BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

Programa de Microbiología
Genética Microbiana
Tecnología del DNA recombinante

Alba Rocío Corrales Ducuara

PhD en Biotecnología y Recursos Genéticos de Plantas y
Microorganismos Asociados
 TIPOS DE CLONACION
I. Tecnología del DNA o ADN Recombinante : “Recombinant DNA Technology”

También conocida como:

- Clonación de DNA: "DNA cloning"

- Clonacion molecular : "molecular cloning,"
- Clonacion de genes "gene cloning
II. Clonación Reproductiva “Reproductive Cloning”: Generar un nuevo
Organismo
III. Clonación Terapeútica “Therapeutic Cloning”: Empleo de Stem cells
 HISTORIA

1943: Luria & Delbruck observaron que bacteriófagos que infectaban fácilmente un
determinado linaje de bacteria, no podían infectar otro linaje.
1962: Arber & Dossuoix propusieron un mecanismo molecular para el fenómeno de
restricción. Ciertos linajes de bacterias contendrían endonucleasas capaces de
clivar el DNA invasor (RESTRICCIÓN al crecimiento del fago)
1970: advenimiento de las endonucleasas de restricción.
1978: Arber, Smith e Nathans: Premio Nobel en Fisiología e Medicina.
 Clonación de DNA

Una clonacion es definida como un gran numero de células o

moléculas
todas idénticas provenientes de un origen único.
Clonación del DNA ha sido posible por:
Enzimas de restricción.
La capacidad de los vectores de clonación de multiplicarse después
que DNA ha sido insertado en su genoma.

Clonación del DNA

Es la inserción de DNA en un vector de clonación y luego este
vector con el DNA debe ser introducido en una celula hospedera
(bacterias o levaduras).
 Esquema general de clonación de una secuencia o
DNA

Vector DNA a clonar

Célula Selección de
hospedera clonas

Tranformación
 Proceso de clonación requiere:
A. DNA Blanco:

✓ PCR: Primers especificos y purificar el fragmento amplificado

✓ RT-PCR: cDNA y luego primers especificos y purificar el fragmento amplificado.

✓ DNA genómico.

B. Vectores de Clonación-Expresión: Elementos

✓ Plásmidos, cosmidos, fagos, Bac, Yac, etc.

C. Célula hospedera:
✓ E. coli, levaduras, Células de insectos.

D. Métodos de transformación:
✓ Infectividad.
✓ Cloruro de calcio, cloruro de litio, liposomas, etc.
✓ Electroporación, balística o shot gun.
E. Método de tamizaje de la presencia del inserto.

✓ Inicialmente, que la bacteria crezca en presencia del marcador de

selección.
✓ Cambio de coloración de la colonia bacteriana.
✓ PCR.
✓ Miniprep y digestión con enzimas de restricción.
✓ Hibridización con una sonda.
✓ Evaluando la expresión o actividad de la proteína..
Multiplicación del Plasmido
"Vector" es un agente que puede llevar un fragmento
de DNA dentro de una célula hospedera.

Vector de clonación: Si es usado para reproducir un fragmento

Vector de expresión: Si es usado para expresar cierto gen.

PLASMIDOS
Son DNA circular (excepciones) de doble cadena que existen en
bacterias y en el núcleo de algunas células eucarióticas. Se pueden
replicar independientemente de la célula hospedera. El tamaño de un
plasmido oscila entre unas pocas kilobases hasta 100 kb.
Clonación usando un vector plasmidico
PLASMIDO DE EXPRESION
TA Cloning
Topo directional cloning
GC cloning systems

EconoTaq
Propiedades deseables de un plasmido:

➢ Debería ser pequeño.

➢ Secuencia debería ser conocida.

➢ Alto numero de copias. Origen de

replicación

➢ Debe contener un marcador de

selección.

➢ Debería contener un segundo

marcador de selección que se inactive
por la inserción del DNA clonado.

➢ Tener un gran numero de sitios únicos

para ER en uno de los dos marcadores
de selección.

LacZ codifica la β-galactosidasa.

Lacl – codifica el factor que controla la

transcripción of lacZ.
 Ciclos del Fago Lambda en una bacteria

Ciclo
Ciclo
Lisogenico
Litico
Ligación en el fago lambda
 Clonación en Fago Lambda
Son virus que infectan bacterias. La principal ventaja de estos vectores es
su alta eficiencia de transformación, alrededor de 1000 veces mas que un
vector tipo plásmido.
Empaquetamiento del Fago Lambda
Clonación en el Bacteriofago P1
Cosmidos

Son una combinación de un plasmido y los sitios cos, lo cual permite

empaquetar este DNA en la cabeza de un virion y luego ser introducido
en bacterias facilmente.
Procedimiento para clonar DNA en cosmidos
Clonación en Cromosomas artificiales de Bacterias (BAC)
 Elementos de un YAC

▪ Centromeros (CEN)

▪ Telomeros (TEL).

