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TCNICAS DE

MANIPULACIN
GENTICA

1. La clonacin molecular
2. Las enzimas de restriccin. Aislamiento de ADN forneo.
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introduccin del vector/ADN forneo

5. Mtodos de seleccin
6. Obtencin de genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR

1. Introduccin: la clonacin molecular


La clonacin consiste en la obtencin de un clon, entendido como un
conjunto de elementos genticamente iguales entre si e iguales a su
precursor.

- Amplificacin de molculas de ADN por clonacin clular


-Amplificacin de molculas de ADN por clonacin acelular (PCR)
- Manipulacin gentica y clonacin de organismos pluricelulares (animales y plantas)

1. Introduccin: la clonacin molecular

... Dios mo, me


han clonado... !!

1. Introduccin: la clonacin molecular


Estrategia general del proceso de clonacin

1. Aislamiento del ADN forneo


2. Unin del fragmento de ADN forneo a un vector
3.Introduccin del vector-DNA forneo en la clula
hospedadora
4. Seleccin de los transformantes
5. Estabilidad de la informacin gentica

1. Introduccin: la clonacin molecular


Estrategia general del proceso de clonacin
Extraer el
gen de inters

insulina

1. Introduccin: la clonacin molecular


Aislamiento y
digestin del ADN

Werner Arber, Hamilton


Daniel Nathans 1979

Smith

Enzimas
restriccin
Insercin en
molculas vectores

Stanley
Cohen
,
Boyer,
(Universidad
. de Stanford)

Plsmidos
bacterianos
con capacidad autnoma de
replicacin en la clula hospedadora

Berg

2. Aislamiento del ADN forneo.


Endonucleasas
Enzimas de restriccin -> Enzimas de bacterias que
Tipo
I y Tipo
III
reconocen
secuencias
de DNA especficas y lo cortan
por el esqueleto azcar-fosfato (enlace fosfoester).
Actividad restriccin y modificacin
Precisan Mg 2+, ATP y S-adenosil-metionina
Reconocen una secuencia especfica
Recorren un cierto nmero de bases y cortan
Cortan el DNA en puntos distintos al de
reconocimiento (al azar)

Tipo II
Rompen por la secuencia de reconocimiento
Precisan Mg 2+, pero no ATP
Cortan justo en los puntos que
reconocen,
que
son
repeticiones
invertidas o palndromes.

2. Las enzimas de restriccin

Los cidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas


Ejemplos de endonucleasa

extremos
cohesivos
5
3
GA A T T C
C T T A AG
3
5
C C G G

G G C C
extremos romos

2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas


Accin de endonucleasas de restriccin Tipo II: corte ADN
EcoR 1 de E.coli

GAAT T C

Secuencias
Palindrmicas

C T TAA G
AA G C T T

Hind III de

T T C G AA

Haemophilus influenza

2. Aislamiento del ADN forneo.


Endonucleasas
Accin de endonucleasas de restriccin Tipo II: corte ADN
EcoR 1 de E.coli

