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Interpretacin de las pruebas

bioqumicas comnmente
utilizadas en Bacteriologa
clnica

Q.B.P. JORGE GOMEZ GUADALQUIVIR


Criterios de Cowan y Steel
Cada cepa por identificar se trabajar de la siguiente
manera:

Pruebas primarias:
Requerimientos de nutrientes
Atmsfera (requerimiento de O2) y temperatura
Morfologa colonial
Tipo de hemlisis en GS carnero al 5%
Produccin de pigmentos
Tinciones: Afinidad a la tincin de Gram
Morfologa bacteriana
Reaccin de catalasa
Reaccin de oxidasa
Cowan y Steel

Pruebas secundarias:

Prueba de movilidad
Pruebas de fermentacin de carbohidratos
Presencia de enzimas
Reacciones Serolgicas
Sensibilidad antimicrobina
Tincin Gram
(cultivo fresco)
+ + + + + + + +

Forma coco coco coco coco bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn coc

racimo
Agrupacin racimos cadenas tetradas par
s

Crecimiento
aerobio
+ + + + + + + + + + + +

Crecimiento
anaerobio
+ + + + + + + +

Esporas + + +
Movilidad +o +o +o +o +o +o- +
Catalasa + + + + + + + + +
Oxidasa + + + +
Fermentacin de
glucosa a acido + + + + + + + +
o a acido+gas

O/F O F F O
Micrococcus X
Staphylococcus X
Streptococcus X
Lactococcus X
Enterococcus X
Leuconostoc X
Pediococcus X X
Aerococcus X
Lactobacillus X
Clostridium X
Bacillus X X
Alcaligenes X
Pseudomonas X
Enterobacterias X
Requerimientos de
nutrientes
Conocer que suplementos nutricionales que
requiere MO para crecer ptimamente.
Ejemplo: dependencia de F(V), F(X) ambos
en el gnero Haemophilus.
Familia Enterobacteraceae: no son
organismos nutricionalmente exigentes.
Atmsfera

Conocer cuales son los requerimientos de O2


de los MO.
Aerobios
Microaeroflicos
Anaerobios facultativos
Anaerobios estrictos
Temperatura
Conocer la temperatura ideal para su desarrollo.
Mesoflicos (35 a 37C): la mayoria de las especies
bacterianas de inters clnico.
Termoflicos (>37C): Pseudomonas aeruginosa
(41C), Campylobacterias (42C)
Psicroflicos(<ATM): Yersinia enterocoltica (4C),
Listeria monocytogenes (ATM)
Morfologa colonial
Tipo de hemlisis en GS carnero
al 5%
Produccin de pigmentos
Los pigmentos insolubles en agua incluyen los
carotenoides (amarillo-naranja), la violacena
(violeta o prpura) y las fenazinas (rojo,
castao, marrn).

Los pigmentos hidrosolubles y difusibles


incluyen las fluorescenas (pioverdina),
piocianinas, piorrubina, melanina y otros
varios subproductos pigmentados, que
cambian el color del medio de cultivo.
Pigmentos insolubles en agua

Carotenoides (amarillo- Fenazinas (rojo, castao, marrn


naranja)
Pigmentos hidrosolubles y difusibles

Fluorescenas (pioverdina- piocianinas) Lampara de Wood (UV)


Tinciones: Afinidad a la
tincin de Gram
Morfologa bacteriana
Reaccin de catalasa
Esta prueba detecta la presencia de
citocromooxidasas en las bacterias.
La prueba se hace con perxido de hidrgeno
(H2O2) al 3% sobre un portaobjetos.
La produccin inmediata y abundante de burbujas
indica la conversin del H202 en agua y oxgeno
gaseoso
La prueba de la catalasa debe realizarse a partir de
un medio que no contenga sangre porque los
eritrocitos pueden producir una reaccin de catalasa
dbil.
Prueba de la catalasa
Reaccin de citocromo oxidasa
Los citocromo son
hemoproteinas que
contienen hierro y actuan
como ltimo eslabn de
la cadena de la
respiracin aerobia ;
transfireren electrones
de Hidrgeno al Oxgeno,
con la formacin de
agua.
El sistema citocromo se
encuentra presente en
microorganismos
aerobios,
microaeroflicos y en Tetrametil-p-fenilendiamina
algunos anaerobios
facultativos, pero nunca
en anaerobios estrictos.
Prueba de movilidad

En agar semislido por gota pendiente


Metabolismo de los
carbohidratos
Fermentacin: es un proceso metablico de
xido/reduccin que tiene como escenario, un
entorno anaerbico, en el que un sustrato
orgnico, funciona como aceptor final de
electrones de Hidrgeno.

