UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS

ARMADAS – ESPE.
Departamento de Ciencias de la vida

Carrera de Agropecuaria

Informe de la práctica #2

NRC: 16263

Elaborado por:
Carlosama Bolaños Andi Abdiel

Docente:
Dr. Petronio Gavilanes
Año
2024
 DEPARTAMENTO DE CIENCIAS EXACTAS

UNIDAD N° 1

INFORME DE PRACTICA N°

1. Tema: Fundamento de un ensayo de cuantificación de proteínas utilizando el reactivo

de Bradford.

2. Objetivos.

1. Estudiar los principales conceptos y definiciones sobre la espectroscopia de

absorción molecular. Revisar el libro de Bioquímica de Harper y otras fuentes
bibliográficas.
2. Utilizar la ley de Lambert y Beer en la determinación de proteínas con el reactivo de
Bradford
3. Utilizar un simulador para construir una curva de calibración de proteínas.
4. Determinar las concentraciones de la muestra problema de proteína utilizando la
curva de calibración.
5. Obtener el espectro correspondiente a la proteína estudiada.

3. Marco teórico

La espectrofotometría es una forma específica de fotometría en la que la luz se mide en

función de la longitud de un rango determinado (Frenzel & McKelvie, 2008). Es una forma
técnica para medir cuánta luz absorbe una sustancia química.

La espectroscopia de absorción se puede individualizar una amplia gama de sustancias

carbonatadas o minerales. las longitudes de ondas, las intensidades están determinadas por
las estructuras iónicas (Kennedy, 2022). Para ciertas sustancias , los espectros de absorción
UV son causados por transiciones electrónicas. Un espectro puede contener más de una
región de absorción, llamada banda o sistema de bandas ya que tiende a experimentar una
serie de transiciones electrónicas diferentes (Wormell, 2013).
El espectro de absorción es eficiente en captar la intensidad de la absorción de luz por una
sustancia a la que sea sometida a diferentes longitudes de ondas. El espectro de absorción
UV-visible es útil para observar cambios en grupo funcionales y mediciones cuantitativas
de cualquier molécula ya que es muy sensible a estos, determinar la concentración de una
muestra (Tissue, 2002).

Fig.1 Espectro de absorción.

Ley de Lambert-Beer

August Beer en 1852 manifestó que la capacidad de absorción de una sustancia disuelta es
directamente proporcional a su concentración en una solución. En espectroscopia, la
relación se puede expresar A = ε l c donde A es la absorbancia, ε es es el coeficiente de
absorción molar, I es la longitud del camino que debe recorrer la luz en la solución en
centímetros y C es la concentración de una solución dada (Rafferty, 2023).

Determinación de proteínas con el reactivo de Bradford

El procedimiento de Bradford es un método colorimétrico, el cual depende de la unión del

colorante Coomassie Blue G250 a la proteína se lo utiliza ya que es rápido y preciso para
medir la concentración de proteínas (Kruger, 2009). S e basa en la cuantificación de
cambios de color por motivo de la union de moleculas a una muestra de un tinte especia: el
azul comassie.
La calibración de instrumentos conlleva la construcción de una curva de calibración que
favorece predecir la concentración analitica en una muestra a partir de la lectura de un
instrumento (Niazi, 2023). Esta curva es el modelo de regresión lineal que mejor se ajusta a
la relación entre algunos patrones de concentración conocidos y las respectivas respuestas
de los instrumentos.
 Fig.2 Absorbancia y concentración.

4. Materiales y equipos.

● Simulador
● Excel
● Calculadora

5. Procedimiento
● Analizar el documento en video sobre la ley de Lambert y Beer aplicado a la curva de
calibración. Espectrofotometría absorción molecular UV visible
● Acceder al simulador https://biomodel.uah.es/lab/inicio.htm

● Escoger ensayo A) Espectros.

● Se despliega la pantalla siguiente
6. Resultados

Diseño del experimento

Se preparó una cubeta sólo con reactivo de Bradford y otras dos cubetas diferentes de
disolución de proteína proteína de bradford. Se añadió a todas las cubetas la cantidad
de reactivo necesaria para un volumen total de 3 mL en cada una. por consiguiente se
rellenó esta tabla con los volúmenes adecuados:

Fig 3. Volúmenes de cada cubeta rellena en la tabla.

Calibración:

Para la calibración en el espectrofotómetro,se introdujo la primera cubeta (reactivo de

Bradford) para ajustar la longitud de onda a 595 nm y pulsar el botón “A=0”.A la cual
se le denomino "tubo blanco" o "blanco de reactivos" y sirve para que el color propio
del reactivo no se considere en la determinación de proteínas.
 Fig 4. Espectrofotómetro calibrado.