GAAT T C

C T TAA G

Secuencias
Palindrmicas
Extremos cohesivos

2. Aislamiento del ADN forneo.


Endonucleasas
EcoR 1 de E.coli

GAAT T C
C T TAA G

C T TAA

AAT T C

G
Extremos pegajosos

2. Las enzimas de restriccin

EcoRI actuando
sobre una
secuencia de
ADN

2. Aislamiento del ADN forneo.


Endonucleasas

Extremos cohesivos

Extremos romos

3. Vectores de clonacin y unin del framento de ADN

Enzimas de restriccin
Vector

ADN

1.
del ADN
1. Aislamiento
Introduccin:
la
forneo y del ADN
molecular
vector

clonacin

Estrategia general del proceso de clonacin

2. Unin del fragmento de


ADN forneo a un vector

3.Introduccin del vectorADN


forneo
en
la clula hospedadora
4.
Seleccin
transformantes

de

5.
Estabilidad
de
informacin gentica

los

la

Vector de
clonacin

Cortar el ADN forneo y el


vector con las mismas
enzimas de restriccin

1.
del ADN
1. Aislamiento
Introduccin:
la
forneo y del ADN
molecular
vector

clonacin

Estrategia general del proceso de clonacin

2. Unin del fragmento


de ADN forneo a un
vector

3.Introduccin del vectorADN


forneo
en
la clula hospedadora
4.
Seleccin
transformantes

de

5.
Estabilidad
de
informacin gentica

los

la

3. Vectores de clonacin y unin del framento de ADN

Formacin de ADN recombinante: unin ADN forneo-vector

Indice
1. Introduccin: la clonacin molecular
2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo
5. Mtodos de seleccin
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa

8. PCR

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

Vectores de clonacin
Son vehculos de ADN para ADN, capaces de recibir ADN
forneo y replicarlo.

Caractersticas principales
Se replican de forma autnoma (origen de replicacin)
Contienen regiones no esenciales para su multiplicacin y
estabilidad

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

Tipos de vectores:
Plsmidos
Permiten insertar hasta 20 kb de ADN pero son ms
eficaces con insertos ms pequeos (<10kb).
Contienen genes de resistencia a antibiticos.
Virus
Permiten insertar 15-20 kb.
El sistema de infeccin del virus permite la entrada del
ADN en E. coli.
Los virus de cadena sencilla tienen aplicaciones especiales
para secuenciar y realizar mutagnesis.

Vectores hbridos:
Csmidos. Permiten insertar hasta 40 kb.

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

Tipos de vectores de clonacin


Virus
Plsmidos
Csmidos (laboratorio)
YACs (levaduras)

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

Plsmidos
ADN Plasmdico

ADN

pBR322

ADN Plasmdico

-Control relajado
-Fenotipo seleccionable
-Cierto N de sitios de restriccin
-Bajo PM (4 363 bp)
(transformacin con plsmidos 10000bp es poco eficiente

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

Virus: se emplea como vector, junto con la capacidad


que poseen para introducir el ADN forneo en la
clula hospedadora
Para bacterias: Fago l y derivados, Fago M13
Para plantas: CaMV
Para mamferos: SV40

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de


ADN

Virus
-El corte por los sitios cos y el empaquetamiento
en la cpsida puede hacerse in vitro. La cpsida
admite entre 38 y 53 Kb (-20% y + 10% del DNA l).
-Se introduce en la bacteria hospedadora por
transduccin

Fago l

Adsorcin de partculas virales a una bacteria

SIDA

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

Tipos de vectores de clonacin


Plsmidos
Virus
Csmidos (laboratorio) Mezcla
plsmido y virus

YACs (levaduras), contienes sitios


caractersticos de la funcionalidad de
los cromosomas

Indice
1. Introduccin: la clonacin molecular
2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo
5. Mtodos de seleccin
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa

8. PCR

1.
Aislamiento del ADN
1. Introduccin:
la
forneo y del ADN vector

clonacin

molecular
Estrategia general del proceso de clonacin
2. Unin del fragmento de
ADN forneo a un vector

3.Introduccin del
vector-ADN forneo en
la clula hospedadora

4.
Seleccin
transformantes

de

5.
Estabilidad
de
informacin gentica

los

la

1.
Aislamiento del ADN
1. Introduccin:
la
forneo y del ADN vector

clonacin

molecular
Estrategia general del proceso de clonacin
2. Unin del fragmento de
ADN forneo a un vector

3.Introduccin del vectorADN


forneo
en
la clula hospedadora
4. Seleccin de
transformantes
5.
Estabilidad
de
informacin gentica

los

la

5. Mtodos de seleccin

MTODOS DE SELECCIN
Resistencia a antibiticos
Genes marcadores (gen b -galactosidasa)
GFP (green fluorescent protein)

5. Mtodos de seleccin

Resistencia a antibiticos
La resistencia la confieren genes que porta el vector,
en este caso a ampicilina y a tetraciclina
El
ADN
forneo se
inserta en el
gen
de
resistencia a
Ampicilina