▪ Secuencias replicantes Autónomas (ARS.

para proliferación en la cel. hospedera.

▪ ampr para amplificación selectiva

▪ Marcadores de selección tales como TRP1 y

URA3.

▪ Sitios de clonación para ER (e.g., EcoRI y

Bam HI)
Clonación en Cromosomas Artificiales de Levaduras (YAC)

Los cromosomas artificiales de levaduras (Yeast Artificial Chromosome)

(YAC) es capaz de llevar fragmentos de DNA muy largos (hasta 2 Mb), pero
la eficiencia de transformación es muy baja.

SUP4
Clonación en Cromosomas Artificiales de Levaduras (YAC)

Sup 4 dañado: colonias rojas

 Transformación: CaCl2

--
-- --
--
-- -- -- --
-- -- -- -- Ca Cl2
+ +- -- + +
-- -- + + +
-- + + --
+ + -- --
+ + -- --
+ + -- --
--
Bacteri
-- + a +
-- --
+
-- -- + + --
-- -- + + -- --
-- + + + + -- --
+ +
-- + +
-- -- -- -- Plasmido
--
-- -- s
-- -- --
ELECTROPORACIÓN

DNA

PULSE

Sitio de
permeació
n
 Antibiotico

Antibiotico

Purificación del Verificar el fragmento

plásmido clonado
 Selección de bacterias
transformadas
por resistencia a Antibióticos.
▶ El medio en la caja de
petri contiene el
antibiótico Kanamicina.
▶ La bacteria en la parte
superior contiene el
plásmido Kanr, mientras
la bacteria sembrada
en la parte inferior no
contiene plásmido.
▶ Note la diferencia en el
crecimiento
Sistema de Tamizaje de las células transformadas
Lac Z complementación
 lacZ gene: Beta-galactosidase
Plasmid

Cut plasmid for ligation

in lacZ region

Ligar genomic DNA

No Beta-galactosidase produced!

Amplify in X-gal and

IPTG

Select white colonies

Tamizaje Azul-Blanco
Tamizaje Azul-Blanco
Verificación o detección del fragmento clonado
1. Miniprep y enzima de restricción.
2. PCR.
3. Sonda (Southern blot).
4 Detección de la proteína (western blot).
 Miniprep y digestión con ER

Purificación del plasmido

ER ER

pCML
5900 + 594

Electroforesis post-digestion
Con enzima de restriccion
Métodos de detección de la clona con el inserto.

Southern Blot en bacterias: Sonda

Caja petri con

colonias

Transferencia a filtro

Detección de las
bacterias
transformadas
con el gen de interés
Southern Blot en fagos: Sonda
Tamizaje usando anticuerpos
Clonación y expresión de proteínas en células
eucarióticas

Saccharomyces cerevisiae
Características de por que se emplea este microorganismo:

1. La existencia de herramientas para el manejo del DNA de Levaduras, incluyendo

vectores de expresión y cepas

2. Un amplio conocimiento de la genética y bioquímica del organísmo

3. Vía secretoria eucariótica (no es muy eficiente para proteínas recombinantes,

especialmente para alto PM)

4. Modificaciones post-traduccional eucarióticas (N-linked y O-Linked, sin embargo

hay diferencias con los mamíferos).

5. Organísmo seguro.
 Vectores de Expresión en S. cerevisiase

Vector Promotor Marcador

pTK46 PGK1 URA3

pTEK432 CUP1 TRP1

pMA230 PGK1 LEU2

pMIRY 2 GPDI LEU2-d

Pybdt-10 PHO5 TRP1

PGK1 LEU2

pYEULS1 PGK1 LEU2-d

URA3

Células de insectos: Bacuolovirus

 PARA QUE SE CLONA DNA?
1. Conocer la secuencia

2. Expresar una proteína

3. Para conocer secuencias regulatorias.

4. Conocer secuencia de microorganismos de difícil cultivo o no cultivables.

5. Inducir mutagénesis.

6. etc
 Fusion proteins

• Tag expressed protein with another

protein or short peptide
 Tipo de etiquetas
• Proteínas fluorescentes:
Ejemplos es la proteína verde fluorescente o GFP
• Etiqueta de epítopo:
Secuencia peptídica corta que tiene un anticuerpo que
lo reconoce específicamente
• Quelador de metal:
Puede unirse a Ni o Co-quelado e inmovilizado
• Proteínas Fusion:
MBP, tioredoxina,
 Type of Tags
• Fluorescent proteins
– Examples is the green fluoresecent protein
or GFP
Expresión y purificación de la proteína
recombinante

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11.5 KDa