no están en tanden sino con espaciadores.
Son genes no codificadores de proteínas, también como los rRNA y su producto final es tRNA.
En humanos, se han detectado 48tRNA con anticodones diferentes para transportar los 20 aas en
la síntesis de proteínas.
TRANSCRIPCIÓN Y MADURACIÓN DE LOS tRNAs
El producto principal de la RNA pol III son los tRNAs que representan aproximadamente el
15% del total de los RNAs y su función es transportar los aas para la síntesis proteica.
84
Son sintetizados en el núcleo en forma de precursores más grandes que van siendo recortados
hasta fabricar los tRNA maduros que tienen 80 nucleótidos de longitud.
Algunos precursores de tRNA contienen intrones que deben ser eliminados. Este proceso de
maduración es distinto al splicing de los mRNA porque está catalizado únicamente por
proteínas y requiere que el tRNA precursor esté plegado en el formato de hoja de trébol, ya que
si está mal plegado no puede ser procesado correctamente. Así que la maduración actúa como
un control de la calidad de la transcripción.
Los tRNAs presentan también varios puentes de hidrógeno intracatenarios (A-U y G-C) dando
lugar a regiones de doble cadena que facilitan el formato de hoja de trébol.
Además todos los tRNA se modifican químicamente aproximadamente 1 de cada 10

nucleótidos. Se han descrito aproximadamente 50 modificaciones diferentes.
NULEÓTIDOS RAROS EN LOS RNAs
La pseudouridina. La inosina le falta un NH2 en la posición 2 para ser G.
MODIFICACIONES DE UN TRANSCRITO PRIMARIO DE tRNA
Tienen forma de hoja de trébol que es necesario para la maduración de los tRNAs. Participan en
la maduración proteínas enzimáticas como: suelen tener un extremo 5`más largo el transcrito
primario y se corta por una RNAsa corriente de especificidad baja. Todos los tRNA tienen en el
extremo 3`CCA. Cuando son transcritos tienen otras secuencias y una enzima ARNasa que
corta también en el extremo 3`.
En una segunda fase, se producen los cortes en los extremos, de forma que el extremo 5`se
queda corta y muchas veces una C. se añade en el extremo 3èl CCA. Mientras tanto se alteran
químicamente bases. En el anticodon. Se produce por último el splicing solo por rppteínas
enzimáticas, suele ser una endonucleasa de maduración poco específica y luego una ligasa de
tRNA.
Una endonucleasa de maduración de 4 subunidades eliminando un intrón. Todos los tRNAs

terminan en CCA en el extremo 3` y no es la zona que da la especificidad.
85
TEMA 21: TRANSCRIPCIÓN

MITOCONDRIAL. AGENTES
INHIBIDORES DE LA
TRANSCRIPCIÓN
TRANSCRIPCIÓN DEL mtDNA HUMANO
La RNA pol mitocondrial es monomérica y se ayuda de un factor de transcripción (mtTFA).
Hay tres lugares de iniciación: 2 para la hebra pesada (H1 y H2) y 1 para la ligera L,
produciéndose 3 transcritos primarios diferentes, dos de ellos complementarios y
correspondientes a toda la longitud del mtDNA: 16, 5Kb.
Hay 3 promotores que están en la región no codificantes (ASA D). aún se desconoce si el inicio
en H1 y H2 depende de un mismo promotor o de dos independientes.
A partir del primer lugar de iniciación de la hebra pesada (H1) se transcribe el DNA que
codifca: el tRNAPhe, rRNA 16S, tRNA val y rRNA 23S y se detienen tras este último por la
participación de un factor transcripcional.
A partir del segundo lugar de iniciación (H2) localizado tras el tRNA Phe el transcrito primario
va más allá del anterior, completando el DNA mitocondrial.
A partir de lugar de iniciación de la hebra ligera L, se sintetiza un transcrito que solo codifica
8tRNA y 1mRNA.
MADURACIÓN DE LOS TRANSCRITOS PRIMERIOS MITOCONDRIALES
Los 3 transcritos primarios sufren maduración para dar lugar a todos los rRNA, tRNA y mRNA
de la mitocondria.
No sufren splicing, pero algunos mRNAs tienen colas en 3`pero no Cap en 5`.
El transcrito H1el tRNA Phe, rRNA 16S, tRNA Val y rRNA 23S.
El transcrito H2 RNA ”no funcional”, 12 tRNA y 8 mRNA.
El transcrito L 8tRNA, 1 mRNA, RNA “no funcional” y un pequeño RNA que actúa de
cebador en la replicación de la hebra H.
Recordemos: 2rRNAs; 22tRNAs; 13 mRNAs.
INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIÓN
La Rifampicina es un antibiótico que inhibe específicamente la iniciación de la transcripción en

procariotas, uniéndose a la subunidad beta de la RNA polimerasa procariota. Se usa como
agente bactericida frente a diversos tipos de infecciones. En parte, inhibe a la RNA pol
mitocondrial.
86
La Actinomicina D se intercala fuertemente en la doble hélice del DNA impidiendo así el

movimiento de la RNA polimerasa. También distorsiona parcialmente el DNA haciendo que no
sea reconocido por la RNA pol. Actúa tanto en procariotas como en eucariotas. Se usa mucho en
el laboratorio, pero ha resultado ser un agente terapéutico poco eficaz en algunos tipos de
cáncer.
La α-amanitina es un veneno producido por la seta Amanita phalloides que inhibe la elongación
de la transcripción por la RNA pol II en eucariotas exclusivamente. Produce intoxicación muy
grave con deterioro de la función hepática, debido a la falta de producción de nuevos mRNAs
para la síntesis continua de proteínas
La 3’ desoxiadenosina trifosfato, es un ddNTP que utilizando el mismo principio de los ddNTP

de Sanger en la replicación del DNA puede actuar también sobre la transcripción induciendo su
parada prematura en procariotas y eucariotas.
87

GENÉTICA MOLECULAR (IV)
La telomerasa evita el acortamiento de los cromosomas.
Es una ribonucleoproteína formada por:
- Una subunidad de RNA llamada TERC “TElomere RNA Component”, que proprociona
un molde 3ÀAUCCC5`(en mamíferos) para emparejar a la secuencia
5`TTAGGG3`presente en el telómero.
- Y otra subunidad que es una proteína llamada TERT “TElomere Reverse
Transcriptase”, que proporciona la actividad enzimática.
Por tanto, la telomerasa es una transcriptasa inversa especializada, que lleva su propio molde de
RNA y sintetiza DNA a partir de RNA.
Las primeras transcriptasas inversas fueron descubiertas en retrovirus.
ACCIÓN DE LA TELOMERASA
Sobre el RNA repetitivo se forma DNA.
CICLO VITAL DE UN RETROVIRUS
Las transcriptasas inversas se extrajeron de retrovirus por primera vez. Se empezado a sacar
partido y el tema de la telomerasa. Un retrovirus con su cubierta y un ácido nucleico se
introduce en la célula e introduce el RNA con Cap pero sin cola. Crea a partir del RNA una
hebra de DNA complementaria y después es capaz de eliminar el RNA porque tiene capacidad
RNAsa. Crea otra hebra de DNA así ya tenemos dos hebras de DNA. Así pues, ya es capaz de
insertarse en el DNA del hospedador para hacerlo necesita de otra enzima que tiene el retrovirus
que es la integrasa del virus.
Una vez integrado el DNA creado por la transcriptasa inversa, en el DNA de la célula
hospedadora, cuando se produce la replicación se producen copias del DNA y a partir de esas
copias se traducen a proteínas para formar las capsides y después el ensamblaje de los viriones.
TRANSCRIPTASA INVERSA DEL VIH
Tiene dos actividades. Tiene capacidad polimerizadora y crea la hebra complementaria de DNA,
pero también tiene capacidad RNAsa y después elimina el RNA de molde. Finalmente crea la
otra hebra de DNA.
Los retrovirus son virus de RNA de hebra sencilla (+) con la enzima transcriptasa inversa. Este
DNA de doble hebra se incorpora al DNA de la célula hospedadora y se replica junto con ella.
Más tarde, el DNA vírico integrado se transcribe y se traduce en proteínas víricas que se
ensamblan.
88
OBTENCIÓN DE UN DNA COMPLEMENTARIO

(cDNA)
El cDNA es el complementario a un mensajero determinado

maduro.
El mensajero es un molde para que se le una un oligo

complementario a la cola de poliA. Se añade a la
transcriptasa inversa los nucleótidos trifosfato para crear
DNA y se crea una hebra de DNA complementaria.
Tenemos un híbrido.
En laboratorio para eliminar el RNA, en realidad se añaden

una RNAsa o se trata con alkali. Al poner una concentración
determinada, podemos eliminar por corte el RNA que se
degrada con alkali. Así queda solo la hebra de DNA y se
duplica a partir de una polimerasa y se obtiene una doble
cadena de DNA.
Esta creación de cDNA es importante para el trabajo de

genética molecular en laboratorio porque es DNA
complementario al mensajero original. Este DNA no tiene
intrones porque hemos partido de un mensajero sin intrones.
Luego el cDNA solo tiene exones. Son más pequeños y manejables y son sondas que se utilizan
para todo.
En los experimentos de hibridación, realmente en vez de hablar de DNA, utilizamos sondas de

cDNA.
Se parte de un mensajero de un tejido determinado como el cerebro. Las células se lisan, se

extrae el RNA porque es muy lábil y es fácil que se corte. A partir del RNA se obtienen los
mensajeros tras purificarlos con un polímero y de esta forma solo se unen los mensajeros. A
partir del RNAm que puede ser sensible a una hormona o sustancia, entonces a partir del
mensajero se hibrida con un cebador de T, se logra añadiendo la transcriptasa inversa la hebra
complementaria de DNA, después se degrada con una RNAsa sintética y después se sintetiza
una hebra de DNA y al final obtenemos el cDNA.
VENTAJAS Y UTILIDADES DE ESTOS cDNA
Estos cDNA no poseen íntrones y aunque por ello son más pequeños que los DNA genómicos
relacionados, pero llevan toda la información codificadora de los verdaderos DNA.
Estos cDNA son por tanto muy apropiados para introducirlos como insertos en plásmidos en
lugar de fragmentos o genes de DNA genómico y utilizarlos en experimentos de clonación.
Estos cDNA son también muy apropiados para su manejo como sondas de hibridación en
experimentos de hibridación como veremos en el siguiente tema.
También para crear librerías de cDNA como vamos a ver a continuación.
89
Si se quiere transcribir o traducir usando bacterias se deben usar cDNA porque las bacterias no
poseen la maquinaria precisa de escindir los intrones por “splicing”, ni tampoco pueden llevar a
cabo modificaciones post-traduccionales.
LIBRERÍAS, BIBLIOTECAS GENÉTICAS O GENOTECAS
Una genoteca es un conjunto de fragmentos de DNA o genes completos conseguidos tras el

corte de DNA genómico o cDNA con enzimas de restricción y su posterior empaquetamiento en
vectores.
Como vector usaremos: plásmidos, virus, cósmidos y otros, con su genoma correspondiente.
Cualquiera de estos vectores se multiplicara fácilmente en bacterias y generara un gran número
de copias de esos fragmentos (Clonación).
Una genoteca puede ser:
- genómica si procede de DNA genómico, es decir el que contienen todas las células de un
mismo organismo. Por lo tanto se puede usar cualquier célula o tejido de ese organismo para
hacer esta genoteca.
- de DNA complementario (cDNA) si procede de un mRNA específico. En este caso, como

las células de cada tejido tienen sus propios mRNA específicos que determinan las proteínas
que producen, se debe usar el mRNA concreto del tejido del que se desee hacer la genoteca.
CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA DE DNA GENÓMICO

HUMANO
Se cortan con enzimas de restricción. Se insertan en plásmidos en forma de DNA

recombinante y se introducen en bacterias. Todos los fragmentos constituyen la genoteca.
BÚSQUEDA DE UN DETERMINADO FRAGMENTO DE DNA EN UNA

GENOTECA GENÓMICA
Idealmente, las bibliotecas genómicas pueden componerse de una extenso conjunto de

plásmidos con fragmentos insertados (plásmidos recombinantes) que en total expresan el
DNA genómico completo de una célula u organismo. Estos plásmidos son transfectados en
bacterias.
El conjunto de bacterias que contienen esa biblioteca se siembra en un medio de cultivo en

placa para que formen colonias.
Un papel de filtro se coloca sobre el medio de cultivo haciendo una copia o blot.
Las bacterias adheridas al filtro se lisan y los DNA de los plásmidos recombinantes tras
una desnaturalización alcalina, se analizan con una sonda de DNA específica y
complementaria al fragmento de DNA o gen que se busca.
Se usa una hibridación que veremos en el siguiente tema.
90
UTILIZACIÓN DE LA PCR PARA OBTENER UN CLON GENÓMICO O DE

cDNA
Un clon se puede obtener por clonación o por PCR. A la izquierda para obtener clon genómico.
Y a la derecha tenemos el clon de cDNA. En la izquierda, purificamos el DNA de las células y
nos interesa el DNA específico que se quiere clonar y se hace una clonación acelular por PCR.
Se separan las cadenas con una fuerza básica alta y se utilizan os cebadores por ello se tienen
que conocer los extremos. Se hace PCR y obtenemos amplificado el DNA. Clonación sin
células y con DNA genómico. Son clones genómicos.
Mientras que en la derecha, purificamos el RNA total y extraemos el mensajero que nos
interesa. El mensajero hay una secuencia que queremos clonar. Conocemos la secuencia y
utilizamos un cebador y con la transcriptasa inversa. El cebador coincide con el de la PCR.
Conseguimos la hebra complementaria de cDNA y después separamos las cadenas e
introducimos un segundo cebador y amplificamos por PCR y obtenemos el cDNA.
91
TEMA 23: HIBRIDACIÓN

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
Antes de los años 60 se conocían los procesos de

desnaturalización del DNA, es decir, que las 2 hebras del DNA
se separaban al calentarse en solución acuosa de DNA a 100º C o
a un pH muy básico y el proceso se consideraba irreversible.
Sin embargo, en los 60 se observó que si tras la desnaturalización

las hebras se mantenían a una temperatura de alrededor de 65º C
por un periodo prolongado, las hebras volvían a formar la doble
hélice (hibridación o renaturalización del DNA).
Estas hibridaciones se pueden dar entre: DNA/DNA, RNA/RNA

y RNA/DNA siempre que tengan una secuencia complementaria.
Una sonda es un fragmento de DNA de una sola hebra que se usa

para detectar la secuencia complementaria. Pueden ir marcadas
con radiactividad, fluorescencia etc. Sus tamaños están desde ~
15 nucleótidos hasta mil. Dependiendo de la metodología a usar.
Técnica Southern: Es el análisis de la presencia de un determinado fragmento o gen completo

en el DNA previamente aislado de un determinado tejido o célula. Este DNA se hibrida con una
sonda de DNA marcada*complementaria a ese fragmento o gen completo que se busca.
Es decir es una hibridación:
DNA / sonda de DNA*complementaria.
Técnica Northern: Es el análisis de la expresión de un gen en una determinada célula o tejido.

Se aísla previamente el RNA total o un mRNA de ese tejido o célula y se utiliza para hibridar
con una sonda de DNA marcada* complementaria al RNA total ó mRNA que se expresa.
Es decir es una hibridación:
RNA / sonda de DNA* complementaria.
Técnica Western: Es una técnica de análisis de proteínas utilizando doble anticuerpo.
EL ANÁLISIS SOUTHERN EN MEDICINA FORENSE
Se puede utilizar el análisis Southern para establecer la culpabilidad en casos criminales “la
huella genética” de A. Jeffreys 1984.
Se compara el DNA de la víctima frente al de uno o más sospechosos.
Como sonda se utiliza una unidad repetida de las VNTRs ó microsatelites de entre 15 a 100
nucleótidos. El número de repeticiones de esa unidad es variable de un individuo a otro y se
transmite hereditariamente.
92
“MICROCHIPS” DE DNA
Estos han comenzado a desarrollarse en los 90. Son soportes sólidos con muchos pocillos y cada
uno con un gen distinto. Estos genes se pueden introducir mediante la aplicación manual y
puntual de pequeñas cantidades de cada uno de ellos o se pueden comprar ya cargados.
Si se quiere determinar por ejemplo la expresión de cada uno de estos genes en un determinado
tejido, se extrae el RNA total de ese tejido y se utiliza como sonda aplicándola sobre cada uno
de esos genes en cada pocillo de la matriz. Esta sonda suele ir marcada con fluorescencia.
Se forman híbridos: genes (DNA)/sonda (RNA total)* fluorescente.
Se podría utilizar también como sonda el cDNA correspondiente, obtenido por transcriptasa
inversa y marcado con fluorescencia.
Se identifica el nivel de expresión de cada gen porque se conoce su posición exacta en el chip.
La intensidad de la mancha fluorescente indica el grado de transcripción o lo que es lo mismo

de expresión de ese gen concreto.
ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA USANDO MICROCHIPS
Vamos a ver un análisis de expresión de 1733 genes (DNA) en 84 muestras de RNA total de
tumores de mama de distintos pacientes.
El color rojo representa la inducción de un determinado gen. El color verde la represión
93

GENÉTICA MOLECULAR (VI):
POLIMORFISMOS
POLIMORFISMOS
Cada uno de nosotros presenta unas diferencias en la secuencia de nucleótidos en el DNA que
nos hace únicos, a eso se denomina polimorfismos.
Un polimorfismo es una variación en el DNA lo bastante frecuente en una población, para

considerarse como mutación recurrente.
Estos polimorfismos pueden ser usados como marcadores para la construcción de mapas
genéticos y análisis genéticos que permitan relacionar polimorfismos particulares con
determinadas enfermedades o con una cierta predisposición a una cierta enfermedad.
Los polimorfismos son de 2 clases principales, que incluyen otras secundarias:
- Clase 1.-Polimorfismos de nucleótido único que incluyen a los RFLP (polimorfismos

de longitud de fragmento de restricción)
- Clase 2.-Polimorfismos de repeticiones de nucleótidos que incluyen a los
polimorfismos VNTR (polimorfismos de numero variable de repeticiones en tándem).
ALGUNAS DEFINICIONES
Alelo: es cada una de las secuencias alternativas de un gen determinado. Un individuo puede
presentar un máximo de dos alelos iguales o distintos para cada gen. Uno procederá de su padre
y otro de su madre.
Homozigoto: individuo que presenta dos alelos iguales para un gen determinado.
Heterozigotico: individuo que presenta dos alelos distintos para un gen determinado.
-CLASE 1-POLIMORFISMOS DE NUCLEÓTIDO ÚNICO
Lo más común es que esta clase esté relacionada con un sitio de restricción variable o
polimórfico y que el corte o no de ese sitio cause efectos genéticos. A esto se llama
polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP).
Ciertas enfermedades pueden cursar con variaciones que eliminen puntos de corte o generar
nuevos puntos de corte.
Un polimorfismo de estos se puede determinar por:
- hibridación Southern utilizando una sonda apropiada
- por PCR diseñando cebadores que flanqueen el sitio de restricción. Tras esto, al producto
amplificado se le expone a la enzima de restricción apropiada y tras electroforesis en gel de
94
agarosa se observan las bandas correspondientes a los fragmentos de tamaños distintos según
haya actuado o no la enzima en ese sitio de restricción.
Este tipo de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) si se encuentra

cerca de un gen asociado a una enfermedad por ej. la anemia falciforme, se puede usar para
diagnosticar esa enfermedad por Southern, utilizando como sonda una que sea capaz de
reconocer diferente patrón de restricción en enfermos y sanos.
Es decir, estos polimorfismos pueden servir como marcadores genéticos de genes vecinos
relacionados con enfermedades.
EJEMPLO DE ANÁLISIS DE UN POLIMORFISMO