Plsmido
pBR322

5. Mtodos de seleccin
Resistencia a antibiticos
La resistencia la confieren genes que porta el vector

Sin plsmido
Sin inserto

Con
tetraciclina

Con plsmido
Con inserto

Con plsmido
Sin inserto

Con ampicilina
y tetraciclina

5. Mtodos de seleccin

MTODOS DE SELECCIN
Resistencia a antibiticos
Genes marcadores (gen b-galactosidasa)
GFP (green fluorescent protein)

5. Mtodos de seleccin
Gal

Genes marcadores (ej: gen b-galactosidasa)


Amp

pUC19

5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactsido Br-Cl-indol + galactosa


(X-gal)

(Azul)
Ori

Inactivacin insercional
(introducir el DNA foraneo en el medio del marcador)

Insercin gnica positiva


(Unir el gen marcador al DNA foraneo)

5. Mtodos de seleccin
Genes marcadores (gen b-galactosidasa)

Gal + inserto

Amp

Gal

Amp
Ori
Plasmido pUC19

Ori
Plasmido pUC19

5. Mtodos de seleccin
b-galactosidasa

b-galactosidasa
+ ADN forneo

pUC19 = plsmido

5. Mtodos de seleccin
GFP (green fluorescent protein)

5. Mtodos de seleccin

GFP (green fluorescent protein)

Excitacin
(nm)

Emisin
(nm)

Actina

488

510

CFP-GOLGI

Ap. De Golgi

420

475

GFP-ENDO

Endosomas

488

510

M-GFP

Membrana

488

510

RFP-MITO

Mitocondria

550

600

CFP-MITO

Mitocondria

420

475

YFP-NUC

Ncleo

515

530

GFPPEROXI

Peroxisomas

488

510

YFP-ER

Retculo
endoplsmico

515

530

GFP-TUB

Tubulina

488

510

Vector

Localizacin

GFP-ACTIN

1.
Aislamiento del ADN
1. Introduccin:
la
forneo y del ADN vector

clonacin

molecular
Estrategia general del proceso de clonacin
2. Unin del fragmento de
ADN forneo a un vector

3.Introduccin del vectorADN


forneo
en
la clula hospedadora
4. Seleccin de
transformantes

los

5. Estabilidad de la
informacin gentica

Indice
1. Introduccin: la clonacin molecular
2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo
5. Mtodos de seleccin
6. Genotecas

7. Electroforesis en geles de agarosa


8. PCR

Genotecas
Genoteca: coleccin de clones que contiene todo el
genoma de un organismo.

Tipos de genotecas:
Genmicas
Parciales
ADNc. Coleccin de ARNm
Tipos de vectores:
Plsmidos (Genotecas parciales)
Fagos (Genotecas genmicas pequeas y de ADNc)
Csmidos, BAC (genotecas genmicas complejas)

6. Obtencin de genotecas

Utilizando un virus
Utilizando un plsmido

5. Mtodos de seleccin
Hibridacin de colonias
Consiste en detectar secuencias de
DNA en colonias transformadas
mediante hidridacin in situ con
sondas marcadas
Obtencin de la sonda
marcada:
marcaje radioactivo: (32P)
marcaje
desoxinucletidos
fluorescentes

Indice
1. Introduccin: la clonacin molecular
2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN


4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo
5. Mtodos de seleccin
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa

8. PCR

7. Electroforesis en geles de agarosa

TCNICAS ELECTROFORTICAS
Se basan en la migracin diferencial de las molculas a separar en un
campo elctrico.
Generalmente se lleva a cabo en un soporte inerte. (AGAROSA)

En la electroforesis en gel la fuerza que provoca la migracin de las


molculas es el campo electrico, pero el gel acta como filtro molecular,
relentizando la migracin su migracin en funcin de su tamao

7. Electroforesis en geles de agarosa

ELECTROFORESIS. SOPORTES

- Geles de acrilamida (protenas, geles de secuenciacin de ADN)


O
C
CH2

CH

Acrilamida

NH2
CH2

CH

O
NH

CH2

NH

CH

CH2

Gelificacin
qumica

N,N`-Metilenbisacrilamida

- Geles de agarosa (los ms usuales para ADN)

Gelificacin
trmica

ELECTROFORESIS DE ADN
Disolver la agarosa a la concentracin deseada en una solucin

salina TAE (Tris-acetato-EDTA) o TBS mediante calentamiento

Dejar enfriar hasta unos 50C y aadir Bromuro de Etidio

C 2H 5

Bromuro de Etidio

7. Electroforesis en geles de agarosa


La agarosa es el polmero usado para la separacin.