Metabolismo oxidativo: de los hidratos de


carbono como las reacciones productoras de
energa que requieren oxgeno molecular (u
otros elementos inorgnicos) como
aceptante terminal de hidrgeno.
Metabolismo fermentativo y
oxidativo
La glucosa se degrada por tres vas
principales: la de Embden-Meyerhof-Parnas,
la de Entner-Doudoroff y la de Warburg-
Dickens (de la hexosa monofosfato).
La glucosa se convierte en cido pirvico en
cada una de estas tres vas.
Las bacterias (BGN) utilizan una o ms de
esas vas para el metabolismo de la glucosa,
dependiendo de su composicin enzimtica y
de la presencia o ausencia de oxgeno.
Pruebas de fermentacin
de carbohidratos
El medio OF de Hugh y Leifson contiene
peptona al 0,2% y 1,0% de hidratos de carbono,
de tal forma que la relacin entre peptona e
hidrato de carbono es 1:5, a diferencia de la
relacin 2:1 que existe en los medios utilizados
para fermentacin de hidratos de carbono.

La disminucin de la peptona minimiza la


formacin de productos de oxidacin a partir de
los aminocidos, que tienden a elevar el pH del
medio y pueden neutralizar los cidos dbiles
producidos por los bacilos no fermentadores.
Medio O/F

Los microorganismos oxidativos Los microorganismos


producen cido slo en el tubo fermentadores producen cido
abierto expuesto al oxgeno en ambos tubos.
atmosfrico.
Medio O/F

Tubos de OF inoculado con un


organismo de metabolismo no
fermentador y no oxidativo
para la glucosa.

Observe el ligero vire a


alcalino (azul) debido a la
utilizacin de protenas
(peptonas) del medio.
Todas las Enterobacteriaceae,
fermentan la glucosa a travs de
EMP para formar cido pirvico.
Los destinos alternativos del cido
pirvico son el resultado de una
variedad de caminos de
fermentacin que arrojan
productos finales muy diferentes.
Fermentacin de la
Lactosa
La lactosa es un disacrido compuesto por glucosa y
galactosa, unido por un puente de oxgeno conocido
como enlace galactosdico. Al hidrolizarse, este enlace
libera glucosa y galactosa. Para que una bacteria
metabolice lactosa, deben estar presentes dos enzimas:
1) -galactsido permeasa, que permite el transporte
de -galactsido, como la lactosa, a travs de la pared
celular.
2) -galactosidasa, la enzima requerida para hidrolizar
el enlace -galactosdico una vez que el disacrido ha
entrado en la clula. La reaccin cida final resulta de la
degradacin de la glucosa.
Fermentacin de la
Lactosa
Dado que la fermentacin de la lactosa procede en
ltima instancia por medio de la degradacin de la
glucosa a travs de EMP, se deduce que cualquier
microorganismo incapaz de metabolizar la glucosa
no puede formar cido a partir de la lactosa.
Los fermentadores de lactosa tardos son
organismos que exhiben actividad -galactosidasa
pero muestran baja actividad -galactsido
permeasa.
Prueba de la ONPG (o-Nitrofenil-
-D-galactopiransido)
Es un compuesto estructuralmente similar a la
lactosa, excepto en que la glucosa ha sido
reemplazada por un grupo o-nitrofenilo.

Esta prueba permite detectar con mayor rapidez la


fermentacin de la lactosa, al evidenciar la enzima
-galactosidasa ms rpidamente.
Prueba de la ONPG (o-
Nitrofenil- -D-
galactopiransido)
Uso del agar Kliegler
Los tubos KIA y TSI se inoculan con un asa recta.
La colonia prueba, bien aislada, se toca con el
extremo del asa de inoculacin, la cual luego es
clavada en lo profundo del tubo, extendindose
hasta llegar a 0.5 cm del fondo del tubo.
Cuando el asa de inoculacin se retira de la
profundidad del tubo, la superficie inclinada es
estriada con un movimiento de ida y vuelta.
Uso del agar Kliegler
Se recomienda la utilizacin como rutina del agar de
KIA o TSI en todos los aislamientos que se sospecha
que son Enterobacteriaceae.