RFLP EN LA ANEMIA FALCIFORME
Es un trastorno autosómico recesivo. El gen es el de la

-globina y consta de 3 exones y un tamaño de 2000
pb. Los eritrocitos exhiben HbS en lugar de la HbA.
El gen de la -globina presenta un cambio de un

nucleótido de AT (transversión) en el triplete que
codifica a la valina que pasa a codificar acido
glutamico (GAGGTG) en la sexta posición de la
proteína -globina.
Las personas enfermas presentan falta de un lugar de

corte en este gen para la enzima de restriccion Mst II,
ya que la especificidad de la enzima es:
(5’CCTNAGG3’) y los enfermos no poseen esa A sino
una T, por tanto en enfermos esta enzima de
restricción no corta y se genera un fragmento mayor
del gen.
Se puede detectar por Southern utilizando como sonda

del gen de la -globina una de 1,4 Kpb.
El enfermo puede llevar la mutación en un alelo y

entonces será (portador heterozigótico), en ambos
alelos (portador homozigótico) o en ninguno (sano).
95
Por tanto, hemos estudiado la herencia conjunta de un fenotipo humano especifico (una
enfermedad hereditaria) con un polimorfismo de un solo nucleótido.
¡Buscar más datos sobre la prot -globina! Nº de aas??
¡Localizar en que cromosoma está el gen!
OTRAS ENFERMEDADES QUE TAMBIÉN SE PUEDEN DIAGNOSTICAR

POR POLIMORFISMOS RFLPS
 FIBROSIS QUÍSTICA
Descrita en 1936, es un trastorno autosómico recesivo
Órganos afectados: pulmón y páncreas por acumulación de espesas secreciones mucosas.
El gen está ubicado en el cromosoma 7 (7q31) 1985; 230 kb y 24 exones. Se identificó por la
presencia de varios RFLPs cercanos.
Proteína: de 1480 aas que codifica un canal de iones cloruro (cystic fibrosis transmembrane
regulator CFTR) cuyo papel principal es la reducción de la concentración de cloruro sódico
intracelular, mejorando así, la calidad de las secreciones mucosas celulares.
Un 70% de pacientes son portadores de una deleción de un codón completo que codifica
fenilalanina en el aa 508 de la proteína del CFTR produciendo un canal disfuncional.
¡ Buscar el codon completo!.
 ENFERMEDAD DE HUNTINGTON
Descrita en 1872. Herencia autosómica dominante. Cromosoma 4.
Hay un deterioro progresivo de las funciones intelectuales con numerosos movimientos

involuntarios.
El gen fue descubierto en 1993 por análisis de polimorfismo RFLP.
Este gen contiene una secuencia de repetición CAG que da lugar a glutamina repetida n veces.
Entre 27-35 repeticiones de glutamina no causa la enfermedad pero a mas repeticiones si.
Además, se ha observado que cuantas más repeticiones se presenta más pronto se inicia esta
enfermedad.
¡Buscar el gen!
CLASE 2 POLIMORFISMO VNTR (NUMERO VARIABLE DE

REPETICIONES EN TÁNDEM)
Se suelen encontrar en el DNA no codificante ó satelite y abarca los tipos de:
-microsatelites: donde la secuencia es solo de unos pocos pb (de 1 a 5)
-minisatelites: con secuencias de entre 5 a decenas de pb (de 5 a 64) por término medio ~25
pb.
96
Algunos de estos micro o minisatelites se pueden encontrar cerca de genes y afectar su

expresión.
Además, en estos polimorfismos VNTR las repeticiones varían con mucha facilidad entre
individuos e incluso entre los dos alelos de un mismo individuo. Esto es debido a la gran
capacidad de recombinación del DNA.
De hecho se llaman “loci hipervariables” por tener de forma característica muchos alelos, por lo
que es poco probable que dos individuos no emparentados compartan los mismos.
ESTUDIO DE LA HERENCIA CONJUNTA DE UNA ENFERMEDAD

HEREDITARIA CON UN POLIMORFISMO PUNTUAL DE RESTRICCIÓN
SNP
Si los individuos que presentan una determinada enfermedad heredan casi siempre un SNP
concreto, es probable que el gen responsable de la enfermedad y el SNP estén cercanos en el
cromosoma.
Las frecuencias de aparición de los SNP en el genoma humano los torna útiles para el mapeo
genético.
Ya se han identificado 1, 5x 10^6 SNP hay un promedio de un SNP cada 1-2kb.
Esto debería permitir la localización rápida de nuevos genes asociados a una enfermedad por su
vecindad a los SNP más cercanos.
97
TEMA 25: CÓDIGO GENÉTICO

CORRESPONDENCIA DE LAS SECUENCIAS: DNA-RNA-PROTEÍNA
DNA: 5’ ATGACGATA......3’
3’ TACTGCTAT......5’
mRNA: 5’ AUGACGAUA.....3’
NH2-Met- Thr- Ile- ……COOH
Vamos a ver que el código genético está escrito en letras de RNA.
LA POLINULCEÓTIDO FOSFORILASA DE OCHOA AYUDO MUCHO AL

DESCIFRAMIENTO DEL CÓDIGO GENÉTICO
Fue la primera RNA polimerasa descubierta, lo consiguieron Ochoa y col en los años 50.
Paralelamente, Kornberg y col descubrieron la primera DNA polimerasa. Ambos obtuvieron el
PN en 1959 compartido por estos descubridores.
Ocho la describió como una RNA polimerasa bacteriana que no necesitaba molde y que usaba
ribonucleódiso difosfato como sustratos para producir un polinucleótido de secuencia aleatoria
cuya composición de bases se correspondía con la composición de ribonucleótidos del medio.
Aunque inicialmente se consideró que podría ser la RNA polimerasa transcripcional que se
estaba buscando, posteriormente se observó que no lo era. No obstante, esta enzima tuvo un
importante papel en la síntesis in vitro de los polinucleótidos sintetizados para el desciframiento
del código genético.
DESCIFRAMIENTO DEL CÓDIGO GENÉTICO
Fue llevado a cabo por los laboratorios de Khorana y de Nirenberg de forma paralela.
Obteniendo por ello el PN de Fisiología y Medicina en 1968. Inicialmente con 4 bases podría
ser: 4`1=4; 4^2=16; 4^3=64.
Khorana trabajó con la RNA pol de Ochoa en un sistema in vitro y creó pequeños
polinucleótidos de RNA, para su traducción utilizaba ribosomas, aas y factores de traducción.
Así por ejemplo (1º) creó uno con múltiples A; (2º) otro con múltiples AC y (3º) otro con
múltiples AAC. Observó que el primero traducía múltiples Lys, por tanto, el codón AAA
codificada lisina; el segundo empezaba por AC traducía múltiples Thr, y si por CA, His; y el
tercero si empezaba por AAC traducía múltiples Asn, si empezaba por ACA múltiples Thr y si
empezaba por CCA múltiples Gln. Rn la comparación de los tres pasos efectivamente ACA
codificaba Thr y CAC His y así sucesivamente.
Nirenberg utilizó diferente estrategia. Trabajó in vitro con aa-tRNAs, ribosomas y un

nucleósido trifosfato sintético diferente en cada experimento. Por ejemplo formaba complejos:
ribosomas-UUU unidos a una membrana de nitrocelulosa y a través de ella filtraba los aa-tRNA.
Estos pasaban todos a través de la membrana excepto uno que era retenido por
complementariedad de bases de su anticodon con UUU. Por ejemplo, la fenilalanil-tRNA
98
quedaba fijada con el complejo ribosoma-UUU, de lo que se deducía que UUU codifica Phe. Y
así sucesivamente…
CARACTERÍSTICAS DEL CÓDIGO GENÉTICO
Apoyándose en estos experimentos y otros se llegó a concluir que solo los tripletes o codones de
tres nucleótidos codificaban a los 20 aas.
En total hay 4^3=64 tripletes, de ellos 61 codifican a los 20 aas y los 3 restantes son de
terminación o stop (UAA, UAG, y UGA).
El codón de inicio es siempre AUG y codificaba Met.
Es un código sin solapamiento, sin comas.
Se lee secuencialmente a partir del triplete de inicio.
Para la mayoría de los aas hay más de un triplete. A esto se denomina “degeneración del
código”.
El código es prácticamente universal, con alguna excepción en mitocondrias y en algunos

protozoos ciliados.
CÓDIGO GENÉTICO LINEAL
99
CODONES PROPIOS DEL CÓDIGO GENÉTICO MITOCONDRIAL
El código genético mitocondrial tiene 64 codones como el código universal pero en

lugar de los 3 stop tiene 4: de ellos 2 se mantienen: UAA y UAG, el UGA pasa a
codificar Thr y hay 2 nuevos: AGA y AGG.¡aunque no en todas las especies!
IMPORTANCIA DE LA RELACIÓN CODON-ANTICODON
• Anticodón (del tRNA): 3’U A C 5’
• Codón (del mRNA): 5’A U G 3’
La posición de balanceo se localiza en la tercera base del extremo 3`del codón.
tRNA EN FORMA DE HOJA DE TRÉBOL
En la correspondencia codón-anticodon hay que ponerlo girado: 3`5`
REGLAS DEL BALANCEO
Las reglas de balanceo hay que aprendérselas.
Las dos primeros cumplen la relación normal: A-U; G-C; mientras que los otros dos: C-G/I; U-
A/G/I.
Si el nucleótido de la primera columna está en la posición de balanceo puede aparearse con

cualquiera de los nucleótidos de la segunda columna.
100
NUCLEÓSIDOS RAROS EN LOS RNAs
La I (inosina) se forma por desaminación de la G nucleótido de RNA en la posición 2. Si fuera

de la dG nucleótido de DNA en la misma posición sería xantina.
CONSECUENCIA DE LAS REGLAS DE BALANCEO
Los seres humanos teneos alrededor de 500 genes de tRNA pero entre todos ellos, solo hay
representados 48 tRNAs diferentes. Es decir, 61 codones deben ser reconocidos por 48
anticodones de tRNA.
Esto es posible porque algunos amticodones pueden reconocer a más de un codón ya que el
apareamiento de la tercera base del codón (p. balanceo) es menos crucial que el de las otras dos.
Según estas reglas cuando la posición 5`del amticodón de un tRNA hay una
Por ejemplo, en el caso de los 4 codones que especifican Ala:
Codones Anticodones de tRNA
5`GCU3` 3`CGA5`, CGG, CGI
5`GCC3` 3`CGG5´, CGI
5`GCA3` 3`CGU5`
5`GCG3` 3`CGU5`
- Los 2 primeros codones pueden ser reconocidos por un tRNA con el anticodón
3`CGI5ò por un tRNA con el anticodón 3`CGG5`.
- El 3º codón puede ser reconocido por un tRNA con el anticodón 3`CGU5èxclus.
- El 4º codón puede ser reconocido por un tRNA con el anticodón 3`CGC5èxclus.
Por tanto, el número mínimo de tRNAs que se necesitarían para el reconocimiento de estos
cuatro codones de Ala serían 3tRNA.
VENTAJAS DEL BALANCEO
1. Añade flexibilidad al código genético.
2. Al ser más débil la interacción entre el tRNA y el mRNA, el primero se disocia más rápido
del segundo, con lo que se acelera la traducción o síntesis de proteínas.
3. Se reducen al mínimo los efectos de las mutaciones puntuales en el mRNA.
TIPOS DE MUTACIÓN EN EL DNA
• Por sustitución: Es el reemplazamiento o sustitución de un par de bases por otro.
-transición: es la sustitución de una purina por otra o de una pirimidina por otra.
-transversión: es reemplazar una purina por una pirimidina o viceversa.
• Por inserción: Es la introducción o inserción o de uno o más pares de bases.
101
• Por eliminación: Es la deleción o eliminación o de uno o más pares de bases.
COMO AFECTAN LAS MUTACIONES DEL DNA A LA PROTEÍNA TRADUCIDA
1. Mutaciones silenciosas, neutras, asintomáticas, que conservan el significado o sentido

“silent”
Mutación
-104- -104-
5`DNA -ACT- -ACG-
3`DNA -TGA- -TCG-
5`mRNA -ACU- -ACG-
NH2-prot -Thr- -Thr-
Supongamos una proteína en todos los ejemplos de 190aas.
2. Mutaciones no silenciosas.
2a. que alteran el significado o sentido “missense”
-106- -106
5`DNA -GAG- CTG
3`DNA .CTC- CAC
5`mRNA GAG GUG
NH2-prot Glu Val
Nos recuerda a la alteración en la anemia falciforme.
2b. que alteran el marco de lectura por desplazamiento “frameshift”
-104- 105-106 104-105-106
5`DNA -ACT-CCT-GAG -A- -T-CCT-GAG
3`DNA -TGA-GGA-CTC -T- -A—GGA-CTC
5`mRNA -ACU-CCU-GAG -AUC- CUG
NH2-prot -Thr-Pro-Glu- Ile-Leu
2c. que alteran el marco de lectura acortando o alargando a la proteína.
-104- Mutación
102
5`DNA -ACT- Se anula el triplete 104
3`DNA -TGA-
5`mRNA -ACU-
NH2-prot Thr -His-X-Pro-= -His-Pro
La proteína se acorta en ese aa que le falta
2d. que inducen terminación prematura de la proteína “nonsense”
-108- -108-
5`DNA -AAG- -TAG-
3`DNA -TTC- -ATC-
5`mRNA -AAG- -UAG-
NH2-prot -Lys- -stop-
Supongamos una proteína en todos los ejemplos de 190 aas.
2e. que inducen terminación retrasada de la proteína.
-190 -190
5`DNA -TGA- -TCG-
3`DNA -ACT- -ACG-
5`mRNA -UGA- -UGC-
NH2-prot -Stop- -Cys-
Sigue la proteína
103
TEMA 26: tRNA SINTETASAS

ESTRUCTURAS DE UN tRNA
La estructura primaria del tRNA se representa en la imagen (D) que corresponde a la secuencia
lineal de nucleótidos de RNA de la molécula.
La estructura secundaria del tRNA se establece gracias los enlaces de H de Watson y Crick que
se establecen entre las bases que mantienen una estructura de hoja de trébol. Presenta diferentes
brazos:
- Brazo D: donde encontramos nucleótidos D (desoxiuridina).

- Brazo T: donde encontramos nucleótidos T (ribotimidina) y pseudouridina.
- Brazo del anticodón: donde localizamos el anticodón, que define el aa a transportar.
- Brazo aceptor: con los extremos 5`y 3`, precisamente es en el extremo CC3`donde se
une el aminoácido a transportar.
La estructura terciaria se establece a partir del plegamiento de la molécula que forma una
estructura compacta en forma de L que se mantiene gracias a la formación de enlaces de H
adicionales entre diferentes regiones de la molécula.
LOS AMINOACIL-tRNA SINTETASAS
Hay al menos una aminoacil-tRNA sintetasa y un tRNA para cada aa (recordemos que hay
48tRNAs diferentes). En el caso de la Met inicial, esta Met tiene su propia aminoacil-tRNA
sintetasa específica y su tRNA específico que son distintos de los de las otras Met que siguen en
la proteína que se está sintetizando.
Pero es más común una aminoacil-tRNA sintetasa para varios tRNA relacionados que
transportan el mismo aa.
104
Cada aminoacil-tRNA sintetasa primero activa al aa apropiado en una reacción acoplada a la

liberación de energía producida en la hidrólisis de ATP que permite fabricar un enlace de alta
energía entre el aa y el tRNA. En segundo lugar une el grupo carboxilo de ese aa al grupo
hidroxilo 3`de la ribosa del último nucleótido (el A) de la secuencia CCA3`del extremo 3`del
tRNA relacionado, mediante una unión ester.
LA AMINOACIL-tRNA SINTETASA PORTANDO EL AA AL tRNA

APROPIADO
El aa debe también presentar la máxima afinidad por el “bolsillo del centro activo de su
sintetasa”.
ACTIVACIÓN DE LOS AAs Y FORMACIÓN DE LOS AMINOACIL-tRNAs

POR LAS AMINOACIL-tRNAs SINTETASAS
Cada aminoacil-tRNA sintetasa primero activa un aa dado y después lo transfiere al A del

extremo CCA3`del tRNA con el anticodón apropiado.
DETALLE DE LA UNIÓN DEL AA ACTIVADO AL 3ÒH DE LA RIBOSA DEL

NUCLEÓTIDO A DEL EXTREMO CCA3`DE tRNA RELACIONADO
105
CORRECCIÓN DE LA UNIÓN DEL aa POR LA PROPIA AMINOACIL-tRNA

SINTETASA
Ellas mismas cambiando el aa cambiándolo del centro activo al centro de corrección es capaz de
detectar si están bien unidos o no. La terminación CCA es un tallo flexible que puede cambiar el
aa de un lugar de activación a otro sitio de corrección.
El tallo flexible CCA3`puede trasladar el aa de lugar dentro del “bolsillo” de la sintetasa y esta
enzima eliminarlo hidrolíticamente.
LAS tRNAs SINTETASAS CORRIGEN SUS PROPIOS ERRORES MEDIANTE

ELIMINACIÓN HIDROLÍTICA
MÁS SOBRE LAS AMINOACIL-tRNA SINTETASAS
Hemos visto que pueden corregir, si está equivocada, la unión del aa al tRNA correspondiente,
porque estas enzimas tienen un “lugar de corrección” o “editing” en el que se eliminan por
hidrólisis los aa equivocados.
Una sintetasa puede equivocarse e incorporar un aa incorrecto aproximadamente 1 de cada 4

x10^4 reacciones. Recordemos que el error de replicación es 1 de cada 30x10^6.
Existen dos tipos de aminoacil-tRNA sintetasas: tipo I y II. Las de tipo I son monoméricas y las
de tipo II son diméricas. Cada tipo se encargan de 10 de los 20 aa naturales, siendo para los de
tipo II más largos e hidrofóbicos.
Las de tipo I unen el aa al grupo hidroxilo 2`de la ribosa de la última base, mientras que las de
tipo II lo hacen al hidroxilo 3`. Además de poner unir los aa en caras diferentes de la estructura
terciaria del tRNA.
106
TEMA 27: TRADUCCIÓN

Cuando no están siendo usados en la fabricación de una proteína las dos subunidades del
ribosoma están disociadas.
La sub menor (40S) constituye el soporte sobre el que los tRNAs pueden aparearse
correctamente con los codones del mRNA.
La sub mayor (60S) cataliza mediante una peptidil transferasa propia la formación de los
enlaces peptídicos que unen a los aas formando una cadena polipeptídica.
LA CONFORMACIÓN TRIDIMENSIONAL DEL RIBOSOMA FUE

