Clase Sesión 10

Métodos en biología celular

1.- Cultivos celulares

2.-Fraccionamiento celular

3.- Aislamiento y caracterización de macromoleculas celulares:

- Anticuerpos
- Inmunohistoquimica
- Separacion de Proteinas: Cromatografia y electroforesis
Cultivos Celulares
 Equipo Básico de un laboratorio de Cultivo Celular

1. Campana de flujo laminar

5. Nevera y Congelador
2. Baño termostatizado
6. Microscopio Invertido
3. Incubador CO2
7. Micro centrifuga
4. Autoclave
8. Depósito de Nitrógeno líquido
 CULTIVO CELU<LAR

⚫ Conjunto de técnicas que permite el mantenimiento

de las células “in vitro”, manteniendo al máximo sus
propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

⚫ Cultivo en microorganismos, cultivo en animales,

cultivo en vegetales.
 CULTIVO DE CELULAS ANIMALES

⚫ Las células de los animales requieren 9 aminoácidos:

histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
fenilalanina, treonina, triptofano, valina.
⚫ Medio Enriquecido: vitaminas, sales, glucosas, suero.
⚫ Antibióticos: estreptomicina (Gram +/-), penicilina (Gram
+), amfotericina (levaduras y hongos)
⚫ Tampón pH
⚫ Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (2-50%).
CLASES DE CULTIVOS

❖PRIMARIOS: Se obtiene directamente de los

tejidos animales o vegetales.

❖SECUNDARIOS: Se obtiene de tomar una muestra

de los primarios y su nuevo cultivo en otra cápsula
de petri.

❖DE LINEAS ESTABLECIDAS: son los que derivan de

tumores
Fraccionamiento subcelular
Fraccionamiento subcelular
Entre las aplicaciones más comunes que tienen los anticuerpos
en la investigación científica se encuentran:

-Identificación y localización de proteínas intra y extracelulares

- Inmunoprecipitación

- Análisis Western blot

- Inmunohistoquímica

- Inmunofluorescencia
 Inmunohistoquímica
• Fijación
• Lavados con tampón
• Permeabilización
• Incubación ac 1rio
• Lavados
• Incubación ac 2rio
• Microscopía
 Ensayo inmunoenzimático (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas)

ELISA es una de las técnicas más utilizadas para identificar o confirmar la especificidad de los
anticuerpos presentes en las muestras de los pacientes con enfermedades autoinmunes.

La placa ELISA de 96 pocillos se recubre

con antígenos específico, los cuales son
reconocidos por los anticuerpos
presentes en los sueros de los pacientes.
La unión se revela cuando se adiciona un
anticuerpo anti-Fc humana conjugado
con una enzima. Al agregar el sustrato de
la enzima cambia de color el medio.
 3.- Inmunohistoquímica
Fijación
Lavados con tampón
Permeabilización
Incubación anticuerpo primario
Lavados
Incubación anticuerpo secundario
Microscopía de Inmunofluorescencia
Anticuerpo decundario unido a fluorocromo

citoesqueleto de actina, en verde

membrana plasmática, en rojo

núcleos celulares, en azul

Células HeLa.
 DETECCIÓN DE MARCADORES EN HISTOLOGÍA

CITOESQUELETICOS(ACTINA) CITOESQUELETICOS(QUERATINA) NEUROFILAMENTOS(CEREBELO)

NEUROFILAMENTOS(CITOESQUELET
GERMINALES(I.EMBRIONARIO HORMONALES(INSULINA)

LINFOCITARIOS(INTESTINO
HORMONAL(TIROGLOBULINA) MUCUOSA INTESTINAL
DELGADO)
Separación de proteínas
 Cromatografía
•Método mediante el cual se separan moléculas basado en las diferencias
existentes entre su estructura y/o composición.
•Generalmente, los compuestos a separarse lo hacen sobre un soporte
estacionario.
•Los distintos niveles de interacción entre el soporte estacionario y las moléculas
permitirán a estas ultimas migrar lenta o rápidamente a través del soporte.
•Separaciones cromatográficas pueden ser hechas usando una variedad de
soportes: silica inmovilizada en placas de vidrio (cromatografía de capa fina), gases
volátiles (cromatografía de gases), papel (cromatografía de papel), líquidos
(cromatografía liquida).
Cromatografía de exclusión molecular
Cromatografía de intercambio iónico
 Intercambio iónico
- -
+ - + +
- - -
+ - + - + -
+ - + + - - -
+ - + - -
- - +
- - -
+ - + +
- +
- -
+ - - +
- -
+ - + - - + -
+ - + - - + - -
- -
+ - + - - + -
Proteínas adsorbidas A baja concentración A mayor concentración
al intercambiador de sal, se desprenden de sal se desprenden
iónico las proteínas más
las proteínas menos
electronegativas electronegativas
Cromatografía de afinidad
 Cromatografía de afinidad

1 2 3
Electroforesis
Western blot

El Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, es una técnica analítica usada

en biología celular y molecular para identificar proteínas específicas en una mezcla
compleja de proteínas, tal como la que se presenta en extractos celulares o
de tejidos. La técnica utiliza tres etapas para lograr esto:
-Separación por electroforesis (por tamaño),
- transferencia a un soporte sólido (papel de nitrocelulosa) y,
- finalmente, visualización mediante la unión específica de proteína (antígeno) con
el anticuerpos primarios y secundarios apropiados.
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Métodos en biología celular