TECNOLOGÍA DEL

ADN RECOMBINANTE

Ingeniería genética
 Tecnología del ADN recombinante

Conjunto de técnicas que permiten aislar un gen

de un organismo, para posterior manipulación e
inserción en otro organismo diferente. De esta
manera se puede lograr que un organismo
(animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus
produzca una proteína que le sea totalmente
extraña.
Proceso en cinco pasos:

1. Cortar el gen de interés con enzimas de restricción.

2. Seleccionar el vector de clonación y cortarlo con
enzimas de restricción.
3. Ligar o pegar los fragmentos con la enzima ligasa;
4. Introducir el ADN recombinante en una célula
huésped (bacteria) por medio de transformación.
5. Selección e identificación de las células que
contienen el ADN recombinante
Obtención del gen de interés
Inserción del gen de interés en vectores genéticos
 Inserción en virus
Uso de enzimas
de restricción

Ensamblaje
virus

Virus
clonado
 Enzimas de Restricción

• O endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester entre

los nucleótidos del ADN a partir de una secuencia que
reconocen.
• Son extraídas de bacterias donde actúan degradando
material genético extraño que entra en la célula.
• Para protegerse de sus endonucleasas las bacterias
tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para
distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio.
• Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA
metilado, de este modo solo afectan el DNA extraño.
 Ejemplo: Eco RI

• Las enzimas de restricción se nombran a partir de las bacterias de las que

son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la
bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima.
• La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos
indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número romano al
final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa.

E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
 Corte de EcoRI dejando extremos cohesivos

Restricción de HaeIII* dejando extremos romos

Los fragmentos de ADNc son clonados y luego

unidos mediante DNA ligasas
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 Enzimas de restricción
Sitio de
Enzima Origen Bacteriano Resultado del Corte
Reconocimiento
5'GAATTC 5'---G AATTC---3'
EcoRI Escherichia coli
3'CTTAAG 3'---CTTAA G---5'
Bacillus 5'GGATCC 5'---G GATCC---3'
BamHI
amyloliquefaciens 3'CCTAGG 3'---CCTAG G---5'
5'AAGCTT 5'---A AGCTT---3'
HindIII Haemophilus influenzae
3'TTCGAA 3'---TTCGA A---5'
5'TCGA 5'---T CGA---3'
TaqI Thermus aquaticus
3'AGCT 3'---AGC T---5'
5'GGCC 5'---GG CC---3'
HaeIII* Haemophilus aegytius
3'CCGG 3'---CC GG---5'
5'AGCT 5'---AG CT---3'
AluI* Arthrobacter luteus
3'TCGA 3'---TC GA---5'
5'GATATC 5'---GAT ATC---3'
EcoRV* Escherichia coli
3'CTATAG 3'---CTA TAG---5'
13
 Acción de las enzimas de restricción cortando un
vector
EcoRI

Plásmido o fago

Inserción del
ADNc

16
PLASMIDO pBR322

17
 PLÁSMIDO pUC18

múltiples sitios de
restricción

18
 CLONACION DEL
PLASMIDO pBR322

No recombinantes Recombinantes

19
FAGO LAMBDA: USO

Amp
resist.

Amp
resist.

20
Inserción de los vectores genéticos en células vegetales

• La infección de Agrobacterium tumefaciens en

células vegetales normales, produce “tumoraciones
en forma de agallas”.
• Sólo son patógenas las cepas de A. tumefaciens que
contienen al plásmido conjugativo de gran tamaño Ti.
• Un segmento del plásmido Ti, conocido como
T-DNA, se transfiere al DNA cromosómico de la
célula vegetal huésped.

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• La región T-DNA contiene genes que codifican la
síntesis de hormonas del crecimiento de la planta y de
“opina”, que son necesarias para el crecimiento de la
bacteria.
• Pero se pueden insertar genes exógenos en el
segmento T-DNA de Ti, (resistencia a plagas) y la
bacteria infecciosa puede transferir el Ti alterado a la
célula vegetal y luego se integra en el cromosoma.

23
 Síntesis de Inserción de ADNc
hormonas y Resistente a plagas
opinas para
formar
«tumores»

Inserción de ADNc
24
Clonación de genes de mamíferos en bacterias
La producción de proteínas a gran escala, se logra
haciendo que una bacteria produzca una proteína
específica en superproducción, como en el caso de la
insulina humana, que actualmente es producida por
bacterias en grandes biorreactores.
Como las bacterias se multiplican muy rápidamente y
pueden expresar grandes cantidades de proteínas, es
posible lograr una sobreproducción de la proteína
deseada
Aislamiento de microorganismos
Recombinantes
AISLAMIENTO DE
RECOMBINANTES

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Selección de las células recombinantes