PUBLICADA EN EL AÑO 2000
Por estudios sobre la estructura de los ribosomas y la utilidad terapéutica de estas

investigaciones, Yonath, Steaiz y Ramakrishman obtuvieron el PN.
SITIOS EN EL RIBOSOMA
Cuando las dos subunidades se unen, surgen unos sitios de unión. Hay un sitio que es una
localización determinado donde se asienta el mRNA.
Hay tres sitios:
- Sitio A: unión del tRNA donde

entra el nuevo aa.
- Sitio P: que es el del medio por
donde crece la proteína.
- Sitio E: es de salida, con
localización transitoria.
Las cavidades que sustentan esos teóricos sitios, pues es una localización fundamental de
mRNA.
Los ribosomas se deslizan sobre el mRNA. Los tRNAs entran y salen. El que avanza en la
lectura del código son las dos subunidades del ribosoma y lo hacen de forma separada.
INICIACIÓN Y ALGUNOS DE SUS FACTORES: eIF2, eIF4G, eIF4E
Podemos hablar de 12 factores distintos en el inicio.
El factor de inicio 2 que es un factor que necesita GTP. El proceso gasta mucha energía y
necesitamos GTP y ATP en los procesos de traducción. El primer factor que llega en trans que
necesita GTP es el factor 2, que parece que reconoce de forma muy específica a ese tRNA que
porta la primera metionina.
Tiene que unirse al subunidad menor del ribosoma. Este precomplejo es básico para seguir. Una
vez unido la subunidad menor y el factor, necesitamos el mensajero, que tiene su caperuza. El
mensajero es reconoce por otras dos proteínas que llegan en trans la 4e y la 4g. Esta caperuza ha
cobrado una gran importancia porque es la forma de reconocerse por estas proteínas de factores
de iniciación.
107
Se necesita también que la zona de la cola poliA que tiene que estar cercana a la zona de la
caperuza. Este proceso de retorcerse con todos los factores de iniciación, se coloca el complejo
a partir de la caperuza.
El que avanza es el ribosoma. En el reconocimiento del primer AUG se necesita ATP, se asienta
con el factor 2 que ayuda al reconocimiento, la energía es para el desplazamiento del complejo y
la proteína sale en forma GDP y sale el factor 2 y otros que entraron previamente.
Se une la subunidad mayor. A partir de este momento comienza la elongación, se une un nuevo
tRNA correspondiente al siguiente codón y se forma una primera unión entre los aas.
A veces la subunidad menor del ribosoma puede ignorar el primer codón AUG del mRNA y en
su lugar saltar al segundo o tercer AUG.
Esto puede provocar que a partir de una misma molécula de mRNA se pueden fabricar dos o
más proteínas que se diferencian en sus extremos N-terminales. Esto puede ser el caso de las
proteínas con la denominada secuencial señal en el NH2.
Estas proteínas con la secuencia señal o sin ella pueden ir a compartimentos celulares distintos
para su elaboración y metabolismo.
108
ELONGACIÓN
Tiene lugar por la introducción sucesiva de nuevos aas y

se desarrolla en 4 etapas que se repiten según el número de
aas de la proteína naciente, de forma que esta proteína va
creciendo por su extremo carboxilo terminal:
1- La unión del siguiente aminoacil-tRNA

2- La formación del enelace peptídico entre aas
cataliza por una peptidil-transferasa de la subunidad
grande del ribosoma.
3- La translocación de la subunidad mayor del
ribosoma
4- La translocación de la subunidad menor del
ribosoma
Veremos que son las 2 subunidades del ribosoma las que se mueven.
Cuando entre el cuarto tRNA, se produce la unión del tercer aminoácido

con el cuarto. Avanza la subunidad mayor y después avanza la menor. Así
las posiciones se modifican y el tercer aa está en la posición de salida y el
de entrada libre para un nuevo tRNA.
ELONGACIÓN A NIVEL DE LOS 2 FACTORES DE ELONGACIÓN: EF1 Y

EF2
En procariotas se llama EF-Tu en vez de EF1.
El cuarto tRNA necesita de estos factores. Funcionan también

unido al GTP. Cada aa que se une necesita una molécula de
GTP por el factor EF-Tu que ayuda para la entrada del tRNA.
Puede haber una corrección de pruebas.
El EF-G/EF2 tira del ribosoma. Ayuda en la movilización del

ribosoma colocándose en el sitio que queda libre y con este
intercambio de energía de la GTP a continuación se transloca la
subunidad menor.
TERMINACIÓN
La síntesis de la proteína se termina por medio de factores de

terminación o liberación que leen los codones stop. Hay 2
Clases:
- Clase I: el eRF1 que reconoce a los tres codones de terminación:

UAG, UGA y UAA. Se une al sitio A y facilita la salida de la proteína
completa recién sintetizada.
- Clase II: el eRF3 regulado por GTP cuyo papel es reciclar al factor
eRF1.
Al final, se liberan del ribosoma la proteína sintetizada, el mRNA traducido

y el tRNA último.
109
Los ribosomas se reciclan por el denominado RRF (factor de liberación del

ribosoma). A continuación se disocian en sus dos subunidades por el eIF-3 para
comenzar de nuevo.
La velocidad de traducción es de unos 2 aas/s en eucariotas y de unos 20 aas/s en

procariotas.
LA BIOSÍNTESIS DE PROTEÍNAS CONSUME GRAN CANTIDAD

DE ENERGÍA
Para poder formar cada nuevo enlace peptídico se rompen mínimo 4 enlaces fosfato
de alata energía:
- Dos del ATP se consumen en cargar la molécula de tRNA con un aa.

- Otros dos del GTP dirigen a dos niveles, las etapas de la elongación.
Además se consume energía por hidrólisis del GTP:
- Cada vez que la aminoacil-tRNA sintetasa corrige la unión de un aa

incorrecto.
- Cada vez que un tRNA portando un aa incorrecto entra en el ribosoma.
POLIRIBOSOMAS O POLISOMAS
Realmente los ribosomas funcionan como polirribosomas que son agrupaciones de ribosomas
que están unidos a una misma molécula de mRNA y traducen de forma simultanea esa molécula
tanto en eucariotas como en procariotas.
Cada polirribosoma opera sintetizando la cadena polipeptídica completa, avanzando a lo largo

del mRNA en la dirección 5’3’.
La densidad máxima de ribosomas sobre un mRNA es de alrededor de 1 ribosoma por cada 80-
100 nucleótidos.
Cuanto más cerca del extremo 5’ del mRNA este el ribosoma, más corta será la proteína que va
formando. Contrariamente, cuanto más lejos este, será más larga.
El hecho que un mRNA pueda ser leído por varios polirribosomas permite formar varias copias
de la misma proteína a partir de un único mRNA.
Por término medio una proteína tarda en biosíntetizarse entre 20-60 segundos. Cada ribosoma
están separados por término medio de unos 80 nucleótidos.
110
MODIFICACIONES POST-TRANSDUCCIONALES DE LAS PROTEÍNAS
La mayor parte de estos procesos tienen lugar solo en eucariotas:
- Plegamiento
- Unión no covalente a cofactores
- Modificación covalente:
o Glicosilación
o Fosforilación
o Acetilación
o Hidroxilación de los aas Pro y Lys
o Unión de elementos lipídicos
o Metilación
o Formación de enlaces disulfuro etc…
- Unión a otras subunidades proteicas
- Procesamiento proteolítico y reordenación proteica.
Algunas proteínas son de uso interno para la célula que las produce y otras son para exportarlas
a otras células.
PLEGAMIENTO POST-TRADUCCIONAL
Según va saliendo la proteína que se forma se va plegando. El extremo inicial N terminal se

pliega rápidamente y cuando sale el otro extremo termina de plegarse el extremo C-terminal.
111
TRADUCCIÓN MITOCONDRIAL
Con la maquinaria propia mitocondrial se sintetizan 13 proteínas de la cadena respiratoria. El

resto de proteínas que necesita la mitocondria, se sintetizan a partir del DNA genómico de la
célula de la que forma parte.
Los ribosomas mitocondriales son libres y más pequeños que los citoplasmáticos.
Las aminoacil-tRNA sintetasas proceden del citoplasma de la célula y son transportadas a las
mitocondrias.
El primer tRNA es un formil-metionil-tRNAf como en procariotas.
La traducción es inhibida por el cloranfenicol como en procariotas.
FORMACIÓN DEL METIONAL-tRNA INICIAL
La metionil-tRNA sintetasa es específica para esta primera metionina.
En eucariotas se forma Metionil-tRNA.
En procariotas se forma formil-metionil-tRNAf.
INHIBIDORES DE LA TRADUCCIÓN
Son antibióticos actuando como inhibidores de distintas etapas de la traducción y por ello
causantes de su muerte. Solo algunos actúan en eucariotas. El estudio de estos inhibidores,
aparte de su importancia como medicamentos, ha ayudado mucho a la comprensión de las
etapas de la traducción.
A nivel de la Iniciación:
• Estreptomicina: Se une a la subunidad pequeña ribosómica de 30S e inhibe la

asociación de la subunidad grande de 50S (en procariotas).
A nivel de la Elongación:
112
• Tetraciclina: Se une a la subunidad 30S e impide la acción del EF-Tu uniendo los
aminoacil-tRNAs en el sitio A (en procariotas).
• Cloranfenicol: Inhibe la actividad péptidil-transferasa intrínseca de la subunidad

ribosómica de 50S (en procariotas).
• Cicloheximida: Inhibe la actividad peptidil-transferasa intrínseca de la subunidad

ribosómica de 60S (en eucariotas).
• Eritromicina: Se une a la subunidad 50S e inhibe su translocación por el factor EF-G

(en procariotas).
• Puromicina: Provoca la terminación prematura de la cadena por actuar como un análogo

de un aminoacil-tRNA. Se une al sitio A y tras la acción de la peptidil-transferasa se
produce un peptidil-puromicina y no puede seguir adelante en la síntesis de la proteína
naciente (en procariotas y eucariotas).
OTROS INHIBIDORES DE LA TRADUCCIÓN (TOXINAS CONTRA

EUCARIOTAS)
La toxina producida por la bacteria de la difteria es una proteína que modifica de forma
covalente al factor de elongación eucariota EF2 translocasa (análogo al EF-G procariota).
La toxina vegetal del ricino (rícina) es una proteína que inhibe también la elongación eucariota,
en este caso al eliminar una adenina crucial en el rRNA de 28S que forma parte de la subunidad
grande del ribosoma (60S).
113

GENÉTICA MOLECULAR (VII)
LA LOCALIZACIÓN EXCLUSIVA DE PLÁSMIDOS CON INSERTO POR
TEST DE DOBLE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS
Utilizamos plásmidos con dos zonas de resistencia a antibióticos.
Primeramente incluimos el inserto en una de las dos zonas y teniendo en cuenta la resistencia
de la otra zona, crecemos con ese antibiótico y podemos detectar las colonias que llevan
plásmido que son las que crecen de las que no lo llevan.
En segundo lugar, crecemos estas colonias con plásmido en presencia de ese mismo antibiótico
(control) y en presencia de los dos antibióticos juntos. Comparando las placas, las colonias que
llevan plásmido con inserto son las que no han crecido en presencia de los dos antibióticos.
ETAPAS DE CLONACIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL PLÁSMIDO CON O SIN

EL INSERTO UTILIZANDO LA DOBLE “RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS”
Inserto que se quiere clonar
Plásmidos con el inserto
114
Solo crecerán en el medio

con tetraciclina las que
lleven el plásmido con el gen
de resistencia a TetR
(1) Hemos seleccionado las

colonias que llevan
plásmidos
(2) Seleccionamos si el plásmido lleva el

inserto o no
Idem, llevan plásmidos con o Si son resistentes a amp

sin inserto no llevan inserto
115
Nos interesan las colonias que llevan el plásmido

con el inserto, es decir, las que faltan
tras comparar las dos placas : 1, 2 y 3.
116
TEMA 29: REGULACIÓN DE LA

TRANSCRIPCIÓN
EL MODELO DE REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL EN PROCARIOTAS
ES EL DEL OPERÓN
Operón es un conjunto de genes contiguos que se transcriben como una unidad junto con los
elementos reguladores adyacentes que controlan su expresión (F. Jacob y J. Monod, premio
Nobel Fisiología y Medicina 1965).
En procariotas muchos genes están agrupados formando operones. En E. Coli de los ~4405
genes la cuarta parte está formando operones.
Un operón está formado por:
- Lugares o elementos de control : promotor y operador
- Genes estructurales: codifican proteínas que se necesitan para el funcionamiento propio del
operón.
- Genes reguladores: codifican proteínas que interaccionan con los operadores y con los
promotores para estimular o inhibir la transcripción de los genes estructurales. Suelen tener su
propio promotor.
Vamos a comentar el operón de Lac:
La célula cuando está en medio con glucosa, no

necesita usar el operón. El operón Lac es un
modelo que está de forma natural reprimido.
El operón Lac se usa cuando no tiene glucosa,

pero sí lactosa. Cuando hay lactosa, la tiene
que metabolizar y se pone en marcha este
operón.
Hay tres genes: z, y, a. Estos genes codifican

unas proteínas que participan en el
metabolismo. Cuando está reprimido, hay una
gen regulador “i” que tiene su propio promotor.
En represión, el gen “i” con la ayuda del
promotor da lugar a un mensajero que da una
proteína que reprime porque se une a la zona
del operador y con ello dificulta el avance físico de la RNA polimerasa para los genes z, y, a.
En presencia de lactosa, se impide la unión del represor al DNA.
La beta galactosidasa es la enzima que rompe a la lactosa que es un disacárido (galactosa y

glucosa). La alolactosa que es un homólogo a la lactosa también es capaz de inducir el operón
Lac.
117
CLONACIÓN DE GRANDES FRAGMENTOS DE DNA EN UN CROMOSOMA

ARTIFICIAL BACTERIANO (BAC)
Se introduce el inserto rompiendo la zona donde está el LacZ. Se introduce el inserto largo y
transfectamos las bacterias. Las bacterias se cultivan con agar y con cloranfenicol. El vector
tiene gen de resistencia a cloranfenicol y un operón Lac.
Las colonias con el inserto rompiendo el gen LacZ no tienen actividad galactosidasa y son
blancas.
Las colonias sin el inserto si tienen actividad galactosidasa y son azules.
Ambas son resistentes al cloranfenicol.
EN EUCARIOTAS LA REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL SE SUSTENTA

SOBRE CIERTAS DIFERENCIAS CON PROCARIOTAS
Los genes no se agrupan en operones.
El DNA eucariota no es un DNA desnudo, va acompañado de las hístonas formando los

nucleosomas. Los genes contienen exones e intrones.
Hay un promotor para cada transcripto primario. Los pre-mRNA son monocistrónicos.
Los procesos de replicación y transcripción se dan en el núcleo y el mRNA maduro pasa al

citoplasma donde se traduce.
Además, la expresión es diferencial y altamente regulada según tejido, tiempo de desarrollo,…
PROTOTIPO DE PROMOTOR EUCARIOTA: SECUENCIAS EN CIS Y

FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN EN TRANS
FACTORES GENERALES DE TRANSCRIPCIÓN
118
AMPLIACIÓN DE ELEMENTOS DE CONTROL EUCARIOTA: PROMOTOR,

RNA POL II, PROTEÍNAS DE REGULACIÓN GÉNICA Y SUS SECUENCIAS
REGULADORAS
PROTEÍNAS DE REGULACIÓN GÉNICA Y SUS SECUENCIAS

REGULADORAS
De los aproximadamente 25000 genes humanos se estima que un 8% (2000 genes) codifican
proteínas reguladoras de genes.
Sus secuencias reguladoras se pueden encontrar adyacentes al promotor, muy lejanas corriente
arriba, también corriente abajo o incluso dentro de algún intrón.
Los formatos o motivos estructurales de estas proteínas reguladoras son fundamentalmente de 4

tipos como veremos:
Estas proteínas unidas a sus secuencias respectivas pueden actuar como activadoras o represoras
y modificar a los factores generales de transcripción, a la RNA pol II directamente y/o al
denominado Mediador.
Mientras que el mediador y los factores generales de transcripción son los mismos para todos
los genes transcritos por la RNA pol II, las proteínas reguladoras y a la posición de sus
secuencias de unión en relación con el promotor son distintas para cada gen.
En el tema siguiente veremos que ciertas proteínas reguladoras también modifican la estructura
de la cromatina de esa región controlando de otra manera el inicio de la transcripción (complejo
remodelador de la cromatina).
En una proteína reguladora está separado el dominio de unión al DNA del dominio
activador/represor.
119
UNIONES MÁS HABITUALES ENTRE PROTEÍNAS DE REGULACIÓN-DNA:
La asparagina es capaz de formar puentes de H en ciertas posiciones de la adenina. En general

son: puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas.
Una arginina forma también puede formar puentes de H con la G. La G puede ser reconocida
por: Arg, Ser, His y Lys.
TIPOS DE PROTEÍNAS REGULADORAS Y SUS DOMINIOS DE UNIÓN AL

DNA
Hay 4 tipos:
- Proteínas con formato con hélice giro hélice: formado por hélices alfa, la secuencia alfa
y otra hélice alfa. Podemos encontrarlo con 2 o 3 hélices, o formando dímeros de tres
hélices. La más estudiada son las proteínas homeo dominios que se relacionan con el
desarrollo embrionario de insectos.
- Proteínas con dedos de zinc: tiene hélices alfa, zonas abiertas y también hojas beta. Se
llaman así porque forma un conglomerado con el Zn donde son importantes las cisteínas
y las histidinas. Por ejemplo, los receptores de las hormonas esteroideas. También se
pueden formar dímeros: homodímeros o heterodímeros.
- La cremallera del leucina: suele ser en formato dímero con alfa hélice, zonas abiertas.
Las uniones son hidrofóbicas entres las leucinas.
- Proteínas hélice bucle hélice: suelen ser con formato dímero con alfa hélices, zonas
abiertas. Tienen por un lado aa cargados y otros con gran capacidad hidrofóbicas que
será la naturaleza de las uniones.
120
COACTIVADORES O CORREPRESORES
Son proteínas que no se unen directamente al DNA sino que se ensamblan con otras proteínas
de regulación génica, en conjunto se denominan coactivadores o correpresores.
Sin embargo, estos términos pueden generar confusión porque abarcan una gran variedad de
proteínas incluyendo a los complejos de remodelación de la cromatina que a su vez incluyen
distintas actividades enzimáticas como veremos en el siguiente tema.
Algunas de estas proteínas no tienen actividad intrínseca por sí mismas sino que simplemente
actúan como “andamiaje” para atraer a otras proteínas que si tienen actividad.
LA ACTIVIDAD DE LOS COMPLEJOS: (PROTEÍNAS DE REGULACIÓN-

COACTIVADOR/CORREPRESOR) MUCHAS VECES DEPENDE DEL
ENSAMBLAJE DE ESOS COMPLEJOS
El coactivador junto con las proteínas reguladoras que están unidas a las secuencias permiten
conjuntamente la activación de la transcripción del gen.
El correpresor conjuntamente con las proteínas reguladoras unidas a las secuencias de DNA
reprimen la transcripción del gen.
EL MEDIADOR
El Mediador es un complejo de gran tamaño formado por 25-30 subunidades proteicas que
permite que ciertas proteínas activadoras/represoras se comuniquen a través de él con la RNA
pol II y con los factores generales de transcripción. Estas interacciones ayudan a que la RNA
pol II se sitúe y se estabilice cerca de los genes específicos que posteriormente serán transcritos.
Otras proteínas no necesitan de la acción del Mediador ya que modifican directamente a los
factores generales de transcripción y a la RNA pol II.
Muchas proteínas de regulación génica actúan a través del denominado Mediador mientras que
otras modifican directamente a los factores generales de transcripción y a la RNA pol II.
Recordemos que el Mediador y los factores generales de transcripción son los mismos para
todos los genes transcritos por la RNA pol II, mientras las proteínas reguladoras con sus
respectivas secuencias de unión en el promotor o corriente arriba/debajo de este promotor,
pueden variar de tipo y/o localización para cada gen.
121
TEMA 30: EL COMPLEJO

