https://fr.wikipedia.org/wiki/BamHI#/media/File:PDB_1esg_EBI.

jpg

https://es.kisspng.com/kisspng-e27at5/preview.html
INTRODUCCIÓN
• Nucleasas:
Endonucleasas
Exonucleasas

https://es.wikipedia.org/wiki/EcoRI#/media/File:EcoRI.png http://www.wikiwand.com/gl/Enlace_fosfodi%C3%A9ster
Miguelfering
 Fenómeno de restricción y modificación del ADN
Replicación restringida de bacteriófagos

Stewart Linny y Werner Arber

Degradación y metilación del DNA

https://gph.is/299tCI8

• Cepas de E.coli
• Restringen
permanencia de
DNA exógeno

Werner Arber
https://www.premiosfronterasdelconocimiento.es
/jurado/werner-arber/
www.shutterstock.com
 Cortan particularmente en
secuencia DIANA
SECUENCIA DIANA
Longitud 4-8 pb
Lugar Interior de una
https://gifimage.net/tijeras-gif-11/
molécula de
DNA

Por lo general, es palindrómica

5´- AATTCGAATT-3´

3´-TTAAGCTTAA-5´
 Tipos de corte de la enzima
EXTREMOS COHESIVOS EXTREMOS ROMOS

Figura 14-2 Salazar Montes, A. M., Sandoval Rodríguez, A. S., & Armendáriz Borunda, J. S. Biología molecular:
Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud / Adriana María Salazar Montes, Ana Soledad Sandoval

SIMÉTRICA
Rodríguez y Juan Socorro Armendáriz Borunda (2a. ed.--.). México D.F.: McGraw Hill.

ESCALONADA
 SISTEMA R/M
Las bacterias metilan su DNA para
diferenciarlo del DNA viral, lo que
evita su corte.

Metiltransferasas
lleva metilos
de SAM

Da protección
R reconocen misma secuencia que metilasas y Figura 14-1 Salazar Montes, A. M., Sandoval Rodríguez, A. S., & Armendáriz
Borunda, J. S. Biología molecular: Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de

cortan fosfodiéster del DNA invasor la salud / Adriana María Salazar Montes, Ana Soledad Sandoval Rodríguez y
Juan Socorro Armendáriz Borunda (2a. ed.--.). México D.F.: McGraw Hill.
METILACIÓN DEL ADN
 La metilasa metila una base determinada
siempre dentro de la secuencia de
reconocimiento.
 Los grupos metilos se transfieren a través de
SAM (S-adenosilmetionina) https://revistageneticamedica.com/blog/que-es-epigenetica/

https://todosigueigual.wordpress.com/tag/saliva/
TRANSFERENCIA DE METILOS

ADENINA N6-metiladenina
http://www.canalgif.net/Gifs-animados/Medicina/Virus.asp

N4-metilcitosina
CITOSINA
C5-metilcitosina

Sistema Bacteriófagos pueden

inmune sintetizar sus propias
procariota metilasas o sintetizar
proteínas
Tipos de enzimas de
restricción
http://pixelart.studio/Gallery/Details/90e39fef-7af6-475c-
ba1b-c0cb051ce165
Shmee-Shmoo

TIPO I TIPO II TIPO III

Estructura 2 ->R M 1-> R
2 -> M R 1-> M
1 -> S S
Gasto ATP X ATP
energético
Donador SAM X SAM
metilos
Cofactor Mg2+ Mg2+ o Mg2+
Mn2+
 TIPO I TIPO II TIPO
III
Sitio de Aleatorio Específico Aleatorio
corte (DIANA) 25-27pb corriente
abajo
Actividad  X 
metilasa
Producto N6- X N6-
metiltransferasa metiltransferasa
NOMENCLATURA
Basado en Hamilton Smith y Daniel Nathans en 1973.
a) Tres letras 1- Genero y 2- Especie
b) Letras o número de acuerdo a la cepa
c) Números romanos que van de acuerdo a la cronología
en que se aislaron de la misma especie.
d) Actividad R o M
 https://gifimage.net/tijeras-gif-11/