Aun cuando se trate de un microorganismo


fermentador y se sospeche que es
Enterobacteriaceae, se debe llevar a cabo una prueba
de citocromo oxidasa para excluir los microorganismos
pertenecientes a otros gneros de bacterias
fermentadoras, como especies de Aeromonas,
Plesiomonas, Vibrio y Pasteurella, que son oxidas a
positivos.
Uso del agar Kliegler
Uso del agar Kliegler
Reduccin de nitratos a
nitritos
Todas las Enterobacteriaceae con excepcin de
ciertos biotipos de Pantoea agglomerans y ciertas
especies de Serratia y Yersinia, reducen los nitratos
a nitritos.
Cualquier medio basal que soporte el crecimiento
de microorganismos y contenga 0,1% de
concentracin de nitrato de potasio (KNO3) es
adecuado para llevar a cabo la prueba.
El caldo nitrato o agar nitrato inclinado son las
formas de presentacin del medio usado ms
comnmente en laboratorios clnicos.
Reduccin de nitratos a
nitritos

Anadir : 1 gota de Ac. Sulfanlico + 1 gota de N,N-dimetil-alfa-naftilamina


Produccin de indol

El indol es uno de los productos de degradacin del


metabolismo del aminocido triptfano.
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa
pueden clivar el triptfano, y de este modo producir
indol, cido pirvico y amonio.
El indol puede detectarse en un medio triptfano de
prueba mediante la observacin del desarrollo de
color rojo despus de agregar una solucin que
contiene p-dimetilaminobenzaldehdo (p. ej.,
Reactivo de Ehrlich o de Kovac).
Prueba del rojo de metilo
(fermentacin cido mixta)
Es un indicador de pH (6.0 amarillo a 4.4 Rojo),
indica la produccin de grandes cantidades de
cidos formados a partir de la glucosa (ac. Lctico,
actico y frmico).
Inocular en no menos de 3 ml. de caldo VP/RM, la
colonia a estudio
Incubar durante no menos de 48 a 72 hrs a 35C.
Aadir 3 gotas de reactivo rojo fenol directamente al
caldo.
Prueba del rojo de metilo
(fermentacin cido mixta)
Prueba de voges-proskauer
(fermentacin butilengliclica)
Se basa en la conversin de acetil-metil-carbinol
(acetona), el cual es el metabolito final de la glucosa, a
diacetilo a travs de la accin del hidrxido de potasio
al 40% y el oxgeno atmosfrico. El alfa naftol funciona
como un catalizador para producir un complejo
cromognico rojo.
Inocular en 3 ml. de caldo VP/RM, la colonia a estudio.
Incubar durante 24 hrs a 35C.
Tomar 1 ml del caldo incubado en un tubo limpio.
Agregar 0.6 ml de -naftol al 5%, seguido aadir 0.2
ml de KOH al 40%.
Agitar suavemente para facilitar la exposicin al
oxgeno atmosfrico.
Dejar reposar por no menos de 10 min.
Prueba del rojo de metilo
(fermentacin cido mixta)
Relacin VP - RM

La mayora de las especies de


Enterobacteriaceae Voges-Proskauer
positivas, son con raras excepciones, rojo de
metilo negativas y viceversa
Utilizacin del citrato

Permite determinar la capacidad de un microorganismo


para utilizar citrato de sodio como nica fuente de
carbono
La utilizacin del citrato se detecta en el medio de
Citarto de Simmons por la produccin de subproductos
alcalinos derivados de las sales de amonio presentes en
el medio, tales como amoniaco (NH3) e hidrxido de
amonio (NH4 OH).
El indicador de color es el azul de bromitol, el cual es
amarillo por debajo de pH 6.0 y azul por enzima de pH
7.6.
Utilizacin del citrato
Inocular la superficie del medio (pico de
flauta) en zig-zag.
Incubar de 24 a 48 hrs a 35C.
Interpretacin de los resultados:
Utilizacin del citrato
Caldo Malonato
Produccin de ureasa (Caldo
urea de Stuart / Agar urea de
Christensen)
La urea es una diamida del cido carbnico.
Todas las diamidas se hidrolizan fcilmente, con
liberacin de amoniaco y dixido de carbono.
Los microorganismos que poseen la enzima ureasa
hidrolizan la urea, con lo cual se libera amonio y se
produce un cambio de color rosado-rojo en el
medio.
Produccin de ureasa (Caldo
urea de Stuart / Agar urea de
Christensen)

El medio lquido se siembra con una


ansada de cultivo puro a estudio
La superficie del pico de flauta del agar
se estra en zig-zag.
Ambos medios se incuban durante 18 a
24 hrs.
Caldo urea Stuart: un color rosa a rojo indica alcalinizacin
e hidrlisis de la urea (POSITIVO)

Agar de Christensen:
Degradadores rpidos de la urea: Un color de rosa a rojo en
todo el tubo (desde 4 Hrs)
Degradadores lentos de la urea: Un color de rosa a rojo en el
pico de flauta (hasta 48 Hrs)
Descarboxilacin de la lisina,
ornitina y arginina.
Determinar la capacidad enzimtica de un MO de
descarboxilar un aminocido para formar una
amina con la ancalidad resultante.
La descarboxilacin es el proceso por el cual
las bacterias que poseen enzimas
descarboxilasas actuan sobre los aminocidos
en su carboxilo terminal (COOH), para formar
una amina o diamina y CO2.

lisina cadaverina, Ornitina putrescina,


Arginina citrulina
L- Lisina descarboxilasa

El medio lisina descarboxilasa (LIA) para la deteccin de


sulfuro de hidrgeno, incluye citrato frrico de amonio y
tiosulfato.