REMODELADOR DE LA CROMATINA
COMPLEJO REMODELADOR DE LA CROMATINA
Es un gran complejo proteico de más de 10 subunidades que puede ser reclutado al inicio de la
transcripción para desplazar el DNA de su unión al nucleosoma, utilizando la energía de la
hidrólisis del ATP.
Cada ciclo de unión al ATP, hidrólisis de ATP y liberación de los productos ADP y Pi desplaza
al DNA respecto al octámero de histonas. Pero se necesitan muchos ciclos para que el DNA se
haga accesible a otras proteínas.
Las células tienen docenas de estos complejos remodeladores actuando de forma local solos o
con las chaperonas de histonas. Debido a la presencia de estos remodeladores la disposición de
los nucleosomas en el DNA puede ser muy dinámica y cambiar con rapidez de acuerdo con las
necesidades de la célula.
Algunos de estos complejos tienen subunidades que los orientan hacia ubicaciones particulares
como el segmento TATA de ciertos promotores. Determinador factores de transcripción
también pueden afectarles.
DESLIZAMIENTO DEL NUCLEOSOMA CATALIZADO POR UN COMPLEJO

REMODELADOR DE LA CROMATINA
En distintas, simultaneas y seguidas hidrólisis del ATP, el DNA avanza y se despliega en parte
y hace que el octámero de histonas sea sensible a poderse desplazar.
Con la ayuda de las chaperona de histonas este complejo remodelador puede alterar el contenido
de los nucleosomas.
Con las chaperonas de histonas se puede producir un intercambio de dímeros H2A-H2B o bien
se produce un cambio del núcleo nucleosómico (octámero de histonas).
ALGUNOS PATRONES DE MODIFICACIÓN DE HISTONAS QUE

FACILITAN EL INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN
El complejo remodelador de la cromatina puede actuar solo y se sitúa en la zona cercana la caja
TATA y por la hidrólisis de ATP desplaza el DNA y lo abre. Puede estar funcionando con
chaperonas de histonas y cambiar totalmente el nucleosoma por dentro. O puede con las
chaperonas de histonas cambiar parcialmente los núcleos de nucleosomas.
Puede actuar con las enzimas que son las más importantes incluso más que el complejo
remodelador. Estas son las enzimas modificadoras de la histonas fundamentalmente acetilando y
desacetilando las histonas.
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¿CÓMO ACTUAN LAS ENZIMAS MODIFICADORAS DE HISTONAS?
Las enzimas modificadoras de histonas son aportadas por ciertos complejos

coactivadores/correpresores alterando así la descondensación/condensación de los nucleosomas
y exponiendo o no, regiones adicionales del DNA a la maquinaria de la transcripción.
Ciertos moduladores aportan enzimas acetiladoras que modifican covalentemente los extremos
N-terminales de las lisinas de las colas de las histonas, catalizando la transferencia de grupos
acetilo desde el acetil-CoA a esos residuos N-terminales de las lisinas. Las enzimas acetiladoras
se denominan: acetil-transferasas de histonas (HAT), acogen en su centro activo el N-terminal
de la lisina y lo acetilan.
Ciertos correpresores hacen lo contrario: desacetilar a través de las enzimas deacetilasas de

histonas (HDAC).
NUCLEOSOMA MOSTRANDO PARTE DE LAS COLAS DE LAS HISTONAS
COMPLEJO ACETIL-TRANSFERASA DE HISTONAS (cHAT)
Catalizan la transferencia del grupo acetilo de la acetil-CoA al N-terminal de lisina de las colas
de las histonas.
TRANSFERENCIA DEL GRUPO ACETILO DE LA ACETIL-COA AL N-

TERMINAL DE LAS LISINAS DE LAS COLAS DE LAS HISTONAS POR LAS
ACETIL-TRANSFERASA DE HISTONAS
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Con estas reacciones, se pueden los grupos positivos de las histonas y se pierden las uniones con
los grupos fosfatos. Esto ayuda a la apertura del DNA.
¿QUÉ CONSECUENCIAS PROVOCA LA ACETILACIÓN DE LAS LISINAS

DE LAS COLAS DE LAS HISTONAS?
A pH fisiológico, la lisina presenta un grupo NH3+ y la adición de un grupo acetilo genera un

grupo amida: -NH-CO-CH3 sin carga.
Este cambio sobre las lisinas reduce básicamente la afinidad de la cola y de todo el complejo de
histonas hacia el DNA.
Además, los residuos de lisina acetilados, son reconocidos por un tipo de dominio de unión de
acetil-lisina, específico que se llama bromodominio. Este dominio especifico se haya presente
en algunos de estos complejos de remodelación de la cromatina y también el factor general de
transcripción TFIID y está especializado en reconocer esta marca particular de las histonas.
La acetilación de las colas de las histonas proporciona además un mecanismo para la

interacción a otros componentes con la maquinaria de la transcripción.
ESTRUCTURA DE UN BROMODOMINIO
Las hélices del bromodominio acogen a la histona H4 acetilada.
ALGUNOS COMPLEJOS COACTIVAODRES/CORREPRESORES QUE

ENGLOBAN FUNCIONES REGULADORAS Y REMODELADORES DE LA
CROMATINA
Complejos correpresores:
- SMRT (mediador silenciador de los receptores de ácido retinoico y receptor tiroideo)

- NCoR (co-represor receptor nuclear)
- Complejo de deacetilasas de histonas (cHDAC) solo o con las dos anteriores o con
ZNF366, RIP140, etc…
Complejos coactivadores:
- La familia SNF/SW1 que incluye a CBP/p300 junto a actividad acetil-transferasa de

histonas (HAT) acetilando y remodelando la cromatina.
- La familia SRC/p160: coactivador receptor esteroidico (SRC-1, -2, -3) junto a actividad
acetil-transferasa de histonas (HAT) ídem.
- Complejo relacionado con la activación de la RNA pol II y el inicio de la transcripción.
Reclutando nuevas proteínas TBP, TAF, TIF.
OTRAS MODIFICACIONES DE LAS COLAS DE LAS HISTONAS:

METILACIÓN
Hemos visto que las lisinas de las colas pueden acetilarse/desacetilarse. La acetilación elimina la
carga positiva de las lisinas mientras que la desacetilación la revierte.
124
Las lisinas pueden también metilar/desmetilar en tres grados diferentes (mono, di, tri). Estas
metilaciones llevan a cabo las enzimas: metil-transferasas y su desmetilación las enzimas:
desmetilasas de histonas.
Una lisina metilada no puede ser acetilada y a la inversa. Esto es un mecanismo de control de la
acetilación de las lisina y de los mecanismos subsiguientes.
Otras modificaciones en las que no entramos incluyen: fosforilación de serinas y treoninas,

mono y dimetailación de la arginina, adición de ADP-ribosa al ácido glutámico y la adición de
un grupo ubiquin, sumoil o biotina a la lisina.
SUMA DE MECANISMOS DE ACTIVACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN

SOBRE UN DNA EUCARIOTA CON SUS NUCLEOSOMAS
La proteína de activación génica se une a la cromatina se une el complejo de remodelación de

la cromatina y se produce la remodelación de la cromatina. Seguidamente se unen las enzimas
de remodelación de histonas se produce modificación covalente de histonas.
A continuación entran otras proteínas activadoras las proteínas activadoras adicionales se

unen a la región reguladora del gen.
Entre el mediador, los factores generales de transcripción de la RNA polimerasa y se produce el

ensamblaje del complejo de preinicio en el promotor. Finalmente entran otras proteínas de
activación génica y se produce reordenación de las proteínas en el complejo de preinicio.
Finalmente se inicia la transcripción.
Este orden de entrada de los elementos se puede alterar, lo importante es que todos los
elementos participan conjuntamente para que se produzca la transcripción.
EL PROPIO DNA TAMBIÉN PUEDE METILARSE
Esto tiene lugar por la metilación de la citosina (dando 5-metil citosina) en los múltiples pares
CG del DNA por las enzimas metil-transferasas de mantenimiento. Esta metilación
no altera al apareamiento de bases.
Se ha observado que un determinado patrón de metilación puede ser heredado tras

la replicación (metilación de mantenimiento). Esto es un hecho epigenético, y su
existencia es dinámica a lo largo del desarrollo.
Todavía no se conoce en detalle como la metilación del DNA ayuda a reprimir la

expresión génica. Hay dos principales hipótesis:
- La metilación del DNA en la zona promotora podría interferir directamente

con la unión de otras proteínas necesarias para el inicio de la transcripción.
- Hay un repertorio de proteínas que se unen específicamente al DNA
metilado bloqueando el acceso de otras proteínas.
Un reflejo de la importancia de la metilación del DNA en humanos es la gran

implicación que tienen los errores de este mecanismo en la progresión del cáncer.
125
SILENCIAMIENTO GÉNICO
Es una forma especializada de represión que puede propagarse por la cromatina y desactivar
numerosos genes sin necesidad de que cada uno porte sitios de unión para receptores
específicos.
Está totalmente asociado a la heterocromatina muy densa con histonas desacetiladas y

metiladas.
La metilación del DNA sería también un marcador de las regiones del genoma que están
“silenciadas”.
Un gen insertado al azar en el genoma de un mamífero con frecuencia se “silencia” porque se

incorpora en la cromatina densa “heterocromatina”. Pero si se colocan “aisladores” corriente
arriba y corriente debajo de ese gen estos lo protegen contra el silenciamiento.
IMPRONTA GENÓMICA/ACTIVIDAD GENÓMICA HEREDABLE/

“GENOMIC IMPRINTING”
Es un fenómeno mediante el cual un gen se expresa o no en un individuo en desarrollo, en

función del progenitor del que procede.
Somos seres diploides y contenemos un grupo de genes heredados del padre y otros de la madre.
La expresión de una minoría de genes depende de ese origen diferencial.
Se suele usar la metilación del DNA como marca distintiva entre las dos copias de un gen que
de otro modo serían idénticas.
Se sabe que existe una oleada de desmetilación tras la fecundación y la metilación diferencial
posterior ayudaría a recordar el origen de ese gen.
Generalmente la impronta por metilación “silencia” pero a veces puede activar un gen.
No conocemos por qué se produce la impronta en el genoma.
126
TEMA 31: RECEPTORES NUCLEARES
Los receptores nucleares se clasifican en:
- Receptores endocrinos: son los más conocidos.

- Receptores huérfanos adoptados: demostrado su ligando.
- Receptores huérfanos enigmáticos: no están seguros del ligando.
- Receptores huérfanos: sin ligando conocido.
Los receptores endocrinos son los receptores de hormonas esteroidicas. Tradicionalmente

estudiados, se conoce poco de sus funciones genómicas. Estos receptores están englobados
porque son receptores nucleares, en algunos casos son de inicio nuclear. Algunas hormonas son
capaces de pasar la membrana nuclear y en otros casos pasan la membrana citoplasmática y se
unen a un receptor citoplasmático y después pasar al núcleo.
Los receptores endocrinos suelen actuar en forma de homodímeros.
Los receptores heterodímericos: hormonas tiroideas, vitamina D y ácido retinoico.
EL 17 BETA-ESTRADIOL Y SU RECEPTOR ER (ALFA, BETA)
PRINCIPALES ACCIONES BIOLÓGICAS
- Establecimiento y mantenimiento de la función reproductora.

- Desarrollo y diferenciación de la glándula mamaria.
127
- Regulación del eje hipotálamo-hipofiso-gonadal

- Metabolismo y homeostasis del hueso
- Influencia en la memoria y la capacidad cognoscitiva cerebral
- Preservación de la integridad de los vasos sanguíneos
- Modulación de la inmunidad
- Regulación de la glucemia
- El mecanismo de estas acciones es mayoritariamente genómico, implica la unión a su
receptor y controla la expresión en cada caso de genes específicos.
LOCALIZACIÓN DE RECEPTORES
- Útero
- Glándula mamaria
- SNC
- Sistema cardiovascular
- Hueso
- Sistema inmune
- Tracto gastrointestinal
- Tracto urogenital
- Riñón
- Pulmón
- Hígado
- Múltiples líneas celulares
El estradiol atraviesa la membrana citoplasmática y se une a un receptor citoplasmático que está

unido a las proteínas HSP90. El receptor de estrógenos sufre tras la unión de la hormona un
pérdida de la proteína de estrés y se dimeriza con su propio homólogo. Entonces en la forma
homodimerizada reconoce la secuencia ERE y a través de esa unión a la secuencia, afecta a la
maquinaria transcripcional de la RNA pol con los factores generales, el mediador, los
coactivadores. Esto hace que se estimulen o se repriman los genes.
ER puede unirse al RER minimal consensus o al ERE optimal binding sequence.
5`CA/GGGTCAnnnTGACCT/CG3`
COMPARACIÓN DE LOS DOMINIOS DEL ERALFA Y ER BETA
Tienen tres zonas: zona de unión al DNA, zona de unión a la hormona, y una zona que puede
ser activada o reprimida.
El ER alfa está codificado por un gen del cromosoma 6.
El ER beta está codificada por un gen del cromosoma 14.
La zona AF-1 que es la zona de regulación en el extremo N-terminal. La segunda zona es la

zona DBD que es la zona de unión al DNA que es la zona de los “dedos de zinc”. Luego
tenemos una zona Hinge o de bisagra. Finalmente la zona de unión de la hormona en el extremo
C-terminal que se llama LBD/AF-2.
128
DEDOS DE ZINC
El átomo de Zinc suele ir unido a cisteína o histidina. Entre zona alfa y beta. Generalmente hay
más de un dedo de zinc. El receptor para los estrógenos suele tener dos dedos de zinc.
Podemos tener represión porque no se ha unido la hormona o porque hay complejos

corepresores como el SMRT o el NCOR que son corepresores. O también son de HDAC. Todo
esto ayuda en la represión.
Podemos tener activación porque se ha unido la hormona, la presencia de coactivadores que

activan la expresión del gen.
ALGUNOS GENES REGULADOS POR ESTRÓGENOS
- Vitelogenina A2 de Xenopus, pollo

- Receptor de insulina humana
- ……..y muchos más que no sé yo si debemos estudiar, pero como sea así espero que
suba las diapositivas porque sino se lo va a aprender su padre.
El estradiol unido a su receptor reprime transcripcionalmente la expresión del gen del receptor
de insulina humana (hIR). Puede darse el efecto dosis y efecto temporal.
129
TEMA 32: MECANISMO DE CONTROL

POST-TRANSCRIPCIONAL
ETAPAS EN LAS QUE SE PUEDE CONTROLAR LA EXPRESIÓN GÉNICA
INHIBICIÓN DEL PROCESAMIENTO (SPLICING) DEL PRE-mRNA EN EL

LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO
Es una enfermedad autoinmune en la que se producen anticuerpos contra los propios complejos
RNA-proteína (sn-RNP) que participan en el splicing dificultando o inhibiendo totalmente su
acción.
Los anticuerpos forman complejos de alto PM con los snRNP que se depositan en vasos y
tejidos en especial en el riñón.
Los órganos responden con una inflamación, deposito anormal de tejidos conjuntivos,
esclerotización y pérdida final de función.
No existe un tratamiento etiológico, la causa principal de muerte es un fallo renal.
Las mujeres se ven afectadas 10 veces más que los hombres.
Muchos pacientes de Lupus presentan también anticuerpos contra otros antígenos nucleares
como: DNA, histonas, proteínas no-histonas, etc…
INHIBICIÓN DEL PROCESAMIENTO DEL PRE-mRNA EN CIERTAS

TALASEMIAS
Las hemoglobinopatías se caracterizan por una deficiencia parcial (talasemia menor) o total
(talasemia mayor) en la síntesis de las cadenas alfa y beta de la globina.
En los genes de la globina puede haber múltiples mutaciones, entre ellas, las que provocan la
inactivación de los lugares de splicing existentes o la formación de otros nuevos
130
También otras mutaciones pueden destruir la señal de poliadenilación originando un 3`más

corto.
En consecuencia se produce una disminución de la síntesis de hemoglobina en eritroblastos y

reticulocitos lo que provoca una disminución del transporte de oxígeno por los eritrocitos
maduros.
SPLICING ALTERNATIVO
Es un mecanismo para crear diversidad proteica.
A partir de un mismo gen, además de perderse los intrones por splicing normal, los exones que
quedan se pueden cortar y empalmar en distintas combinaciones de exones y distinta ubicación
de colar para crear distintos mRNA maduros.
Así se generan distintas proteínas en función del tipo de tejido, del estado de desarrollo, de las
vías de señalización…
Conocer mejor los mecanismos implicados en la selección de los lugares de corte es

fundamental para comprender porque un pre-mRNA puede dar lugar a varias proteínas.
SPLICING ALTERNATIVO DEL PRE-mRNA DEL GEN DE LA

CALCITONINA
El pre-mRNA del gen de la calcitonina puede dar lugar a la expresión de dos proteínas distintas:
- En el tiroides: se expresa una proteína pequeña que es la calcitonina. Esta es una

hormona peptídica que junto a otras, regula el metabolismo del calcio y del fósforo.
- En el cerebro: se expresa una proteína más grande que es la CGRP (proteína relacionada
con el gen de la calcitonina). Es una hormona polipeptídica que actúa como
vasodilatador.
131
SPLICING ALTERNATIVO DEL PRE-mRNA DEL GEN DE LA ALTA-

TROPOMIOSINA DE RATA
La alfa-tropomiosina es una proteína que participa en la regulación de la contracción de las

células musculares.
El transcrito primario puede ser procesado de diversas maneras dando lugar a distintos mRNA
que a su vez originarán proteínas diferentes.
Las puntas de flecha roja indican los posibles sitios de escisión del pre-mRNA y adición de
colas poliA.
CONTROL DEL RNA MADURO DEL TRANSPORTE AL CITOPLASMA
Hemos visto que las moléculas de RNA sufren un extenso procesamiento, ahora mismo que los
fragmentos sobrantes (intrones, secuencias de RNA 3`, o RNA mal procesado) se degradan en el
núcleo y que estas degradaciones debe completarse antes de la exportación al citoplasma.
Se estima que en mamíferos solo abandona el núcleo celular el 20% del RNA fabricado.
El mRNA maduro sale del núcleo al citoplasma a través de los poros nucleares y allí sufre
procesos de degradación y/o se une a los ribosomas para la traducción.
CONTROL DE LA DEGRADACIÓN DE LOS mRNA EN EL CITOPLASMA
Cuando el mRNA llega al citoplasma puede activarse su degradación mediante los siguientes
mecanismos:
1.- Hay un acortamiento gradual de la cola poli-A mediante una exonucleasa y cuando la cola
poli-A llega a un acortamiento crítico (aproximadamente 25-30 nucleótidos en humanos) hay
dos vías divergentes:
- la caperuza 5ès eliminada “decaping” y ese RNA sin cabeza es rápidamente

degradado 5`3`
- la degradación sigue avanzando por el extremo 3`.
La mayoría de los mRNA usan ambos mecanismos para su degradación.
132
2.- Hay un mecanismo menos común, los sitios de unión de proteínas específicas en la
secuencia 3ÙTR (región no codificante que no se va a traducir). Estos sitios unen nucleasas
específicas capaces de incrementar la velocidad de corte de la cola poli-A y la eliminación de la
caperuza a la vez.
La vida media de un mRNA varía entre 1-10h.
1.- ACORTAMIENTO GRADUAL DEL mRNA MADURO EN EL