Medida
Acto seguido se introdujo el resto de cubetas, de una en una, en el espectrofotómetro y
anotar sus medidas de absorbancia.

Fig 5. Medidas de absorbancia.

Análisis cualitativo de resultados

Se puede observar a medida que aumenta la concentracion de proteínas cambia de
intensidad de color. También cuando la concentración aumenta la absorbancia tiende a
aumentar. El tubo blanco nos da una referencia para la absorbancia del reactivo sin la
presencia de proteínas.

Cubeta 1 A= 0.181

cubeta 2 A= 0.374

cubeta 3 A= 0.546
 Fig 6. Resultados de las muestra a través del espectrofotómetro

Análisis cuantitativo de resultados

Se calculó la concentración de proteínas en la mezcla final de cada cubeta, sabiendo que
la concentración en la botella es de 800 mg/L. Por consiguiente se realizó una tabla con
los datos representando A frente a C.

Existe relación entre la absorbancia y concentración por lo que nos demuestra que a
medida que aumenta la concentración, la absorbancia también aumenta.

Cubeta # 1

Cubeta # 2

Cubeta # 3

Fig 7. Tabla con los datos de concentración y absorbancia.

 Curva de calibración
Se realizó el gráfico en excel para tener una mejor demostración

Fig 8. Gráfica representando A frente a C.

Pregunta
Se mezcla 1 mL de una muestra problema con reactivo de Bradford, para un volumen total
de 3 mL. Calcula la concentración de proteínas en la muestra de partida si el ensayo ha
proporcionado un valor: A595= 0.225
Ley de Lambert-Beer

A = ε·c·l

Espectro de la proteína de Bradford

Fig.9 Espectro de la proteína de Bradford.

7. Conclusiones.

1) Se logró comprender los conceptos claves sobre la espectroscopia de la absorción

molecular y su importancia para la bioquímica con el estudio de ácidos nucleicos,
lípidos y carbohidratos.
2) La ley de Lambert y Beer para la cuantificación de proteína permitió un mejor
entendimiento con relación a la absorbancia y concentración, a medida que la
concentración aumenta la absorbancia tiende a incrementar, el caso del reactivo
Bradford con el tubo blanco que nos ayuda a corregir la absorbancia inherente del
reactivo.
3) Se logró conseguir la curva de calibración gracias al simulador por lo que también
familiarizarse con su funcionamiento.
4) La determinación de las concentraciones con la curva de calibración favorece para
mediciones precisas o específicas.
5) Finalmente se puede apreciar el espectro de la proteína estudiada.
8. Recomendaciones.

1) Leer atentamente los pasos, ya que se puede descartar un paso importante.

2) Visualizar videos de apoyo relacionados con el tema y la plataforma, ante
cualquier duda.

9. Bibliografía.

Frenzel, W., & McKelvie, I. D. (2008). Photometry. En Elsevier eBooks (pp.

311-342). https://doi.org/10.1016/s0166-526x(08)00612-0

Kennedy, P. (2022). Absorption spectroscopy - Ibsen Photonics. Ibsen Photonics.

https://ibsen.com/technologies/absorption-spectroscopy/

Kruger, N. J. (2009). The Bradford method for protein quantitation. En Springer

protocols (pp. 17-24). https://doi.org/10.1007/978-1-59745-198-7_4

National Toxicology Program. (2021). Phenolphthalein. 15th Report on

Carcinogens - NCBI Bookshelf.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK590820/

Niazi, M. A. (2023). What is instrument calibration and why is it needed? Technical

Articles.
https://control.com/technical-articles/what-is-instrument-calibration-and-why-
is-it-needed/

Rafferty, J. P. (2023). Beer’s Law. Definition, Equation, & Facts. Encyclopedia

Britannica. https://www.britannica.com/science/Beers-law
The Editors of Encyclopaedia Britannica. (1998). Phenolphthalein.PH Indicator,
Acid-base Titration, Indicator Dye. Encyclopedia Britannica.
https://www.britannica.com/science/phenolphthalein

Tissue, B. M. (2002). Ultraviolet and visible absorption spectroscopy.

Characterization of Materials. https://doi.org/10.1002/0471266965.com059

Wormell, P. (2013). Absorption spectroscopy: relationship of transition type to

molecular structure. En Springer eBooks (pp. 35-38). https://doi.org/10.100

Anexos