Cultivos celulares

Tema 2. División celular

Prof. Mirja Rotinen

Departamento de Ciencias de la Salud
Universidad Pública de Navarra
 • Fase M (estado de división): mitosis+citocinesis
El ciclo celular: fases del ciclo • Interfase (estado de no división): G1, S y G2
El ciclo celular: fases del ciclo y puntos de control
En un hipotético ciclo de 24 h:

Montuenga L. Técnicas en histología y biología celular. Ed. Elsevier Masson 2ª Edición.

• Fase G1: 6-12 h
• Fase S: 6-8 h
• Fase G2: 3-4 h
• Fase M: 1 h

• Fase G0: resting state/salida del

ciclo

3 PUNTOS DE CONTROL:
• R: Punto de restricción o “de no
retorno” (G1 checkpoint)
• Punto de control crítico G2/M
(G2/M checkpoint)
• Punto de control M
Karp, G. (2019) Biología celular y molecular. McGraw-Hill Interamericana de España S.L.

Karp
 Las etapas de la mitosis:
https://www.youtube.com/watch?v=L61Gp_d7evo

Karp, G. (2019) Biología celular y molecular. McGraw-Hill Interamericana de España S.L.

Karp

3. El aparato de Golgi y el retículo

endoplásmico se fragmentan. La envoltura
nuclear se dispersa
Karp, G. (2019) Biología celular y molecular. McGraw-Hill Interamericana de España S.L.
 Duración del ciclo según el tipo celular
2. Células que normalmente no se dividen
pero cuya división puede inducirse.
Ejemplos: células hepáticas tras
extirpación quirúrgica, linfocitos…

3. Células que poseen un nivel relativamente alto

de actividad mitótica
Ejemplos: células madre de diversos tejidos
adultos como las HSC o las que se
encuentran en la base de mucho epitelios
que recubren cavidades y la superficie del
cuerpo

1. Células altamente especializadas y

carentes de capacidad de división.
Ejemplos: neuronas, células
musculares, glóbulos rojos…
 Regulación del ciclo celular: el papel de las proteínas cinasas
MPF, maturation-promoting factor
(factor promotor de la maduración) CDK, cyclin-dependent kinases
• subunidad con actividad cinasa Cinasas dependientes de ciclina
Karp, G. (2019) Biología celular y molecular.
McGraw-Hill Interamericana de España S.L.

• subunidad con actividad ciclina

Weinberg, R.A. The Biology of Cancer, 2nd Edition. W. W. Norton & Company, 2013.
 Regulación del ciclo celular: el papel de las proteínas cinasas
ECM

integrins

Weinberg, R.A. The Biology of Cancer, 2nd Edition. W. W. Norton & Company, 2013.
Regulación del ciclo celular: inhibidores CDK

TGF-β
Regulación del ciclo celular: inhibidores CDK
Técnicas de análisis de la proliferación y del ciclo celular
en células en cultivo:

´ Citometría de flujo

´ Análisis de la proliferación mediante recuento celular

´ Análisis de la proliferación y citotoxicidad mediante técnicas colorimétricas de

la actividad metabólica celular

´ Análisis del número de células en fase S mediante bromodeoxiuridina o timidina

tritiada
 Citometría de flujo:

• Permite el estudio de múltiples parámetros en una única célula.

• Permite obtener información sobre poblaciones celulares a partir de un estudio individualizado de un gran
número de células.
• Ventaja: permite el análisis de una gran cantidad de células, obteniendo datos de alto valor estadístico.
• La muestra debe estar en suspensión para poder ser analizada.
 Partes de un citómetro:

´ Sistema de fluidos: para recoger

las muestras y poder restringir su
paso por la cámara de flujo.
´ Sistema óptico: al menos una
fuente de excitación (láser) y una
serie de lentes y prismas.
´ Sistema electrónico: fotodiodos y
fotomultiplicadores convierten las
señales de luz en electrónicas
para poder ser digitalizadas y
analizadas.

Tipos de señales recogidas:

´ La generada por la dispersión de

la luz
´ La generada por emisión de luz
por los fluorocromos

Células alineadas en “fila india”

Análisis de diferentes parámetros:

´ El tamaño relativo de la célula (parámetro FSC, forward scatter) gracias a la difracción de la luz en sentido
frontal cuando ésta se dispersa al impactar con la célula.

´ Su complejidad (parámetro SSD, side scattered): se obtiene cuando la luz incide en la célula y se refleja de
forma lateral. La luz puede entrar a la célula y ser reflejada o refractada por el núcleo y otros organelos, así
que la luz detectada a 90º por los fotomultiplicadores indica la complejidad relativa de la partícula o célula. En
este ángulo de desviación también es detectada la fluorescencia.

´ Expresión de moléculas de superficie o del interior de la célula (marcadores): utilizando anticuerpos

específicos para su detección, los cuales deben estar conjugados con fluorocromos.
 ´ Caracterizar y separar poblaciones celulares (sorters)
Aplicaciones: ´ Análisis del ciclo celular
´ Medida de la proliferación celular
´ Apoptosis
´ Y muchas más: purificación de células antígeno-específicas,
diagnóstico de leucemias y linfomas mediante detección de células
con fenotipos aberrantes, monitorización de tratamientos, etc.

Ciclo celular:

Ø (2N) Diploides: dos series de cromosomas: 23x2=46

(humano). Células en fase G0 o G1
Ø (4N) Tetraploides: cuatro juegos de cromosomas.
Células en fase G2/M (en G2 y antes del proceso
mitótico (M)).
 Montuenga L. Técnicas en histología y biología celular. Ed. Elsevier Masson 2ª Edición.
Citometría de flujo:

DNA fragmentado resultado de un proceso

apoptótico inducido por un agente
genotóxico (estaurosporina)

Sincronizar = inducir el arresto en una fase

específica del ciclo
• eliminar el suero del medio de cultivo (24-72h)
• tratar con hidroxiurea (inhibe la replicación del DNA)
 Técnicas de análisis de la proliferación y del ciclo celular
en células en cultivo:

´ Citometría de flujo

´ Análisis de la proliferación mediante recuento celular

´ Análisis de la proliferación y citotoxicidad mediante técnicas colorimétricas de

la actividad metabólica celular

´ Análisis del número de células en fase S mediante bromodeoxiuridina o timidina

tritiada

*Simple recuento en sucesivos momentos para calcular así el tiempo en el que

se dobla la población: Práctica cálculo del tiempo de dupliación
Técnicas de análisis de la proliferación y del ciclo celular
en células en cultivo:

´ Citometría de flujo

´ Análisis de la proliferación mediante recuento celular

´ Análisis de la proliferación y citotoxicidad mediante técnicas colorimétricas de

la actividad metabólica celular

´ Análisis del número de células en fase S mediante bromodeoxiuridina o timidina

tritiada
 Análisis de la proliferación y citotoxicidad mediante técnicas colorimétricas de la
actividad metabólica celular (que de modo indirecto refleja la cantidad de células presentes en un cultivo)

mitocondrial
reductase

sal de tetrazolio

CellTiter-Glo
Análisis del número de células en fase S mediante
bromodeoxiuridina o timidina tritiada:
Contador de centelleo
Timidina tritiada

Anticuerpos anti-BrdU
conjugados con
fluorocromos,
peroxidasa…

Bromodeoxiuridina (BrdU)