CITOPLASMA
2.-REGIONES UTRs DE LOS mRNA MADUROS. REGULACIÓN A TRAVÉS

DE ELLAS.
Son las regiones no codifcantes (para traducción) de estos mRNA maduros.
El 5ÙTR se extiende desde la caperuza 5`hasta el codón que inicia la síntesis de la proteína.
El 3ÙTR se extiende desde el codón stop (donde termina la síntesis de una proteína) hasta el
inicio de la cola poli-A.
Se han localizado ciertas secuencias en los 3ÙTR de ciertos mRNA que favorecen su
degradación a través de la unión a estas secuencias de determinadas proteínas reguladoras. Las
secuencias son: pentámeros AUUUA y dominios ricos en U (poliU).
Por ejemplo: el mRNA maduro del protooncogen C-myc tiene: 7 Pent y poli U.
El de C-fos tiene: 5 pent y 1 poli U.
El del receptor beta2-adrenérgico: 1 pent y 1 poli U.
El del receptor de insulina humano: 9 pent y 3 poli U.
HAY ALGUNAS SITUACIONES FISIOLÓGICAS DE INACTIVACIÓN DE LA

DEGRADACIÓN DEL mRNA CITOPLASMÁTICO
Por ejemplo, en los ovocitos en maduración, la degradación se inactiva para que el ovocito
pueda tener grande cantidades de mRNAs y así prepararse para la fecundación.
Estos mRNAs con colas poli-A de entre 10-30 residuos, se almacenan en el citoplasma del
óvulo y no se traducen esperando el momento para hacerlo más adelante.
133
Ese momento le llega al ovocito justo después de la fecundación que es cuando la célula más
necesita de esas proteínas codificadas por esos mensajeros.
Entonces una polimerasa poliA citosólica añade más poli-A al extremo 3`de esos mRNA
almacenados alargando su cola y así estimulando su traducción.
INTERFERENCIA DEL RNA
Recientemente se ha observado que ciertos RNAs no codificantes, participan de forma habitual

en la expresión génica:
- miRNAs
- siRNAs
Se ha demostrado que los humanos tenemos aproximadamente 400 tipos diferentes de miRNA
que regulan aproximadamente 1/3 de genes humanos codificantes de proteínas.
Su mecanismo de acción implica un apareamiento con mRNA específicos que poseen

secuencias complementarias, disminuyendo así la estabilidad y la traducción de estos mRNA.
MicroRNA (miRNA)
Un miRNA es generado por la RNA polimerasa II y se madura adquiere Cap y cola poli-A de
forma tradicional. Después toma estructura de doble cadena y se recorta de forma tradicional.
Todo esto tiene lugar en el núcleo.
Una vez en el citosol, la endonucleasa Dicer le vuelve a recortar dando lugar al denominado
miRNA de doble cadena. A este miRNA se le une la proteína Argonauta junto con otros
componentes de un complejo silenciador mediado por RNA, denominado RISC (RNA inducing
silencing complex). Este complejo corta y descarta una de las dos cadenas del miRNA. La otra
cadena, guía al RISC en la búsqueda de un mRNA diana que presente secuencias
complementarias en la zona 3ÙTR, para aparearse con él.
Si la unión miRNA/mRNA diana es extensa la proteína Argonauta corta la cola poli-A del
mRNA diana y lo expone a rápida degradación por exonucleasas. El RISC se rehusa muchas
veces.
Su la unión es corta (de unos 7 nucleótidos) esto conduce a la inhibición de la traducción de ese
mRNA diana y a su transferencia a los “cuerpos P de procesamiento” donde finalmente es
degradado.
134
La proteína Argonauta unida al apareamiento miRNA/mRNA.
CUERPOS DE PROCESAMIENTO (CUERPOS P)
Son estructuras citosólicas dinámicas formadas por grandes ensamblajes de mRNA y enzimas
donde tiene lugar la destrucción final de estos miRNA y de la mayoría de los mRNA.
CARACTERÍSTICAS QUE CONVIERTEN A LOS miRNA EN

REGULADORES MUY ÚTILES DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
1) Un solo miRNA puede actuar de forma catalítica regulando un conjunto completo de

diferentes mRNA si estos contienen en sus 3ÙTR una secuencia común a todos ellos y
rehusando el RISC del primer miRNA una vez liberado.
2) La regulación por los miRNA puede ser sumatoria. Es decir, cuando el apareamiento de
bases entre un miRNA y un mRNA no consigue activar el corte de este último, la unión
adicional de otro miRNA al mismo mRNA, si puede producir una mayor reducción de
esa traducción.
EL RNA DE INTERFERENCIA ES UN MECANISMO DE DEFENSA DE LA

CÉLULA
Muchos de los elementos de interferencia que hemos visto tienen una segunda función como
mecanismo de defensa de la célula en la degradación de moléculas de RNA foráneas
particularmente las de cadena doble como las que han podido dejar los virus y transposones en
la célula, al menos de forma transitoria, tras infectarla. (Fire y Melo, Nobel de Medicina 2006).
135
Es un mecanismo antiguo desde el punto de vista evolutivo que se da en una gran variedad de
organismos.
En esa respuesta de defensa participan los RNA de interferencia pequeños. (siRNA: smal
interfering RNA).
MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS siRNA
La presencia de RNA de doble cadena en la célula, activa una respuesta de interferencia

atrayendo a la enzima Dicer que corta el RNA de doble cadena en fragmentos pequeños de
aproximadamente 23 pares de nucleótidos denominados RNA de interferencia pequeños
(siRNA). Estos se unen a la proteína Argonauta y otros componentes del RISC. La proteína
Argonauta corta una de las cadenas de estos siRNA y la desecha. A partir de aquí hay dos vías:
- En la primera vía, la molécula de siRNA de cadena sencilla dirige al RISC de nuevo

hacia moléculas de RNA complementaruas producidas por los virus o transposones.
Tras el acoplamiento la proteína Argonauta destruye esas moléculas.
- En la segunda vía, los siRNA cortados por Dicer, se ensamblan en otro complejo de
proteínas denominado RITS (RNA- inducing transcripcional silencing) que incluye a
Argonauta. Este complejo utilizando siRNA de cadena sencilla, se une a nuevos
transcritos de RNA complementario a medida que los sintetiza la RNA pol II. Así
situado, RITS atrae proteínas que desacetilan las histonas cercanas, dirigiendo la
formación y expansión de la heterocromatina e impidiendo la transcripción. En algunos
casos RITS también puede inducir la metilación, reprimiendo aún más la expresión
génica.
136
EL RNA DE INTERFERENCIA ES UNA HERRAMIENTA EXPERIMENTAL
El RNA de interferencia puede tener futuro en el tratamiento de enfermedades causadas por

expresión errónea de un gen, desactivando ese gen de forma experimental introduciendo
moléculas de siRNA complementarias.
Esto ofrece una gran esperanza médica. Hay en marcha ensayos clínicos.
Pero hay limitaciones:
- No se inactivan todos los genes.

- Ciertos tejidos pueden ser resistentes.
- Puede haber homologías en las secuencias entre genes, con efectos no deseados etc
137
TEMA 33: REGULACIÓN DE LA

TRADUCCIÓN
VARIOS PROCESOS YA COMENTADOS QUE CONTROLAN LA
TRADUCCIÓN
 Cambios en la estabilidad de los mRNA por sus UTR.

 Inicio diferencial de la traducción en diferentes AUG.
 RNAs de interferencia.
El factor eIF2 es un factor importante en la regulación de la traducción.
¿CÓMO SE REGULA EL FACTOR eIF2 LA TRADUCCIÓN?
Vimos que este factor forma un complejo con GTP e interviene en la unión del metionil-tRNAi
a la sub ribosoma pequeña. Tras la formación del complejo de 43S y la búsqueda en el mRNA
del AUG, el eIF2 hidroliza GTP a GDP. Esto induce un cambio de su conformación y posterior
salida de la subunidad pequeña antes de que se incorpore la subunidad grande.
Ahora diremos que debido a que el eIF2 se une fuertemente al GDP es necesaria una proteína
intercambiadora de estos nucleótidos, esta es la eIF2B. Esta proteína libera el GDP permitiendo
que el eIF2 se pueda unir a otras moléculas de GTP y su reutilización.
CICLO DE INACTIVACIÓN/ACTIVACIÓN DEL eIF2
¿Cómo se inhibe la traducción por este mecanismo?, la fosforilación del eIF2 inactiva al Eif2b y
lo atrapa, evitando que haga su función intercambiadora GDPGTP, disminuyendo así la
traducción.
138
SITUACIONES BIOLÓGICAS DE INHIBICIÓN DE LA TRADUCCIÓN
Parece que la mayor parte de la disminución de la traducción se debe a la fosforilación del eIF2
por parte de proteínas quinasas específicas que responden a distintos cambios en las condiciones
del entorno que incluyen una gran variedad de situaciones de estrés celular como: carencia de
factores de crecimiento, infección por virus, o choque térmico, etc…
A nivel de ciclo celular, la disminución de la traducción por fosforilación de eIF2 también es

importante porque forma parte del mecanismo por el cual las células pueden ser inducidas a
entrar en G0.
(estado estable no proliferativo donde la velocidad de síntesis proteica total se reduce a una
quinta parte de la velocidad habitual en las células en proliferación).
LOCALIZACIÓN DE LA QUINASA TOR
La quinasa TOR está situada en las vías de señalización de los factores de crecimiento
extracelulares que se unen a receptores en la superficie celular y activan vías de señalización
intracelulares.
Estas vías provocan la acumulación de proteínas y de otras macromoléculas ya que aumentan la

velocidad de su síntesis y reducen la velocidad de su degradación.
Estas vías también inducen el consumo de nutrientes y la producción de ATP necesario para
impulsar el aumento de la síntesis proteica.
En estas vías participa la PI3-quinasa, la cual añade un fosfato procedente del ATP en la
posición 3 de los fosfolípidos de inositol (PIP3) en la membrana plasmática.
Este PIP3 recluta 2 proteínas quinasas de la membrana a través de los dominios PH: la Akt
(PKB) y la PDK1 que conduce a la activación de Akt (PKB) por PDK1 y la quinasa TOR (en
uno de sus dos formatos).
139
mTOR
La serina/treonina proteína quinasa TOR en mamíferos se llama mTOR y forma parte de dos
complejos proteicos:
- Uno de ellos contiene a la proteína quinasa raptor que es la diana de la rapamicina una
toxina bacteriana que la inactiva y que se utiliza clínicamente como fármaco
inmunodepresor y anticancerígeno (rifampicina). Mediante este complejo, mTOR
estimula el crecimiento celular promocionando la producción de ribosomas y la síntesis
de proteínas y también inhibiendo la degradación de estas proteínas.
- El otro complejo contiene la proteína rictor, que es insensible a la rapamicina y colabora
en la activación de Akt (PKB) inhibiendo la apoptosis.
¿CÓMO ACTÚA EL SISTEMA mTOR REGULANDO LA TRADUCCIÓN?
mTOR activa muchas dianas celulares que estimulan procesos metabólicos y aumentan la
síntesis proteica.
Una de las dianas es la S6 quinasa (S6K) que fosforila a la proteína ribosómica S6, aumentando
la capacidad de los ribosomas para traducir un conjunto completo de moléculas de mRNA la
mayoría de las cuales codifican componentes ribosómicos.
Otra diana son las proteínas reguladoras de genes como Mye y otras muchas las cuales activan
la transcripción de múltiples genes que activan el metabolismo y el crecimiento celular.
Otra diana es la 4EBP que es un inhibidor de uno de los factores de inicio de la traducción el
eIF4E (que reconoce la Cap), la inhibición de este inhibidor 4EBP, aumenta la traducción.
Los nutrientes extracelulares como los aas también activan a mTOR mediante un mecanismo
desconocido.
140
TEMA 34: METODOLOGÍA

MOLECULAR (VIII): UTILIZACIÓN DE
PLÁSMIDOS
Plásmido con un promotor y el
gen de la hormona de
crecimiento de rata.
PRODUCCIÓN Y DETECCIÓN DE UNA DETERMINADA PROTEÍNA

UTILIZANDO UN PLÁSMIDO COMO VECTOR DE EXPRESIÓN
En este ejemplo el vector lleva insertado la secuencia codificante de la enzima DNA helicasa.
La transcripción de la secuencia de esta enzima está bajo el control de un promotor vírico que se
activa únicamente a temperatura = > a 37 ºC.
Se crece en bacterias a 25ºC (donde no hay producción de helicasa) y también a 42 ºC durante

diferentes tiempos.
La proteína se analiza en los lisados de bacterias utilizando un gel de poliacrilamida con SDS.
Se observa que la helicasa se convierte en la proteína más abundante del lisado a esas altas
temperaturas.
141
UTILIZACIÓN DE UN VECTOR DE EXPRESIÓN PARA LA OBTENCIÓN DE

UNA DETERMINADA PROTEÍNA
INSULINA PORCINA
Aislamiento de la insulina de páncreas de perross pancreatomizados. Antes de los años 70
se usaron métodos químicos. Obtención de insulina semisintética humana partiendo de la
insulina porcina. Se sustituía la Ala 30 de la cadena B por Thr para conseguir la insulina
“humanizada”.
Después de los años 70 se usó la tecnología del DNA recombinante aplicada a uso
industrial. Hay varias patentes, entre ellas crear un híbrido en un plásmido con promotor
apropiado que contenga el gen de la triptófano -sintetasa seguido del codón Met y seguido
del gen que codifica pata la proinsulina humana. En E. Coli se expresa entonces la
“proteína quimérica”: triptófano-sintetasa-Met-proinsulina. Se extrae de las bacterias y se
corta con bromuro de cianógeno que corta específicamente por debajo de la Met quedando
la proinsulina que luego también se corta.
Fragmento C de 33 residuos (de la Proinsulina: 33 +51 = 84 aa) iría unido al extremo NH2
de la cadena A y al COOH de la cadena B.
142
SÍNTESIS DE PROINSULINA EN BACTERIAS
Se extrae del páncreas el mRNA de proinsulina. Se suele utilizar la transcriptasa inversa

para obtener cDNA de proinsulina y después se une a un plásmido como vector de
expresión.
Tras la entrada en determinada bacteria, ésta es capaz de producir proinsulina y a posteriori

se corta el péptido C y se obtiene la insulina.
143

GENÉTICA MOLECULAR (IX):
TERAPIA GÉNICA
TERAPIA GÉNICA
La terapia génica sería la introducción de un gen normal cuando el otro no existe o es

defectuoso.
Se comenzó por los años 90 en enfermedades monogénicas, es decir, causadas por eficiencia en
un solo gen. Ejemplo: inmunodeficiencia severa combinasa, fibrosis quística, distrofia muscular
de Duchenne, etc..
Esta técnica tiene tres características principales:
- Los genes terapéuticos se deben insertar en las células apropiadas. Hay enfermedades
que son concretas de un órgano, por lo que se tienen que insertar ahí, y eso es muy
complejo.
- Deben permanecer activos en el paciente durante mucho tiempo. Sabemos que los genes
se integran “mal” y casi siempre en zonas de heterocromatina, se silencian…por lo que
esto supone muchísimos problemas.
- Debe reducirse al mínimo cualquier efecto secundario adversi. Como decimos a
continuación, por el vector que los transporta puede haber muchos problemas cuando se
inyecta.
TIPOS DE VECTORES PORTADORES DEL GEN TERAPÉUTICO
La utilización de virus de RNA (retrovirus) para la introducción de una copia sana de gen se ha
usado en muchos protocolos pero tiene muchos problemas.
Esto es así, porque el nuevo gen se integra de forma aleatoria en distintas partes del genoma, o
no se integra bien y además produce la proteína por muy corto periodo de tiempo antes de
desactivarse. Puede producir inflamación o incluso el desarrollo de cáncer.
También se ha probado introducir el gen sano en:
- virus de DNA
- liposomas
-transposones y otros
144
Genoma RNA del retrovirus
Con el gen terapéutico
Células empaquetadoras formadoras de

nuevos virus con el gen terapéutico
Células del paciente infectadas con los

nuevos virus con el gen terapéutico.
Se han usado:
- Retrovirus: tiene una expresión terapéutica estable. Inserción del genoma viral en la
célula huésped. Pero el gen terapéutico no puede exceder de cierto tamaño. El problema
es que se produce una inserción al azar y que hay posible recombinación con virus
endógenos.
- Adenovirus: genes terapéuticos más grandes. Localización extracromosómica del
genoma viral. No se inserta en el genoma. Puede dar respuesta inmune del hospedador,
que puede neutralizar el virus, además no produce una expresión a largo plazo.
- Virus asociados a adenovirus.
- VHS
145
TERAPIA CON CÉLULAS MADRE

CLONACIÓN REPRODUCTIVA Y TERAPÉUTICA
CÉLULAS MADRE EMBRONARIAS (ES) “EMBRYONIC STEM CELL

LINES”
Limitada capacidad de diferenciación.
Se obtienen generalmente de los óvulos fecundados congelados sobrantes de los ciclos de

fecundación asistida.
Estas células suponen en principio una fuente inagotable de material que podría ser usado en un
futuro no lejano para reemplazar y reparar diferentes tejidos humanos:
- Las células nerviosas que mueren en enfermos de Parkinson.