ISOESQUIZÓMEROS
Enzimas de restricción obtenidas de diferente especie
bacteriana pero que reconocen la misma secuencia
DIANA de DNA y cortan en diferentes nucleótidos

MISMA SECUENCIA CORTA DIFERENTE

Reconocen
5´- GGTAC-3´

Asp718I KpnI Corta enlace

Achromobacter species Klebsiella pneumoniae entre AC

Corta enlace
entre GG https://gifimage.net/tijeras-gif-11/
 Familias de enzimas de restricción
Secuencias que no necesariamente reconocen la
misma secuencia pero producen extremos cohesivos
similares

Bam HI 5´-GGATCC-3´ 5´-G GATCC—3´

Bacillus amyloliquefaciens
3´- CCTAG G– 5´
Bgl II
Bacillus globigii
5´- AGATCT-3´ 5´-- A GATCT—3´
3´--TCTAG C—3´
EMPLEO DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
EN LABORATORIO
1- Tomar gen de interés y 5-
amplificarlo.
2-Identificar presencia del gen de
interés
3-Tomar Producto del PCR y
añadir enzima
4- Termociclador 16 horas

http://www.cecalc.ula.ve/bioinformatica/BIOTUTOR/pregs/preg9.htm

https://es.kisspng.com/kisspng-1szxtm/
6- Obtención del mapa de restricción

A. Marroquín-Ortega, J & Aguirre-Arzola, Victor & R. Moreno-Medina, V & Bujanos Muñiz, Rafael & Galán-Wong, L & H.
Morales-Ramos, L & Pereyra-Alférez, Benito. (2009).

https://www.neb.com/products/n3041-puc19-vector#Product%20Information
Factores que afectan la actividad de
las enzimas de restricción
Existen factores que permiten tener una alta eficiencia,
si no se cubre la actividad disminuye.
1. Pureza biológica del DNA

Libre de 260/280 Entre 1.8 y 2

proteínas
Productos 260/230 Entre 2 y 2.2
fenólicos

Menor que 2 -> EDTA, carbohidratos y fenol

2. Contaminantes: Detergentes y estabilizadores

Libre de SDS Y EDTA

Cuidado en separar fase acuosa

donde está el ADN

3. pH y temperatura adecuados (Cuidar que no haya

fluctuaciones)

4. Grado de metilación del DNA

DNA metilado -> no hay restricción

 Almacenamiento
Temperatura -20 ℃

Evitar ciclos de congelamiento y descongelamiento

Usar contenedor frío (4,- 20) ℃

Almacenar lo antes posible

www.canva.com
Para trabajar con enzimas de
restricción se debe tener en cuenta:

• Volumen de reacción
• Temperatura
• Tiempo de incubación
• Requerimiento de aditivos albúmina, ATP

¿Qué cantidad de enzima? https://es.pngtree.com/freepng/color-cartoon-test-tube-

vector_2641688.html

1 unidad de enzima= Enzima necesaria para digerir

1 µg de DNA en 60 min en (u/µl)
 ¿Cómo escoger la enzima
adecuada?
Plásmido DNA genómico

Mirar mapa de • Contar

restricción secuencias
• Predecir sitios
de corte
• Predecir tamaño

Introduciendo secuencia en
¿Cómo?
base de datos
Construcción de un plásmido
recombinante
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase

1) Secuencias reconocidas tanto en el plásmido

como en gen blanco por EcoRI
Patrón de corte de EcoRI  5'-G|AATTC-3' 3'-CTTAA|G-5'

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase

2) Se corta por separado el gen del plásmido y el del

gen blanco producción de extremos cohesivos
 https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase

3) Unión por medio de ADN ligasa el gen y el plásmido

abierto  unión por complementariedad de bases

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase

4) Gen blanco se inserta en el plásmido y se obtiene

un plásmido recombinante
www.canva.com