7. Electroforesis en geles de agarosa


La agarosa se mezcla con un tampn.

7. Electroforesis en geles de agarosa


La agarosa se disuelve en el microondas.

7. Electroforesis en geles de agarosa


Se preparan la cubeta y el peine.

7. Electroforesis en geles de agarosa


Se aade el polmero disuelto a la cubeta y se espera hasta su gelificacin.

7. Electroforesis en geles de agarosa


El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solucin

TAE
Se procede a cargar los
pocillos con las muestras

Se procede a conectar a una


fuente de electroforesis

7. Electroforesis en geles de agarosa


Formados los pocillos, se
coloca en ellos cada muestra,
incluidos los patrones.

7. Electroforesis en geles de agarosa


Cada muestra forma una
banda azul que correr
en
la
agarosa
dependiendo
de
su
tamao.

7. Electroforesis en geles de agarosa


El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solucin

TAE

7. Electroforesis en geles de agarosa


El gel se retira y el bromuro de etidio ligado al ADN se visualiza con
transiluminador de UV, apareciendo bandas fluorescentes.

Se coloca el gel en un
transiluminador de luz UV

Se visualizan las bandas de ADN


teidas con el bromuro de etidio.

7. Electroforesis en geles de agarosa

La movilidad electrofortica del ADN en los geles de agarosa es

inversa a su tamao

1Kb

3.0
2.0
1.6
1.0
0.5

BKTBKT-O de H. pluvialis

Indice
1. Introduccin: la clonacin molecular
2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo
5. Mtodos de seleccin
6. Genotecas

7. Electroforesis en geles de agarosa


8. PCR

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kary Mullis. Premio Nobel


de Qumica en 1993
Descrubri la PCR en 1985, cuando trabajaba para Cetus Corp.
Beginning with a single molecule of the genetic material
DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an
afternoon

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin del


DNA.

DNA
(molcula sencilla)

PCR
amplificacin

Muchas
moleculas
del mismo
ADN

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin del


DNA.

Controlando la temperatura
DNA
(doble hlice)

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Sntesis por DNA polimerasa


5

Tema 9

-T A C G
-A T G C A T G C A T G C * *

Primers cortos de DNA especficos que hibridan


con la cadena que tiene que ser copiada

los dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Sntesis por DNA polimerasa


5

-T A C G T A C G T A
-A T G C A T G C A T G C * *

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Despus del primer periodo de sntesis de


DNA, tenemos copiada una cadena de DNA
Primer 1

Extensin de la cadena

Cadena original de DNA

Cmo produce este proceso una AMPLIFICACIN?

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)


Primero, la desnaturalizacin separa las dos cadenas de
DNA a alta temperatura (90 ~ 100C)

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Primero, desnaturalizacin separa las dos cadenas


de DNA a alta temperatura (90 ~ 100C)
Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva
cadena con la DNA polimerasa
2
1
Al mismo tiempo, la cadena original se copia
nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1
Ahora tenemos dos copias de la molcula original

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Tema 9

Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Desnaturalizacin Hibridizacin
50-60C
95C

Extensin de
La cadena
75C

Primer Ciclo

2do Ciclo
95C
50 - 60C
75C

Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias


Mltiples ciclos darn un incremento exponencial de copias

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)


ADN-polimerasa de Thermus aquaticus
(Taq polimerasa)
Parque Nacional de Yellowstone
Hey, Boo Boo
pescamos lasTap
para amplificar los
sandwiches?
Ok Yogy

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Pelo humano

TCNICAS DE
MANIPULACIN
GENTICA

GRACIAS!!!!!!!!!!!