- Las células secretoras de insulina que sean destruido en los diabéticos tipo I.
- Las células cardíacas muertas en un ataque al corazón.
Peor pueden producir rechazo inmunológico y ciertos tumores benignos (teratomas) asociados a
la proliferación de estas células madre embrionarias (CME). Por ello sería mejor usar células
obtenidas del mismo donante a través de la clonación terapéutica que ya hemos comentado…
Estas CME en principio pueden ir hacia distintos tipos celulares. Esta idea teórica se está
intentando a llevar al laboratorio utilizando distintas hormonas que funcionan como factores de
transcripción.
146
PRODUCCIÓN DE CÉLULAS DIFERENCIADAS A PARTIR DE UN CULTIVO

DE CÉLULAS ES DE RATÓN
CÉLULAS MADRE ADULTAS
Utilizar las células madre que hoy en día se sabe que producen numerosos tejidos adultos
(células madre adultas) dirigiéndolas en cada caso al tipo celular especializado.
En el adulto las células madre son específicas de cada tejido y permanecen fieles a sus orígenes
y no inician la expresión de otro tipo celular distinto.
147
Es decir tienen memoria de su historial de desarrollo.
Así, las células madre hematopoyéticas se pueden usar para sustituir células sanguíneas
alteradas por otras sanas.
Las células madre epidérmicas pueden expandirse en cultivo para la reparación de un tejido.
Las células madre neuronales se pueden manipular en cultivo.
TERAPIA CON ANTICUERPOS ANTI-RECEPTOR
148
TEMA 36: GENÉTICA METABÓLICA

CONTROL DEL METABOLISMO POR UN MIEMBRO DE LA FAMILIA 1 DE
RECEPTORES ENDOCRINOS
EL 17beta- estradiol unido a su receptor ER en forma homodimérica inhibe a nivel

transcripcional la expresión del gen y de la proteína del receptor de insulina. La inhibición de
esta proteína da lugar a la inhibición de la cascada de señalización de la insulina y por tanto de
efectos biológicos de esta hormona como es la oxidación de la glucosa inducida por ella.
El tratamiento con 17 beta-estradiol a células humanas inhibe la oxidación de glucosa basal e

inducida por insulina.
Estamos ante una situación de resistencia a la insulina que in vivo se puede presentar en
mujeres expuestas a altas dosis de estrógenos tanto endógenos como ocurre en el embarazo,
como exógeno tras la toma prolongada por ejemplo de anticonceptivos orales o terapia
hormonal sustitutivas.
CONTROL DEL METABOLISMO POR UN MIEMBRO DE LA FAMILIA 2 DE

RECEPTORES ENDOCRINOS
LA vitamina D unida a su receptor VDR en forma heterodimérica estimula a nivel

transcripcional la expresión del gen y de la proteína del receptor de insulina. La estimulación de
esta proteína da lugar a la estimulación de la cascada de señalización de la insulina y por tanto
de efectos biológicos de esta vitamina como es la oxidación de la glucosa inducida por ella.
El tratamiento con VD a células humanas estimula la oxidación de glucosa basal y estimulada

por insulina.
Estamos ante una situación de aumento de sensibilidad a la acción de la insulina inducida por
vitamina D. dado que datos epidemiológicos muestran que cuando hay deficiencia de vit D hay
entre otras patologías un aumento de diabetes I y II. La prevención de esta deficiencia con esta
vitamina o derivados de esta vitamina, podría mejorar notablemente no solo la salud ósea sino
prevenir ambos tipos de diabetes.
CONTROL DEL METABOLISMO POR LA SUBFAMILIA 3 DE

RECEPTORES HHUÉRFANOS ADOPTADOS
Esta subfamilia de receptores nucleares consta de receptores de baja afinidad (Kd microM)
mientras que los de las subfamilias 1 y 2 eran de alta afinidad (Kd nM).
Sus ligandos son ácidos grasos poliinsaturados o ciertos derivados lipídicos endógenos o
exógenos.
Actúan formando heterodímeros con el primer miembro (RXR) uniéndose a determinados

elementos de respuesta en zonas promotoras de genes diana mediante repeticiones directas de
una secuencia con un espaciador de solo un nucleótido.
Esta familia de receptores y en especial el segundo miembro: el receptor activado de

proliferación de peroxisomas (peroxisome proliferator-activated receptors PPARs con los
149
subtipos alfa, beta/delta, gamma) representa una prometedora diana de drogas contra desordenes
metabólicos de la homeostasis de los lípidos y la glucosa.
EL RXR
El RXR con sus tres subtipos (alfa, beta y gamma), representa el primer receptor de esta
subfamilia.
Su reconocimiento por el ligando 9 cis retinoico (9cis AR) representó la primera adopción de un
receptor nuclear huérfano y dio pie a la llamada “endocrinología inversa”.
Después se ha observado que se puede unir a otros receptores nucleares de esta misma
subfamilia formando heterodímeros, entre ellos los PPARs que vamos a comentar a
continuación, pero también a miembros de la subfamilia 2: el receptor del ácido retinoico
(RAR) y el receptor de la vitamina D (VDR).
LOS PPARs: el PPARalfa
El PPARalfa se une y funciona como un sensor endógeno de ácidos grasos poliinsaturaos. Este
receptor se expresa en hígado, corazón, músculo y riñón. En estos órganos regula la oxidación
de los ácidos grasos y la síntesis de apolipoproteínas.
Es también abundante en la pared vascular y en las células espumosas macrofágicas donde

ejerce acciones anti-inflamatorias y anti-aterogénicas.
Farmacológicamente este receptor es diana de los fibratos corrigen la dislipemia disminuyendo

la mortalidad cardiovascular.
Por tanto, al PPARalfa se le puede considerar como un posible corrector de la dislipemia y la

aterosclerosis.
EL PPAR gamma
El receptor PPARgamma es la diana de la tiazolidinediona clase-TZD de sensibilizadores de

insulina, hoy en día uno de los agentes antidiabéticos orales más importantes.
Este receptor se expresa fundamentalmente en tejido adiposo y es el principal reulador de la

adipogénesis. En este tejido, el mecanismo de acción implicado es su acción sensibilizadora a la
insulina que implica activación de este receptor, un incremento de almacenaje de grasa en el
adipocito y un aumento de la secreción de insulina por el páncreas, sensibilizando ciertas
adipoquinas como la adiponectina.
PPARgamma se expresa poco en el hígado y músculo esquelético pero en ellos también mejora
la sensibilidad a la insulina.
Este receptor también se expresa en macrófagos de células espumosas en ellas parece tener
actividad anti-aterogénica que involucra efectos anti-inflamatorios.
EL PPARGAMMA TIENE DE LIGANDO A LAS TIAZOLIDINEDIONAS (PIOGLITAZONA,

ROSIGLITAZONA)
Incrementan la sensibilidad a la insulina principalmente en el tejido adiposo pero también en

parte en el músculo y en el hígado.
150
Tienen bajo riesgo de producir hipoglucemia y un moderado efecto en el control de la presión

arterial.
Sin embargo, los resultados del estudio RECORD 2009 mostraron un leve aumento del riesgo
de infarto agudo de miocardio en los pacientes tratados con dos combinaciones: la rosiglitazona-
metformina y la rosiglitazone-sulfonilureas. También mayor riesgo de fracturas recibiendo
rosiglitazone que las otras dos.
Otro estudio posterior de 2010, concluyo que la rosiglitazone incrementava el riesgo de infarto
de miocardio y se suspendió su comercialización en 2010 por la Eropean Medicine Agency
(EMA).
La pioglitazone y la rosiglitazones pueden producir retención de líquidos por lo que pacientes

con riesgo de insuficiencia cardíaca deben ser vigilados estrechamente y recibir tratamiento
concomitante con diuréticos.
Recientemente en el año 2011 se demostró un aumento del riesgo de cáncer de vejiga en

aquellos pacientes que utilizaban pioglitazona durante 2 años.
CITOLÓGICAMENTE EL PPARgamma FACILITA LA DIFERENCIACIÓN HACIA

ADIPOCITOS
La diferenciación de células adiposas tiene lugar a partir de fibroblastos y se inicia con la

expresión de 2 familias de proteínas reguladoras (factores de transcripción) de genes: la familia
CEBP(CCAATT/proteína de unión activadora) y PPARgamma (receptor activado de
proliferación de peroxisomas).
Estas proteínas reguladoras actúan conjuntamente regulado la expresión de genes de los

adipocitos: estimulando los que facilitan la lipogénesis e inhibiendo los que inducen la lipolisis
como el del receptor adrenérgico beta 3 y ciertas citoquinas.
EN EL ADIPOCITO EL PPARgamma ACUMULA Y LIBERA LÍPIDOS
Se producen muchas enzimas de importación de ácido grasos y de glucosa para la síntesis de

lípidos (adipogénesis) y se genera una gran acumulación de gotas de grasa fundamentalmente
triacilglicéridos TG.
A la par se producen lipasas, capaces de invertir el proceso mediante hidrólisis de los TG en

ácidos grasos que pueden ser consumidos por otras células.
Este equilibrio es esencial contra la obesidad.
Pero hay otros muchos factores afectando esta obesidad como el número o el tamaño de estos
adipocitos, hormonas, etc…
EL PPAR BETA/DELTA
El PPAR beta/delta es el miembro más tardíamente estudiado.
Parece que se expresa ubicuamente y actúa como un sensor para ácidos grasos poliinsaturados y
partículas de lipoproteínas VLDL.
151
Su activación promueve la oxidación mitocondrial de ácidos grasos, expedición de energía y

termogénesis.
Ratones deficientes de este receptor presentan obesidad y resistencia a la insulina.
Agonistas de este receptor reducen los triglicéridos e incrementan el HDL-colesterol.
En macrófagos, ciertos agonistas de este receptor suprimen la expresión de genes inflamatorios

y así el desarrollo de aterosclerosis.
INDICACIONES FARMACOLÓGICAS DE LOS PPARs
PPARalfa
Enfermedad metabólica que corrige o amilora: dislipemia, aterosclerosis.
Ligando sintético o modulador usado para amilorar la enfermedad: fibrato (gemfibrosil,

fenofibrato, clofibrato).
Otros ligandos sintéticos: WY 14643
PPARgamma
La resistencia a la insulina de la diabetes tipo II
Tiazolidinedionas (pioglitazona, rosiglitazona)
FMOC-L-Leucine
PPARdelta
Dislipemias y aterosclerosis
Ácidos grasos poliinsaturados
GW 501516, KD3010
152
TEMA 37: REGULACIÓN DEL

CRECIMIENTO Y PROLIFERACIÓN
CELULAR
SEÑALIZACIÓN A TRAVÉS DE RECEPTORES DE SUPERFICIE CELULAR
ACOPLADOS A PROTEÍNAS G (GPCR)
Presencia de una serie de dominios trasmembranales hasta 7 y

un dominio de unión al ligando que es extracelular.
A los GPCRs se les unen las proteínas G triméricas. Tras la

unión del ligando al receptor se estimula al receptor y se
estimula la subunidad alfa y por la cooperación con las demás
subunidades beta y gamma.
Tras la estimulación de la proteína G empieza la cascada que

llega al núcleo.
Una vez tenemos la proteína G activado, luego la adenilato

ciclasa en presencia de ATP forma AMPc que es el
estimulador de la quinasa PKA con unidades reguladoras y
unidades catalíticas. Tras el estímulo, la subunidades
reguladoras y las catalíticas se separan y solo las catalíticas
pasan al núcleo.
Estas subunidades son capaces de reconocer a una determinada

proteína que actúa como factor de transcripción CREB y que
reconoce al elemento de respuesta a AMPc (CRE).
El coactivador CBP mejora el funcionamiento y

reconocimiento de CRE. Puede haber de un coactivador aparte
del CBP.
Un incremento de la concentración de AMPc intracelular

puede alterar la transcripción de un gen.
VÍA GPCRs SE INCREMENTA EL CALCIO CITOSÓLICO Y SE ACTIVA LA

PKC
La molécula señal activa al GPCR activando la proteína Gq. La subunidad Gq activada activa a
la fosfolipasa C-beta y que está anclada en la membrana y por ello actúa sobre un lípido de
membrana que es el PI 4,5-bifosfato que está enganchado en la membrana gracias al
diacilglicerol.
La fosfolipasa rompe al lípido de membrana en diacilglicerol e IP3 (inositol trifosfato). El IP3

estimula el canal liberador de Ca2+ sensible a IP3 y se abre el canal produciendo salida de
153
Calcio a nivel intracelular desde el retículo endoplásmico. El diacilglicerol y el calcio permiten

la activación de la PKC.

ACOPLADOS A ENZIMAS
Receptores tirosina
quinasa (RTK)
El factor común de los receptores es que tienen dominios tirosina quinasa y en algunos cortados
que no sé sabe que significado tienen. Los dominios extracelulares pueden ser dominios ricos en
cisteínas o bien dominios semejantes a inmunoglobulinas. A través de los dominios tirosinas
quinasas son capaces de autofosforilarse y trasmitir la señal.
La vía del factor EGF es el más estudiado y que se relaciona con el cáncer.
FAMILIA DE RECEPTORES DEL FACTIR DE CRECIMIENTO

EPIDÉRMICO EGF
154
• Tipo 1: EGFR (ErbB1; HET1). Es el más tradicional.
• Tipo 2: ErbB2 (HER, neu)
• Tipo 3: ErbB3 (HER3). No tiene actividad tirosina-quinasa.
• Tipo 4: ErbB4 (HER4)
Guardan una alta homología en la secuencia.
Activan la supervivencia, crecimiento, proliferación o diferenciación, adhesión y migración en

varios tipos celulares.
LIGANDOS DE LOS EGFRs
Ligandos que se unen solo a EGFR: el EGF, el factr de crecimiento transformate alfa (TFG-alfa)
y la anfiregulina.
Ligandos que se unen tanto a EGFR como a ErbB4: la betacelulina (BTC), el EGF de unión a
heparina (HB-EGF) y la epiregulina.
El ErbB2 no tiene ligando conocido propio pero es la pareja preferido para la

heterodimerización.
Ligandos que se unen a ErbB3 y ErbB4: las neuregulinas 1 y 2. Los que se unen solo a ErbB4:
neuregulinas 3 y 4.
Algunos de estos ligandos se secretan autocrina- y otros paracrinamente.
Algunos de estos ligandos son producidos como precursores transmembrana que deben ser
liberados por proteasas de superficie (ADAMS: metaloproteasas-desintegrasas) para convertirse
en ligandos solubles.
COMIENZO SEÑALIZACIÓN DEL EGF
¿CÓMO SOS ACTIVA A RAS?
Sos es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (también se llama GEF) se une a Ras
(proteína G pequeña) y abre su bolsillo o centro de unión a nucleótidos permitiendo la salida de
GDP y la entrada de GTP.
155
En esta forma Ras unida a GTP se puede unir y activar a otras proteínas, incluidas las tres
proteínas quinasas que siguen.
Pero además Ras presenta una actividad GTPasa intrínseca, la cual le sirve para inactivarse a sí
misma, finalizar la señal y retornarla a su estado primitivo. Esta actividad es lenta pero se
incrementa mediante proteínas auxiliares llamadas proteínas activadoras de GTPasa (GAPs).
Así pues, Sos y las GAPs permiten el funcionamiento del ciclo de la proteína Ras a la velocidad
adecuada para permitir la continuación de la señal a un nivel adecuado.
En mamíferos hay tres proteínas Ras de 21 Kd, (H-, K-, N-Ras) que oscilan entre las formas
GTP (activa) y GDP (inactiva).
El protooncogen Ras es uno de las más frecuentes mutados en los tumores humanos pasando a
oncogen Ras. La mutación más frecuente de las proteínas Ras conlleva la pérdida de su
capacidad de hidrolizar el GTP y por ello, Ras permanece siempre en su forma activa
estimulando de forma continua la proliferación celular.
EN LA CASCADA DE QUINASAS Y GTPASAS SE ACTIBAN PROTEÍNAS

NUCLEARES
Sos activa a Ras y Ras activa a Raf o MAPKK (proteína quinasa-quinasa-quinasa activada por
mitógenos.
156
Raf activa) a MEK o MAPKK, que a su vez activa a ERK o MAPK y esta migra al núcleo y
activa por fosforilación a diversas proteínas nucleares que son factores de transcripción,
modulando así la expresión génica.
Estas proteínas nucleares son entres otras: c-fos, c-jun y c-myc que se encuentran de forma
normal en nuestras células y a que son el producto de los denominados protooncogenes. Pero
además estas proteínas también se pueden encontrar en forma mutada, como producto de
oncogenes, llamándose v-fos, v-jun y v-myc.
También algunas proteínas de membrana o citosólicas de la cascada, son el producto de

determinados protooncogenes que pueden mutar a oncogenes. Ej.: el propio receptor de EGF en
sus distintas formas y la proteína Ras.
PAPEL DE LA ACTIVACIÓN DE DETERMINADAS PROTEÍNAS

NUCLEARES
Estas proteínas nucleares cuando son fosforiladas pueden formar homo- o heterodimeros entre
si. Así, el heterodímero jun-fos, en formato de cremallera de leucina, constituye el factor de
transcripción AP-1. Mientras que el homodímero myc-myc, en formato de hélice-bucle-hélice,
constituye el factor de transcripción c-Myc.
Estos factores de transcripción pueden controlan la expresión de diversos genes o

protooncogenes relacionados con el crecimiento celular.
La activación por mutaciones variadas y/o los fallos de ciertas proteínas de estas vías de
transducción de señales, pueden producir cáncer.
157

RELACIONADOS CON CITOQUINAS. VÍA JAK-STAT
RECEPTORES DE CITOQUINAS
Las citoquinas estimulan el crecimiento y diferenciación celular.
Los ligandos son proteínas como la hormona del crecimiento, la prolactina, la EPO, el interferón
gamma y múltiples interleucinas
Un receptor prototipo posee tres dominios:
- Un dominio extracelular: posee dos pares de cisteínas unidas por puentes disulfuro,
múltiples residuos de asparagina que son sitios potenciales de glicosilación y el motivo
WS característicos de estos receptores
- Dominio transmembranal
- Dominio intracelular sin actividad tirosina quinasa
LAS JAKS Y LAS STATS
La unión del ligando dimeriza los receptores adyacentes e induce la interacción del dominio
transmembranal con miembros de las denominadas: tirosinas-quinasas intracelulares Janus
(JAKs).
158
Estas quinasas se fosforilan a sí mismas y fosforilan al receptor creándose sitios de unión para
miembros de los: traductores de señal y activadores de la transcripción (STATs) a través de sus
dominios SH2. Estas STATs son fosforiladas a continuación por las JAKs.
Los miembros de la familia STST son seis: 1-4, 5A, 5B y 6.
Su estructura está muy conservada y presenta:
- Un dominio N-terminal
- Un dominio central que posee una zona de unión al DNA y
- Un dominio C-terminal que contiene:
o Dominio SH2 seguidos por una corta zona que contiene un residuo de tirosina
que es crítico para la activación por fosforilación producida por las JAKs.
o Y un dominio de transactivación que es la parte en la que se diferencian más los
miembros de esta familia.
LAS STAT FOSFORILADAS SON FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN
Las STATs fosforiladas son consideradas factores de transcripción latentes, dimerizan y se

mueven al núcleo donde se unen a secuencias específicas de DNA llamadas GAS (γ-interferon-
activated sequences) o STATREs.
Estas secuencias están definidas por el consenso: TTCn3GAA e inician la activación de la

transcripción de multiples genes relacionados con el crecimiento y metabolismo celular.
Paralelamente, las JAK una vez activadas puede también mediar efectos vía el mecanismo
Ras/MAPK… favoreciendo la expresión de protooncogenes c-fos, c- junB, y c-egr-l entre otros.
159

SERINA/TREONINA QUINASA RELACIONADOS CON LA SUPERFAMILIA
TGFbeta. PAPEL DE LAS SMADS
LOS FACTORES BETA TRANSFORMANTES DEL CRECIMIENTO (TGFBETA:
TRANSFORMING GROWTH FACTORS-BETA)
Constituyen la familia: TGF-beta activinas, y proteinas de morfogénesis del hueso (BMP: bone
morphogenetic proteins)
Actúan como hormonas o como mediadores locales que regulan un amplio rango de funciones
biológicas: proliferación, diferenciación, apoptosis. En adultos están implicados en reparación
tisular y en la regulación de la respuesta inmune.
Los receptores presentan dominios serina/treonina quinasa y hay 2 tipos (I y II) estructuralmente
identicos pero diferentes en el orden de reclutamiento. Formandose finalmente un tetramero
(que no se ve en la Fig.)
Los receptores son inicialmente monoméricos, tras la unión de estos ligandos se dimerizan. Hay
dos tipos de receptores: 1 y 2 (TGFbeta tipo I y tipo II). Si primero hay uno, el siguiente es de
otro tipo, es decir, si el primero es tipo II el siguiente es tipo I. Es decir, siguen un orden para
formar los heterodímeros. La unión del TGF beta, el receptor reclutada y fosforila un receptor
de tipo I. Una vez activado, hay unos dominios serina/treonina quinasa que se activan y se
transmiten a otras proteínas smads que son proteínas que son los factores de reclusión latente. El
receptor de tipo I fosforilada reclutan y fosforila smads de dos tipos: 2 y 3. En este formato se
llama receptor Smad.
Entonces Smad 2 o Smad3 se disocian del receptor y oligomeriza con smad4.
El oligómero smad 2/3 recluta otras proteínas reguladoras de la expresión génica y activa la
transcripción de genes diana específicos.
LAS SMAD (1, 2, 3, 4, 5, 8)
Son proteínas citosolicas que actúan como factores de transcripción latentes.
Los receptores de TGF-beta activados reclutan y fosforilan a Smad2 o 3. Mientras que los
receptores de BMP activados reclutan y fosforilan Smad1, 5 ó 8. Constituyendose en todos los
casos lo que se denomina: R-Smad
La R-Smad se disocia del receptor y se une a Smad4, en todos los casos (co-Smad) y el
complejo se transloca al núcleo donde reconoce determinado elemeto de respuesta en el DNA
(SMAD BE) y se asocia con otras proteínas reguladoras o cofactores regulando así la
transcripción de genes específicos.
160
161
TEMA 38: MECANISMOS GENERALES