Este medio facilita la Id. de especies de Salmonella, la


mayora de las cuales son sulfuro de hidrgeno positivas
y lisina descarboxilasa positivas.

En el LIA las especies de Proteus y Providencia


desaminan, no descarboxilan, y los aminocidos pueden
detectarse por el desarrollo de color rojo en la superficie
inclinada del tubo.
L- Lisina descarboxilasa
Procedimiento:
Seleccionar la colonia bacteriana a
estudio e inocular con una asa recta el
tubo con el medio, picando primero y
firmando en la parte superior del pico de
flauta antes de retirar el asa.
Incubar de 18 a 24 Hrs a 35C.

Interpretacin de los resultados.


Prpura de bromocresol

LD (+) LD (-) LD (+) LD (-)

SH2 (-) SH2 (-) SH2 (+) SH2 (-)

Las pruebas de lisina descarboxilasa son tiles para diferenciar especies


de Citrobacter lactosa negativas (0% positivas) de especies de Salmonella
(98% positivas).
L-Arginina dihidrolasa

Es un enzima que acta sobre la L-arginina


produciendo alcalinidad como resultado final, por lo
tanto el indicador virar a rojo prpura igual que en
el caso de la deteccin de las descarboxilasas.
Emplear medio base de Mller (caldo) al 1% de
monoclorhidrato de arginina 4 ml.
Inocularlo con la cepa a estudiar
Sellar con aceite mineral esteril 1ml
Incubar durante 24 a 72 hrs a 35C
Prpura de bromocresol

AD(-) Control AD(+)


L-Ornitina descarboxilasa

Casi todas las cepas de Shigella sonnei (ms del 98%)


poseen actividad de ornitina descarboxilasa, mientras
que slo unas pocas cepas de S. boydii (2,5%)
muestran tal actividad; S. dysenterieae y S. flexneri son
ornitina negativos.
La prueba de OD es la ms til para diferenciar especies
de Klebsiella (la mayora de las especies son negativas)
de especies de Enterobacter (la mayora de las especies
son positivas).
L-Ornitina descarboxilasa
Procedimiento:
Seleccionar la colonia bacteriana a estudio e inocular
con una asa recta el tubo con el medio, introduciendo la
punta hasta dejar un espacio aproximado de 0.5 cm de
la base del tubo.
Incubar de 18 a 24 Hrs a 35C.
Interpretar los resultados de la Ornitina y la movilidad
antes de aadir el reactivo para Indol.
Aadir el reactivo para Indol
Finalmente interpretar el resultado del Indol.
L-Ornitina descarboxilasa
Prpura de bromocresol
Produccin de fenilalanina
desaminasa
Es til para la diferenciacin inicial de especies de
Proteus, Morganella y Providencia de otros bacilos
gramnegativos.
Slo los miembros de estos gneros, y algunos
aislamientos relativamente raros del grupo
Enterobacter y Yersinia, poseen la enzima
responsable para la desaminacin oxidativa de la
fenilalanina.
El desarrollo de color verde despus del agregado
del reactivo cloruro frrico es inmediato y fcil de
visualizar
Produccin de fenilalanina
desaminasa
Adicin de Cloruro frrico al 10%.

Color verde pico de flauta : Sin cambio pico de flauta :


FAD + FAD -
Bilis esculina
Produccin de sulfuro de
Importante para hidrgeno
la identificacin de ciertas especies de
bacterias es su capacidad de liberar azufre a partir de
aminocidos que contienen azufre u otros compuestos
en la forma de H2S.

El medio SIM es ms sensible para la deteccin de


H2S que el KIA, presumiblemente a causa de su
consistencia semi slida, falta de hidratos de carbono
para suprimir la formacin de H2S y el uso de hierro
peptonizado como un indicador.

El KIA, por otro lado, es ms sensible que el agar TSI


por que la sacarosa suprime los mecanismos
enzimticos responsables de la produccin de H2S.
Produccin de sulfuro de
hidrgeno
Movilidad

El medio para movilidad tiene una concentracin de


agar de 0,4% o menos.
Los medios SIM o MIO han encontrado amplio uso
en los laboratorios de microbiologa clnica porque
se puede medir ms de una caracterstica en el
mismo tubo.
Primero se debe interpretar la prueba de movilidad,
porque la adicin de un reactivo de indol puede
oscurecer los resultados.
Movilidad