DE TRANSFORMACIÓN TUMORAL
UNA CÉLULA CANCEROSA NO MANTIENE EL EQUILIBRIO ENTRE
PROLIFERACIÓN Y APOPTOSIS
La regulación del crecimiento celular tiene que ver con dos mecanismos fisiológicos: la
proliferación y la apoptosis.
La proliferación o división celular es el proceso de formación de nuevas células.
La apoptosis o muerte programada es el proceso por el cual las células dañadas o que han
cumplido su ciclo vital, activan mecanismos que conducen a la muerte celular.
Una célula normal tiene que mantener un equilibrio entre ambos procesos.
Una célula cancerosa no mantiene ese equilibrio, tiene activada la proliferación y presenta un
bloque de la apoptosis entre otros hechos.
LA ACTIVACIÓN DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR
Se ejerce principalmente mediante la unión de determinados factores de crecimiento a sus

receptores específicos, dando lugar a cascadas de señalización que inducen dos tipos de genes:
- Genes de respuesta temprana: entre ellos los de los protooncogenes: jun, fos, myc,
dando lugar respectivamente a las proteínas nucleares del mismo nombre.
- Genes de respuesta retardada: entre ellos los de los protooncogenes que codifican las
proteínas de las Cdks-ciclinas.
LA INHIBICIÓN DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR
Se ejerce fundamentalmente a través de los denominados genes supresores de tumores que

codifican proteínas que inhiben distintos pasos de las vías de proliferación celular.
La inhibición de la proliferación celular no se autoregula cuando estos genes como veremos en

la próxima clase, no cumplen su función.
TRANSFORMACIÓN TUMORAL
La transformación tumoral lleva al cáncer. Este es un conjunto de enfermedades caracterizadas

por un crecimiento celular incontrolado e inapropiado, que entre otros elementos está altamente
asociado con alteraciones de proteínas de transducción de señales.
Cada tumor se origina a partir de una única célula dañada, es decir de un clon procedente de una
célula en el que se han producido importantes cambios genéticos y bioquímicos en su DNA.
Como iremos viendo, estos cambios consisten en: distintos tipos de mutaciones de
protooncogenes y genes supresores de tumores, además de otras alteraciones genéticas como
alteraciones de la metilación, reordenamientos cromosómicos etc.
162
TRANSFORMACIÓN A ONCOGENES CELULARES
Protooncogén Oncogén (versión mutada)
Un protooncogén es un gen normal que codifica una proteína normal (c-x) generalmente
relacionada con la proliferación celular o la apoptosis.
Un oncogén es la forma mutada, que expresa una proteína anormal: oncoproteína (v-x) que :
-ó no cumple su papel especifico
-o se mantiene activa independientemente de las señales reguladoras con el resultado de una

ganancia inapropiada de función.
A través de estos mecanismos se puede llegar al cancer.
(Varmus y Bishop PN 1989)
TIPOS PRINCIPALES DE PROTEÍNAS QUE PUEDEN SER AFCETADAS

POR TRANSFORMACIONES TUMORALES
1. Factores estimuladores del crecimiento celular

2. Receptores de estos factores estimuladores de crecimiento celular
3. Proteínas citoplasmáticas que intervienen en los sistemas de transducción de señales de
esos factores.
4. Proteínas nucleares de regulación (factores de transcripción) relacionados con esos
sistemas de múltiples genes.
5. Proteínas responsables de la activación directa del ciclo celular.
TIPOS DE PROTOONCOGENES/ONCOGENES POR LAS PROTEÍNAS QUE

CODIFICAN
1. Factores estimuladores del crecimiento celular. Ej: protoonc c-sis codifica la cadena B de
la proteína PDGF (f crec derivado de plaquetas). El oncogén respectivo codifica una cadena B
mutada que la hace hiperactiva.
2. Receptores de factores estimuladores del crecimiento. Ej: protoonc c-erbB codifica al

receptor de EGF (f crec epid). El oncogén respectivo codifica un receptor sin dominio de unión
de EGF, continuamente estimulado en su actividad tirosina-quinasa.
3. Proteínas citoplasmáticas que intervienen en los sistemas de transducción de señales. Ej:

protoo c-ras codifica la proteína ras. El oncogén respectivo codifica una Ras hiperactiva sin
capacidad de hidrolizar el GTP.
4. Factores de transcripción que controlan la expresión de proteínas implicadas en el

crecimiento celular. Ej: protoonc c-Fos , o c-jun codifican a las proteínas c-fos y c-jun que
constituyen juntas el factor de transcripción AP-1. Los oncogenes respectivos codifican
proteínas mutadas que pueden tener su capacidad transcripcional incrementada.
5. Proteínas responsables de la activación directa del ciclo celular. Ej: protoonc c-bcl1
codifica a la ciclina D1 que ayuda a controlar las actividades de las ciclinas G 1/S. El oncogén
respectivo codifica una proteína que no ayuda a controlar esas actividades y el ciclo celular
avanza sin control.
163
2. EL ONCOGÉN v-ErbB
Codifica un receptor sin dominio de unión de EGF que está continuamente estimulado en su
actividad tirosina-quinasa.
Este receptor carece del dominio de unión a EGF pero conserva su segmento transmembrana y
su dominio tirosina-quinasa.
En ausencia de señal extracelular fosforila sus proteínas dianas e impulsa así la proliferación
celular. Como proteínas oncogénicas está asociada con cánceres del epitelio glandular, de
mama, de estómago y de ovario.
3. EL ONCOGÉN v-RAS
El protooncogen Ras es uno de los más frecuentes mutados en los tumores humanos pasando a
oncogén Ras. La proteína mutada Ras presenta la pérdida de su capacidad intrínseca de
hidrolizar GTP. Así la Ras mutada permanece siempre activa estimulando de forma continua la
proliferación celular.
Como proteína oncogénica está asociada con el 50% de canceres de pulmón, y carcinomas de
colon y con el 90% de adenomas pancreáticos.
Fue el primer oncogén humano descrito.
Mutaciones puntuales en el oncogén Ras H y la proteína que codifica.
También hay mutaciones en los oncogenes RasK y RasN.
ONCOGENES VIRALES
Desde hacía tiempo se había observado que determinados virus causaban cáncer en los animales
que infectaban:
El primer virus tumoral el “virus del sarcoma de Rous (RSV)” fue descubierto en 1911 por
este investigador. Es un virus de RNA y consta de 4 genes. Tres son esenciales para la
replicación viral: v-gal v-pol v-env y el cuarto v-src se observó que causaba tumores en los
músculos y tejido conjuntivo de los pollos.
164
Posteriormente se observó que las células humanas “normales” contenían el protooncogen c-src
(primer protooncogen descrito) que es homologo al anterior. En otros muchos eucariontes,
también existía c-src, lo que sugería que era un protooncogen celular esencial.
Ambos c-src y v-src codifican para la misma proteína de 60 kDa que participa en las cascadas
de señalización. Esta proteína src como producto del protooncogen c-src posee actividad
tirosina-quínasa normal, mientras que como producto del oncogen v-src está en forma mutada
hiperactiva.
EL ORIGEN DE LOS ONCOGENES VIRALES ES CELULAR
Los virus al integrar su genoma vírico con el de la célula que infectan pueden captar ciertos
protooncogenes de esa célula y transformarlos por eliminación de los intrones en oncogenes
víricos.
En muchos casos estos protooncogenes celulares son transposones y en su mayor parte

codifican elementos de transducción de señales.
Algunas proteínas producidas por estos oncogenes víricos pueden producir cáncer como el que
estamos comentando: El oncogén vírico v-src produce la proteína v-src unida a membrana, no
receptora, y con actividad tirosina-quinasa citoplásmico alterada que fosforila residuos de
tirosina de forma continua.
¿CÓMO ADQUIERE EL VIRUS LA VERSIÓN MUTADA DEL

PROTOONCOGEN C-SRC?
Durante la infección, el genoma vírico puede captar “parcialmente” este protooncogen del
genoma de la célula infectada, produciéndose una pérdida de la región que codifica a los últimos
aas.
165
Este protooncogen modificado, puede proporcionar al virus una ventaja selectiva al favorecer
su crecimiento por eso tirosina-quinasa hiperactiva.
La proteína v-Src.
ESTRUCTURA DE LA FAMILIA DE LAS PROTEÍNAS TIROSINA-QUINASA SRC
C-src es una tirosina quinasa unida a membrana, no receptora, que juega importantes papeles en
la mitosis, adhesión, invación, mtilidad y progresión celular.
C-src media mecanismos de traducción de señales de IGFs, insulina y otros que se integran en la
vía PI3k/AKT…
La forma mutada está en muchos cánceres humanos de mama, colorectal, pulmón, ovario y
hematológicos.
En 2008 SE DIO EL NOBEL A LOS VIRÓLOS
Montagnier, Barré Sinoussi, y Zur Hausen
Los dos primeros por el decubrimiento del virus del sida (VIH).
El tercero por el descubrimiento del virus del papiloma humano (HPV).
166
CÁNCERES HUMANOS ASOCIADOS CON ENFERMEDADES VÍRICAS
Solo unos pocos canceres humanos se han demostrado asociados con infecciones víricas:
• Con virus de DNA:
- el cáncer de hígado con el virus de la hepatitis B.
- el linfoma de Burkitt con el virus de Epstein-Barr.
- tumores de rinofaringe también con el anterior.
- ciertos canceres cutáneos y genitales como el de cervix con el papilomavirus

(actualmen vacuna).
• Con virus de RNA:
- diversas leucemias y linfomas con los retrovirus HTLV-I y II.
167
TEMA 39: INACTIVACIÓN DE GENES

SUPRESORES DE TUMORES
GEN SUPRESOR DE TUMORES VERSIÓN MUTADA
Un gen supresor de tumores o oncosupresor o antioncogén es un gen normal que codifica

una proteína normal (antioncogénica), que actúa de forma natural restringiendo la proliferación
celular o induciendo apoptosis.
La versión mutada de ese gen supresor: -impide la síntesis de esa proteína antioncogénica.
El resultado es la perdida de la función supresora del gen lo que puede producir cáncer.
Mutaciones críticas para el cáncer (el protooncogen: mutación dominante y el gen supresor: mutación
recesiva).
Es decir, solo son efectivas en homozigósis.
168
Vías de pérdida de función de un gen supresor: cambios genéticos y epigenéticos. Los hechos
epigenéticos y sobre todo el silenciamiento génico es importante en la supresión o inhibición del
gen supresor.
EL GEN SUPRESOR Rb
El gen supresor Rb codifica a la proteína Rb que es nuclear. Este gen se expresa solo en
homozigosis. Fue el primer gen supresor aislado. Su acción es inhibir la acción de la proteína
reguladora de genes E2F, inhibiendo así la división celular actuando en el punto de control G1/S
e impidiendo por tanto la progresión del ciclo celular.
El gen mutado produce una proteína Rb que no tiene esa capacidad inhibitoria y produce
retinoblastoma, un tumor de los retinoblastos (células precursoras de la retina) que se manifiesta
desde la infancia (1:20000 niños), el globo ocular se afecta y el tumor invade el cerebro.
EL RETINOBLASTOMA
Así pues, el retinoblastoma es típico de la infancia y los tumores se desarrollan a apartir de

células precursoras neurales en la retina inmadura.
Se conocen dos formas de la enfermedad, una hereditaria y la otra no. El gen está en el
cromosoma 13.
La hereditaria cursa con muchos tumores que afectan a los dos ojos. En estos enfermos
inicialmente se herede una mutación tipo deleción o con pérdida de función en una de sus dos
copias del gen Rb. La célula que porta esa mutación se hará cancerosa, cuando inactive la copia
que le queda correcta del gen Rb, dando lugar así al retinoblastoma.
La no hereditaria presenta afectación de un solo ojo y un único tumor. En estos enfermos tras el
nacimiento, ocasionalmente una célula inactiva una de sus dos copias del gen Rb. Raramente la
segunda copia del gen Rb se inactiva en la misma célula para producir un retinoblastoma.
169
PAPEL DE Rb INHIBIENDO LA ENTRADA EN EL CICLO CELULAR Y EL

INICIO DE L FASE S
La proteína Rb junto a otras proteínas participa en los mecanismos que controlan la entrada en
el ciclo celular y el inicio de la fase S.
En ausencia de activación de una vía de crecimiento celular hay interacción proteína Rb/E2F
inhibiendo la acción de E2F.
Pero tras la activación de esta vía tiene lugar el aumento de expresión de genes tempranos como
Myc, este como factor de transcripción aumenta la expresión de genes de respuesta tardía,
incluyendo los que aumentan la actividad del complejo Cdk-G1, el cual a su vez fosforila a las
proteínas Rb.
Esta fosforilación inactiva a la proteína Rb, liberándose la proteína reguladora de genes E2F que
activa la transcripción de los genes de la transición G1/S, incluidos los genes de la ciclina G1/S
(ciclina E) y de la ciclina S (ciclina A).
La resultante de las actividades Cdk-G1/S y Cdk-S aumenta aún más la fosforilación de la

proteína Rb y se origina un bucle de retroalimentación positiva.
Además las proteínas E2F también estimulan la transcripción de sus propios genes,
originándose otra retroalimentación positiva.
170
La proteína Rb inhibe la acción de la

proteína estimuladora de genes E2F
inhibiendo la entrada en el ciclo
celular y el inicio de la fase S.
EL GEN SUPRESOR DE P53
El gen supresor p53 codifica a la proteína reguladora de genes p53. Este gen se expresa solo en
homocigosis. La acción de la proteína p53 es estimular la transcripción del gen que codifica la
proteína p21. Esta proteína se une a los complejos Cdk G1/S y Cdk –S e inhibe sus actividades,
ayudando así a bloquear la entrada en el ciclo celular.
A diferencia con la proteína Rb, la prot p53 es muy inestable y sus concentración en la célula es
muy aja como consecuencia de la interacción con otra proteína Mdm2.
171
La proteína p53 en las vías de reparación del daño en el DNA. Y puede promover la reparación
del DNA, o lo contrario activar la vía apoptótica conduciendo a la muerte celular.
El 50% de los tumores humanos presenta mutación en este p53. Esta mutación provoca que no
se produzca la proteína p21, por tanto no se inhibe la entrada en el ciclo celular y la célula se
sigue dividiendo.
La persona que hereda una mutación en una copia del gen p53 padece el síndrome de Li-
Fraumeni y tiene una probabilidad elevada de desarrollar diversos tipos de cáncer.
La proteína p53 participa en vías de reparación del daño en el DNA activando la transcripción
de la proteína p21 impidiendo así, la entrada en el ciclo celular.
EL SÍNDROME DE LA ATAXIA TELANGIECTASIA (AT)
Es un defecto en el gen que codifica la proteína ATM su deficiencia. ATM es una de las
proteínas quinasas que se activa en respuesta al daño en el DNA inducido por diferentes
mecanismos.
Los enfermos que padecen esta enfermedad son muy sensibles a los rayos X y cursan con
neurodegeneración, predisposición al cáncer e inestabilidad del genoma por falta de reparación
del DNA.
EL GEN SUPRESOR P53 (2)
Es quizá el gen supresor más importante para prevenir el cáncer humano.
En todos los canceres humanos están mutados el propio p53 o alguno de los componentes de la
vía del p53.
La proteína p53 parece necesaria para el desarrollo normal ya que los animales que les falta de
forma natural o experimental por “gene knoskout”, desarrollan cáncer muy pronto.
P53 proporciona una protección de tal calibre, que mutaciones de Ras y Myc no son suficientes
por sí solas para generar un tumor si no está mutado p53.
Vías de protección de la pro p53 para mantener bajo control el crecimiento de un tumor.
Es un sensor de estrés celular.
172
TIPOS DE GENES SUPRESORES DE TUMORES/V. MUTADA POR LAS

PROTEÍNAS QUE CODIFICAN
1. Factores inhibidores del crecimiento celular. Ej: El gen supr c-dcc codifica una prot. de
adhesión celular que inhibe el crecimiento celular. El gen mutado es incapaz de codificar esa
proteína.
2. Receptores de esos factores inhibidores u hormonas que frenan el crecimiento celular.

Ej: El gen supr c- codifica al receptor para el factor  de crecimiento transformante, que
inhibe el crecimiento celular. El gen mutado codifica un receptor insensible o que no transmite
la señal de inhibición del crecimiento.
3. Proteínas citoplasmáticas que intervienen en los sistemas de transducción de señales. Ej:

el gen supr nf1 codifica una proteína que inhibe la actividad de Ras. La forma mutada no
inactiva a Ras.
4. Proteínas que frenan el ciclo celular o producen apoptosis. Ej: los genes supresores: Rb y
p53 codifican proteínas inhibidoras de los complejos Cdk-ciclinas y actúan como freno en el
punto de control G1/S.
173
TEMA 40: BASES MOLECULARES DE

ALGUNAS ENFERMEDADES
CANCEROSAS
CÁNCER COLORECTAL
Es muy común, provoca unas 60.000 muertes al año en USA, y representa alrededor del 10%
del total de muertes por cáncer.
El diagnostico suele darse a edades avanzadas (el 90% después de los 55 años).
Aparece en el epitelio que bordea el colon (intestino grueso) y el recto (la parte más baja del
intestino). Esta zona se renueva celularmente rápido ≈ 1 semana. Esta renovación depende de
las células progenitoras de las zonas profundas de los surcos del epitelio llamadas criptas
intestinales.
El examen rutinario de individuos adultos mediante colonoscopía, a menudo revela pequeños

tumores benignos o adenomas del epitelio intestinal conocidos como pólipos.
Estos podrían ser precursores, puesto que la progresión de la enfermedad es muy lenta 10-35
años. Si se extirpan estos pólipos, la incidencia posterior de tumor es muy baja.
PROGRESIÓN TUMORAL DE LOS PÓLIPOS
En los pólipos de menos de un cm de diámetro, las células y su disposición en el epitelio son

normales. En los pólipos más grandes se encuentran células anormalmente diferenciadas y
que forman estructuras de organización alterada.
Algunas veces pueden diferenciarse dos o más partes dentro de un mismo pólipo. Una
aparentemente normal, y la otra cancerosa, como si se hubieran producido a partir de un sub-
clon mutado dentro del clon original de células adenomatosas.
En los estadios siguientes, las células tumorales se transforman en invasoras, rompen la lámina
basal y se dispersan a través de la capa muscular que rodea al intestino (en un estadio
avanzado de adenoma, se ve que la masa muscular maligna invade el músculo antes de pasar a
los otros órganos).
Por último, forman metástasis hacia nódulos linfáticos, el hígado, el pulmón y otros tejidos.
Existen dos tipos de predisposición hereditaria al carcinoma de colon: polipólisis adenomatosa

familiar (FAP) y cáncer colorectal no polipósico hereditario (HNPCC)
TIPO 1 DE PREDISPOSICIÓN HEREDITARIA AL CARNINOMA DE COLÓN
1.- Polipólisis adenomatosa familiar (FAP: familiar adenomatous polyposis). Aparece de

forma temprana en la vida adulta con gran cantidad de pólipos a lo largo del colon que si no son
extirpados, es casi inevitable que uno o más se conviertan en malignos (~12 años). La
enfermedad es debida a la deleción o inactivación del gen supresor de tumores Apc. Los
enfermos, presentan esa mutación en una copia del gen Apc en todas las células de su
174
organismo y presentan “perdida de heterozigosis” es decir doble mutación cuando ya es un

tumor.
Hay que resaltar que la mayoría de pacientes con cáncer colono-rectal no presenta la forma
hereditaria. Pero más del 80% de estos tumores (aunque no en las células normales) tienen
inactivadas ambas copias del gen Apc mediante mutaciones adquiridas a lo largo de la vida.
En ambos casos, y en otra predisposición hereditaria, existe una gran inestabilidad genética
cromosomica.
GEN SUPRESOR DE TUMORES APC Y PROTOONCOGÉN DE LA

CATENINA-BETA
La deleción o inactivación del gen supresor de tumores Apc que codifica a la proteína Apc, es
un componente inhibidor de la vía de señalización Wnt / β-catenina.
Apc actúa uniéndose a la catenina- producto del protooncogén del mismo nombre y
componente de otra vía. Esta unión induce la degradación de esta última e impide que migre al
núcleo donde actúa como regulador transcripcional para mantener el estado de célula
progenitora en las criptas intestinales.
La pérdida de Apc comporta un exceso patológico de catenina- libre y en consecuencia una

expansión incontrolada de la población de células progenitoras y un incremento masivo del
número y tamaño de las criptas intestinales.
El protooncogen de la catenina- puede encontrarse también mutado a oncogen cuando no lo

está Apc, lo que indica: a) la importancia de estas vías confluyentes en esta enfermedad y b) que
más de una mutación en ellas no suele presentarse, porque no supone ninguna ventaja.
El hecho de que Apc también puede interaccionar con otros componentes celulares como los
microtúbulos, abre más posibilidades. En este sentido, la pérdida de Apc aumenta la frecuencia
de defectos en el huso mitótico que comportan anormalidades en los cromosomas.
En ausencia de señal Wnt (proliferativa), la catenina-β está inhibida. Esto sucede porque, en
esta situación, APC forma un complejo que fosforilia y ubiquitiniza a la catenina-β. Esto
permite la degradación en los proteosomas de la catenina-β.
Así, los genes que van a través de esta vía, que necesita la acción de la catenina-β, quedan
inactivados. En el complejo formado por la APC, incluye una proteína quinasa responsable de la
fosforilación, una enzima que ubiquitina y a la axina, que en esta situación se encuentra
inactiva.
Con señal Wnt, la catenina-β está activa. En esta situación, la unión de Wnt a los receptores de
membrana activa axina, que se une a éstos e impide que hace que el complejo formado por Apc
fosforile y ubiquitine a la catenina-β.
Esta última se escapa del complejo y se acumula en el citoplasma en su forma estable no

fosforilada, desde donde migra al núcleo. Allí desplaza al correpresor Groucho, permitiendo
que tenga lugar la transcripción.
Podemos decir, entonces, que la proteína Apc, en su papel inhibidor, inhibe la vía de la catenina-
β, que es una estimulante de la expresión génica.
175
La proteína Apc es un inhibir de la vía de señalización Wnt/B-catenina.
VÍAS DE PROLIFERACIÓN CELULAR
176
SECUENCIA TÍPICA DE CAMBIOS GENÉTICOS QUE MARCAN EL DESARROLLO DE

UN CARCINOMA COLORECTAL
ANORMALIDADES GENÉTICAS QUE SE ACUMULAN CON EL TIEMPO Y

PRODUCEN LA CADENA DE ACONTECIMIENTOS QUE LLEVAN AL CÁNCER
COLORECTAL
El Apc, que es un gen supresor de tumores, se encuentra mutada en más del 80% de los cánceres
humanos de colon. Cuando esto sucede, generalmente, no está mutada también la catenina-β, y
viceversa
La mutación de p53, que también es un gen supresor de tumores, se encuentra en un 60% de los
casos.
El oncogén K-Ras se encuentra mutado en un 40% de los cánceres de colon.
Si Smad está mutado, no lo está su receptor TGFβ, y viceversa
Hechos epigenéticos como la metilación, que se relaciona con genes de reparación del DNA,
también está implicada en cánceres humanos.
2. CÁNCER COLORECTAL NO POLIPÓSICO HEREDITARIO (HNPCC)
En este 2º tipo de predisposición hereditaria al tumor colorectal, esta se incrementa sin que
aumente el número de pólipos. Tampoco hay alteraciones cromosómicas en las células
cancerosas del tumor.
En un cierto porcentaje cursan con una mutación espontánea en el gen Apc y tienen gran
tendencia a perder esa heterozigosis. También suelen ser deficientes en el sistema de corrección
de errores de apareamiento en el DNA.
Las mutaciones se encuentran en algunos genes que codifican componentes clave en los
sistemas de reparación de la doble cadena de DNA. En este sentido, en situación de normalidad
las proteínas Muts y Mutl rastrean nuestro DNA en búsqueda de muescas y eliminan la zona
dañada de la cadena mientras que aquí no lo hacen.
NEUROFIBROMATOSIS (NF)
Hay dos tipos principales: NF1 y NF2.
NF1 es más frecuente con una incidencia (1:3000).

Cursa con pequeñas manchas pigmentadas “café con leche” y pequeñas tumoraciones carnosas
neurofibromas sobre todo por la espalda, ambos síntomas se presentan en la infancia y van
creciendo con la pubertad. También hay presencia de nódulos de Lisch amarillentos en el iris.
177
NF2 tiene una incidencia mayor (1:35000) y presenta menores signos de los antes citados. El
rasgo más característico es el desarrollo ya en la juventud de tumores que implican al octavo
nervio craneal (neuromas acústicos). También se pueden presentar cataratas subclínicas.
En NF1, hay algún caso de pequeño retraso en el aprendizaje. Pero en ambos tipos, la mayoría
de individuos llegan a adultos con vida normal.
GENÉTICA DE LA NEUROFIBROMATOSIS
NF1 presenta herencia autosómica dominante y variabilidad de expresión dentro de una misma
familia.
- El gen relacionado está en el brazo largo del cromosoma 17 adyacente al centrómero. El

gen abarca 350 Kb y consta de 59 exones.
- El gen normal codifica a la proteína neurofibromina.
- Esta proteína tiene homología estructural con la proteína (GAP) activadora de la guanosina
trifosfatasa (GTPasa) que regula a la baja la actividad de Ras.
- Por tanto este gen podría ser un gen supresor de tumores y en la forma mutada dejar de
desempeñar esta función.
NF2 no presenta esa herencia.
- El gen relacionado está en el brazo largo del cromosoma 22. El gen abarca 110 Kb y consta
de 17 exones.
- El gen normal codifica a la proteína merlina que es una proteína del citoesqueleto, que podría
estar relacionada con los hechos auditivos antes citados. El gen mutado deja de codificar a esa
proteína.
No hay tratamiento eficaz.
LA PROTEÍNA MERLINA
Es un miembro de una familia de proteínas intracelulares: ERM (nombre por los tres miembros
iniciales).
El dominio N-terminal se une a la cara citoplásmica de algunas glucoproteinas transmembrana.
El dominio C- terminal a los filamentos de actina. Estas uniones mediados por las proteínas
ERM entre el citoesqueleto de actina y la matriz extracelular es sensible a un gran número de
señales recibidas por la célula.
La pérdida de merlina comporta la aparición de Neurofibromatosis NF2.
Estos datos del mecanismo de acción de las proteínas ERM son una prueba de la existencia de
sistemas de retroalimentación que conectan elementos estructurales celulares con el control del
crecimiento celular.
La merlina en su conformación plegada es inactiva. Por un mecanismo de fosforilación o unión

a lípidos de membrana (PIP2), la merlina adquiere su conformación extendida, que es su forma
activa.
La merlina presenta una zona de unión a receptor de membrana y otro de unión a actina.
De esta forma comunica señales celulares con el citoesqueleto.
178
CÁNCER DE MAMA
La incidencia actual es muy alta: 1 de cada 3 mujeres presentara un cáncer de mama.
Entre un 15-20% de las mujeres con cáncer de mama tiene antecedentes familiares. Hay 2 genes
principalmente relacionados: BRCA1 y BRCA2 que son supresores de tumores.
El BRCA1 está mutado en el 40-50% de las familias con cáncer de mama autosómico
dominante de aparición precoz. El BRCA2, en el 30-40% de estas familias.
Ambos genes mutados han perdido su función reparadora de DNA y las células que los
presentan primero cursan con una gran inestabilidad genética que lleva a su presentación
primero en heterozigosis y posteriormente en homozigosis.
El BRCA1, está en el brazo largo del cromosoma 17.
El BRCA2, está en el brazo largo del cromosoma 13.
Cuando se presenta cualquiera de estas mutaciones hay mayor riesgo de aparición de otros
canceres como el de ovario.
En esta enfermedad intervienen otros muchos genes, vías de transducción y receptores

hormonales como el ER.
NUEVAS TERAPIAS EN CÁNCER DE MAMA
El 70% de los canceres de mama son ER positivos (ER+), es decir que depende de los
estrógenos para desarrollarse.
Estos canceres responden a las terapias antiestrogenicas, bien sea con tamoxifeno (un
antiestrogeno), o con inhibidores de la aromatasa como el exemestano.
Sin embargo, hay un porcentaje de las pacientes que desarrollan resistencia a estos tratamientos
hormonales y en las que la enfermedad no se para sino que avanza.
En estos casos, desde hace aprox una década se añadía el trastuzumab (un anticuerpo contra el
factor de crecimiento epidemal EGF).
179
Lo último es en su lugar usar el everolimus (un anticuerpo contra el mTor). Este tratamiento
está en fase experimental (Baselga y col). Este tratamiento triplica el tiempo sin progresión de la
enfermedad.
Se está comenzando con la “terapia adaptativa” es decir ir tratando el tumor en función de

cómo va respondiendo a cada paso del tratamiento. En este sentido se ha observado que los ER+
resistentes siguen siendo activados por otros mecanismos distintos del estrógeno o
antiestrogeno……
180
TEMA 41: BASES MOLECULARES DE

ENFERMEDADES RELACIONADOS
CON DEFECTOS EN RECEPTORES
PROTEICOS
ALGUNOS RECORDATORIOS SOBRE EL COLESTEROL Y LAS
LIPOPROTEÍNAS
Un adulto con una dieta baja en colesterol sintetiza, por término medio, unos 800 mg de
colesterol al día. La colesterolemia optima ~ 200 mg/dl
El hígado es el sitio principal de la síntesis de colesterol y triacilgliceroles. El intestino lo hace

en menor cantidad. Existe una retro-regulación mediada primariamente por cambios en la
cantidad y actividad de la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril- CoA reductasa (HMG CoA) .
Cuando el colesterol y los triacilgliceroles están en exceso, se exportan a la sangre en forma de

lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL).
El papel principal de las lipoproteína de baja densidad (LDL) es transportar el colesterol a

los tejidos periféricos y así regular la síntesis de novo del colesterol en estos lugares.
Las apoproteínas, que son el componente proteico de las lipoproteínas se sintetizan y secretan
por el hígado y el intestino.
Lipoproteína de baja densidad (LDL)
Están formadas por cuatro componentes principales:
- Apoproteína B-100. Reconoce el receptor.

- Colesterol no esterilizado. Es que se está transportando
- Fosfolípidos de membrana
- Ésteres de colesterol. En el interior, son depositados a posterior.
EL RECEPTOR DEL LDL
El gen que codifica este receptor está en el brazo corto del cromosoma 19 consta de 18 exones
que se corresponden estrictamente con las unidades estructurales de la proteína de este receptor.
Esta proteína tiene un peso de (115 Kd) y consta de 6 tipos de dominios diferentes.
La síntesis del receptor que capta LDL está sujeta a retro- regulación. Es decir, cuando abunda
el colesterol dentro de la célula dejan de sintetizarse nuevos receptores.
La regulación es a nivel transcripcional. El promotor del gen que codifica este receptor tiene un
elemento de respuesta SER “elemento regulador de esteroles” al que se le une el factor de
transcripción “elemento regulador de esteroles” (SREBP). Este factor solo se une al promotor
cuando son bajos los niveles de colesterol, potenciando la transcripción. Cuando son altos es
degradado y no actúa.
181
Similar mecanismo se da en el promotor de la enzima 3- hidroxi-3-metilglutaril coenzima A

reductasa (HMG CoA) implicada en la síntesis endógena del colesterol.
HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR
Trabajos pioneros de Brown y Goldstein sobre la hipercolesterolemia familiar y aterosclerosis

demostraron que se debe a una mutación o carencia completa del gen del receptor de LDL
(LDLR). Es un trastorno monogénico autosómico dominante. Pero hoy en día se consideran
implicados también otros genes.
La colesterolemia en homozigotos ≈ 600 mg/dl, en heterozigotos ≈ 300 mg/dl. La

colesterolemia optima < 200 mg/dl..
Se han detectado mutaciones en el receptor de LDL relacionadas con todos los pasos del
proceso de endocitosis.
Los homozigotos prácticamente no tienen receptores. Los heterozigotos un menor número.
Puede presentarse en la infancia o en la adolescencia con depósitos subcutaneos de lípidos, por

ejemplo en las rodillas, denominados xantomas.
Aproximaciones terapeúticas van desde la restricción dietética de la ingesta de colesterol, la

toma de colestiramina que secuestra el colesterol de la circulación enterohepática, y también
toma de fármacos que inhiben la síntesis endógena de colesterol por la inhibición de la enzima
3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMG CoA)
182
DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE
Su nombre se debe al neurólogo francés del mismo nombre que la describió por primera vez en
1861.
Otro síndrome similar pero más ligero se denomina de Becker (DMB).
Ambas son causadas por mutaciones en el mismo gen, el gen de la distrofina, localizado en los
años 80, en el brazo pequeño del cromosoma X.
La incidencia de ambas es (1:3500 varones) y (1:20000 mujeres).
En la DMD los síntomas empiezan a los 3-5 años, y son de debilidad muscular motora
progresiva que les lleva a la silla de ruedas en la juventud y a una muerte muy temprana.
En la DMB va todo más lento.
La herencia es recesiva ligada al cromosoma X
EL GEN DE LA DISTROFINA
Parece ser el más largo identificado hasta el momento en seres humanos.
El tamaño 2,3 Mb, de las que solo 14 kb se transcriben a mRNA.
El gen contiene 79 exones y se transcribe en dos tejidos: el músculo y el cerebro.
Las deleciones son lo más común con dos puntos principales. Uno en los primeros 20 exones. El
otro entre los 45-53 exones.
El tamaño de la deleción no se correlaciona con la gravedad de la enfermedad.
Las deleciones que causan DMD suelen alterar el marco de lectura. Mientras que las que causan
DMB no lo hacen.
La mayoría de las mutaciones en DMD suponen la terminación prematura de la traducción, lo

que supone la producción de poco o nada de proteína.
LA PROTEÍNAS DISTROFINA
La proteína distrofina tiene un tamaño de 427 kDa.
Es una proteína muscular que se sitúa cerca de la membrana muscular como un dímero, y enlaza
a la actína intracelular y a la laminina extracelular a través de un complejo glucoprotéico de
varias subunidades.
La ausencia de distrofina conlleva una degeneración gradual de las células musculares.
Anomalías del complejo glucoprotéico, también pueden ocasionar trastornos musculares.
La presencia de distrofina se puede medir en una biopsia muscular.
Está siendo tratada con varios tipos de terapia génica.
183
“El descubrimiento consiste en ver lo que todo el mundo

ha visto y pensar lo que nadie ha pensado”
Albert Szent-Gyorgyi
(Premio Nobel de Fisiología y Medicina 1937).
184

Genética Molecular Medicina UCM 2012-2013

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Universidad Complutense de Madrid

Zhao Hui Chen

Profesora: Consuelo Calle

1. Concepto de genoma. Niveles de organización estructural del DNA. Estructura

TEMA 1: CONCEPTO DE GENOMA

Genotipo: es la constitución genética de un organismo concreto.

Fenotipo: es el aspecto externo y otras características medibles de un organismo que son

El genoma en eucariotas incluye el DNA cromosómico y el DNA mitocondrial. El genoma

NIVELES DE ORGANIZACIÓN ESTRUCTURAL DEL ÁCIDO

El nucleótido es la base de todo DNA (ácido

Las bases son: purinas o pirimidinas. Las purinas

*saberse las fórmulas de las bases.

Las pirimidinas: La citosina y la timina están en el

Un nucleósido es un nucleótido sin el grupo

En la estructura secundaria, las bases pueden girar a

La estructura primaria es una cadena de nucleótidos. La secuencia 5´ a 3´ colocadas de forma

PRIMEROS ESTUDIOS SOBRE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL DNA

Además propuso un modelo para la conformación de los ácidos nucleicos: el tetranucleótido

Se pensó en las proteínas como transmisoras….

UN PASO ADELANTE: REGLAS DE CHARGAFF

- La cantidad total de nucleótidos pirimidínicos (T+C) es siempre igual a la cantidad total de

- La cantidad de T, es siempre igual a la de A y la cantidad de C, es siempre igual a la de G.

OTRO PASO ADELANTE: ESTUDIOS DE DIFRACCIÓN DE RAYOS X

En los años 50, en el laboratorio de RANDALL, en el King’s College de Londres, FRANKLIN

ÚLTIMO PASO: ESTUDIOS CON MODELOS MOLECULARES

Lo publican en la revista Nature el 25 Abril 1953. (Nature 171:737,1953)

Obtienen junto con WILKINS el Premio Nóbel en Medicina en 1962.

INTERACCIONES MOLECULARES SUSTENATADORAS DE LA

- Puentes de H: Un DNA de doble hebra, un nucleótido de A con T se unen con dos

TIPOS DE HÉLICES DE ESTRUCTURA SECUNDARIA

Existen diferentes tipos de hélices:

- Forma A: gira a la derecha: 26 Amstrong; pares de bases por vuelta de hélice: 11

Ej: Enzimas de restricción: son un tipo de desoxirribonucleasas-endonucleasas que actúan

3’-C-T-T-A-A†G- 5’(las veremos en el Tema 7)

Ej: Topoisomerasas: son un tipo de desoxirribonucleasas-endonucleasas que afectan al DNA

TEMA 2: ESTRUCTURAS TERCIARIAS

Existen unos segmentos de DNA que pueden presentar

El segmento de polipurinas que son solo purinas (AG)n,

LA MAYOR PARTE DE LOS DNA NATURALES

Están superenrollados plectonémicamente de forma dextrógira y signo (-), alterando la forma

Recordemos que el DNA en la forma B tiene un giro cada 10,5 nucleótidos en su

Entonces, el nº de giros de un DNA = nº pares de bases/ 10,5

nº de enlace (Lk) = nº de giros + nº de superenrollamientos

Los superenrollamientos dextrógiros son los más fisiológicos, pero en laboratorio

El nº de enlace va disminuyendo con un incremento sucesivo de superenrollamientos

Sin superenrollamientos o relajado será por ej.:

Estas enzimas son: Top I y Top II en procariotas y eucariotas.

Acción de las Topoisomerasas sobre el

Se sabe más de las Top I que las del Top II.

Para la acción de las topoisomerasas rompe para eliminar los

La Top I tiene entre sus aa una tiroxina en su sitio activo ese es el aa

La energía del enlace fosfodiéster original se almacena en el enlace

La Top II rompe las dos hebras del DNA.

Partimos de dos dobles hélices de DNA circular entrelazadas. Una DNA

La puerta abierta por la topoisomerasa se abre y se cierra dejando pasar a la otra

LA ACTIVIDAD TOPOISOMERASA ESTÁ INCREMENTADA

Mientras que en células sanas la actividad topoisomerasa está dentro de

ALGUNOS INHIBIDORES DE TOPOISOMERASAS

- La camptotecina inhibe la top I humana, mediante la estabilización del complejo

Otros inhibidores de topoisomerasas se usan como antibióticos contra topoisomerasas

Su empaquetamiento se potencia más aún con la proteína HU que facilita el superenrollamiento.

Pero es “desnudo” porque carece de proteínas formadoras de superestructuras, es decir de

EL DNA EUCARIOTA ES “NO DESNUDO” Y CONSTITUYE PARTE DE LA

Hay dos constituciones de la cromatina: