INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

LOCALIZACIÓN CITOSOLICA DE SINTASA ACETOHIDROXIACIDA Ilv2 Y

SU IMPACTO EN LA FORMACION DE DIACETÍL DURANTE LA
FERMENTACION DE LA CERVEZA.

Suvarna Dasari y Ralf Kolling.

Institut fur Lebensmittelwissenschaft und Biotegchologie
Universitat Holhenheim D-70599 Stuttgart, Germany

BIOQUIMICA MICROBIANA

EQUIPO 4-I
Camacho González Víctor Alfonso
Figueroa Valencia Mayra Nayely
Guzmán Ramírez José Eduardo
Torres Sebastián Mixtli Jaime
Introducción.
 Cerveza

Bebida alcohólica obtenida a partir de granos de cebada

y otros cereales.
La cerveza por 1 gramo de alcohol proporciona 7
calorías.
México esta posicionado en el 30 de consumo de
cerveza per capita, con 51.8 litros al año
 Principales ingredientes de
la cerveza
 Cereal

 Malta

 Lúpulo

 Agua

 Levadura
 ¿Cómo se fabrica la
cerveza?
Maceración
Obtención de la malta
Cocción del
del mosto y filtración
mosto

Obtención Inyección
de cerveza de levadura

Envase y
embotellado
TIPOS PRINCIPALES DE LEVADURAS
Levaduras de fermentación en
superficie. (Cerveza tipo “ALE”).
 Saccharomyces cerevisiae.
 Fermentación temperaturas
altas (14°C y 23°C).
 Maduración 8- 14 días.
Levaduras de fermentación en el
fondo . (Cerveza tipo “LAGER”).
 Saccharomyces
carlsbergensis.
 Fermentación temperaturas
(6°C y 12°C).
 Maduración 5-7 días.
 DIACETILO:
PRODUCCION Y REDUCCION

Células de levaduras difieren

• Diacetilo posee un marcadamente en la habilidad
aroma a manteca de reducirla
con azúcar y su
• el sabor es
apreciación detectable a 0.05
aumenta a medida ppm la mayoría
que la cerveza va lo detecta a 0.15
perdiendo el frio • Su percepción ppm
determina un
La levadura durante la parámetro de El 20% de los
fermentación produce
calidad consumidores no lo
diversos subproductos
detecta
La acetohidroxiacido sintasa (Ilv2) es
una enzima de gran importancia en la
síntesis del diacetilo

Cataliza el primer paso en la biosíntesis de cadenas

raminifacadas de a.a. en la matriz mitocondrial, la
descarboxilacion irreversible del piruvato y la condensación
de una segunda molécula de piruvato o de 2-cetobutirato.

Las concentraciones elevadas de

diacetilo están altamente ligadas al
importe de la Ilv2 a través de la
membrana mitocondria.
 Célula de Saccharomyces cerevisiae

Precursor CITOSOL
DIACETILO
Ilv2

Célula Petite de Saccharomyces cerevisiae

Precursor

DIACETILO
Cadena respiratoria

EN CELULAS DE Saccharomyces cerevisiae SE SINTETISAN TANTO

CELULAS NORMALES COMO PETITES
 CADENA RESPIRATORIA
CITOSOL Diacetilo

rial
cond H+
Pre proteínas Ilv2 mito
a ex t ern a H+ H+
b ra n
Mem H+ ATP 4-

+++ +
+ + + +
acio branal +
E s p
e rmem ++ + +
in t
H+

- --- -------
- ---- ------
------
---- ADP
ADP 3-
ATP
Ilv2 ADP
MATRIZ ATP
MITOCONDRIAL
Diacetilo
MEDIO YPD (Yeast, Peptone, Dextrosa)

-Medio empleado para cultivo de hongos y levaduras

FORMULA:

* Glucosa
* Extracto de levadura
* Peptona
* Tetraciclina (evitar crecimiento bacteriano)

BROMURO DE ETIDIO
- Es un poderoso agente mutagénico de efecto acumulativo.

- Es un agente intercalante de ADN

Formula de Bromuro de Etidio

OBJETIVOS:
• Localización de la Ilv2 en el citosol y su impacto en
la formación de diacetilo durante la fermentación de la
cerveza.
• Disminuir el sabor desagradable debido al diacetilo,
por debajo del umbral de sabor.
• Reducir la formación de diacetilo en el citosol
causadas por cepas petite por medio de mutagénesis.
Materiales y Métodos
 CEPAS DE LEVADURA, PLASMIDOS Y
MEDIOS

CEPA Petite / Silvestre

CEN. PK K 29 Silvestre

CEN. PK K61 Silvestre

RKY2139 Silvestre

RKY2315 Petite. ADN mitocondrial incompleto

RKY2399 Petite. ADN mitocondrial incompleto

RKY2491 Silvestre
 ¿Cómo se preparan las
células?
Insertos y
Cassettes
reemplazos de
genes genéticos

Por PCR
Amplificación del gen
ATP3
 DNA
cromosómico de
levadura

Insertos de interés por Amplificación del gen ATP3 por

cassetes PCR
 Gen ATP3 Vector Plásmido
ycplac33 prK1107

Mutagenizacion
Plásmido prK1107 selectiva sobre Gen ATP 3-5
Gen ATP3

Plásmido
Gen ATP3 -5
prK1108
Vector YCplac33
 INDUCCION DE PETITES CON BROMURO
DE ETIDIO
Medio YPD
[toda la noche]

Dilución 1:50
Saccharomyces cerevisae
Mutantes rho- (sin
mitocondria)

Medio YPD
[30 °C X 3 hrs]
10 µg de bromuro de
etidio / ml
 2 lavados (remover
Bromuro de Etidio)

Reposo: 3 horas Alícuota de

5 ml

YPD:
Glucosa (+)
Etanol (-)
Glicerol (-)

Comprobación de
Petites Resuspender
Medio: Glicerol 2% [200 µl de H2O]
 FERMENTACIONES

Guardado toda la
Disolver en agua noche a 4°C y
(10% [wt/vol]) esterilización por Hplc
filtración
121 °C 20 min.

Toda la noche a 30°C

Cultivados MEX 3 ml de
toda la noche (medio de extracto de precultivos
150 mL MEX
malta)

Ajustadas a una Fermentaciones se

DC 107 llevaron a 30°C por
Fase Cel/ml con 34 Hrs.
estacionaria MEX a Vol. fin
de 275ml
Se midió el diacetil por Se filtraron Las
medio de una y se muestras se
cromatografía de gases con
detector de captura de e- y
congelaron a retiraron
-20°C cada 2 hrs
una columna
FS.INNOPGE-1000

Condiciones de GC:
Temperatura de la muestra 60°C
Temperatura de la aguja 90°C
Temperatura de la línea de transferencia
La HS-GC se 100°C
Viales GC llevo a cabo con Tiempo del ciclo de GC 40 min.
cerrados Perkin Elmer Tiempo de equilibrado 15 min
8500 y un Tiempo de presurizado 1 min.
65°C 90min recolector de Tiempo de inyección 0.04 min
antes de
medir muestras head Tiempo de retiro 0.3 min.
space HS-40 Gas acarreador (nitrógeno)
Presión del acarreador 150 KPa
Tamaño de la muestra 5ml
Patrón interno 2,3-hexadiona (1mg/ml)
 FRACCIONAMIENTO DE LAS CÉLULAS

Las levaduras fueron cultivados durante toda

la noche hasta la fase exponencial (DO600 ≤
1.0) en medio YPD

Medio YPD
(yeast, peptone,dextrosa)
 Glucosa
 Extracto de levaduras
 peptona
Además se agrega tetraclina para evitar
el crecimiento de bacterias
Las células fueron cosechadas por centrifugación
y se determinó el peso húmedo del botón celular

Las células fueron lavadas con un volumen igual de 10 mM de NaN 3(DETENER EL

CRECIMIENTO ) y re suspendidas en 2 ml de buffer de ditiotreitol (DTT) (100 mM
Tris-SO4 [pH 9.4], 10 mM DTT)/g de células.

Las muestras se colocaron en un agitador a 50 rpm por 20 min a 30°C.

Se lavaron con 5 ml de buffer de zimoliasa (1.2 M de sorbitol, 20 mM
KH2PO4 [pH 7.4]) y
Re suspendidas en 7 ml de buffer de zimoliasa/g de células.
 Ruptura de células por
medios físicos
METODO DE LISIS
Homogenización liquida
Descripción
Células o suspensiones de células que son cortados,
obligándolos a través de un espacio pequeño

Homogenizador Dounce
Posteriormente se agregó 1 mg de
zimoliasa /g de las células a las t erna
n a in
r a nal
muestras, seguida de una incubación ra mb
e mb rm e
de 1 h a 30°C. M
i o i nte
t ern a
ac ae
x
Esp r a n
e mb
M s ol tica
cito á
p lasm
a
b ran lular
m ce
Me re d
Los esferoplastos fueron Pa
lavados cuidadosamente
con buffer de zimoliasa
frío (4°C) pipeteando de
arriba abajo.

0.5 mL FT Extracto
Sobrenadante
( fracción total) celular

500 x g
5minutos
Pellet =células
enteras ,
esferoplastos
 Otra muestra (0.5 ml) fue
Posteriormente 0.5 ml del centrifugada a
sobrenadante fueron tomados como la 100,00 X g por 1 h a 4°C
fracción total (TF) en un rotor S45-A.

El sobrenadante (S100) fue

transferido a un tubo fresco, y el
botón (P100) fue resuspendido en 100,000 x g
0.5 ml de buffer de zimoliasa.

S100
Las muestras fueron P100 Proteínas
desnaturalizadas a 50°C Mitocondrias Citosol
por 15 min con 1
volumen de buffer de la
muestra.
Resultados
 PRODUCCION AUMENTADA DE DIACETIL
EN MUTANTES PETITE:
Fig. 1A: Formación de diacetil en cepas
silvestres y petite. Las fermentaciones de
cerveza fueron hechas en medio MEX a 30 °C
durante los tiempos indicados. Formación de
diacetil con RKY2139 (cepa silvestre, )y
RKY2315 (rho , ).
-

 Cepas petite con déficit respiratorio (rho-) acumulan mayores niveles

de diacetil. Con un máximo a las 8 hrs de iniciada la fermentación
(0.847 mg/litro).
 Para la cepa silvestre, se observaron niveles muy bajos de diacetil con
un máximo a las 8 hrs de iniciada la fermentación (0.126 mg/litro).
 SILVESTRE PETITE

Fig. 1B y 1C: Perfiles de azúcar y formación de etanol con RKY2139 (B) y RKY2315 (C) (se indican las concentraciones
de maltosa [ ], glucosa [ ] y etanol [+]). Los experimentos fueron llevados a cabo al menos tres veces. Se muestran los
resultados de un experimento representativo.

 Determinación de perfiles de azúcar y formación de etanol durante la

fermentación.
 Los perfiles fueron muy similares para ambas cepas.
 La glucosa se consumió primero, antes de usar la maltosa.
 CCCP (carbonil cianuro m-
clorofenilhidrazona): Disipa el
potencial de membrana a través de
la membrana mitocondrial interna.
El cual es esencial para señalización
de proteínas de matriz.

Fig. 2A: Acumulación del precursor Ilv2 en las mutantes petite. Detección de
Ilv2 por Western Blot. Carril 1, RKY2139 (cepa silvestre); carril 2, RKY2139
(cepa silvestre + CCCP, 40 µm, 4 horas); carril 3 , RKY2315 (rho -).

 Examinación de enzima responsable de síntesis del precursor alfa-

cetolactato de diacetil, la acetohidroxiacido sintasa (Ilv2).
 Observación de banda adicional que migraba lentamente con extractos
celulares de cepas petite.
 Posibilidad de que banda = Proteína precursora de Ilv2.
 Adición del CCCP, observación de banda adicional de Ilv2 con misma
movilidad de segunda banda en rho-.
 EL PRECURSOR DE Ilv2 SE ACUMULA EN
EL CITOSOL

Fig. 2B: Fraccionamiento de Ilv2. Los extractos celulares de la

cepa rho RKY2139 (carriles 1 a 3), la cepa rho - RKY2315
(carriles 4 a 6) y la cepa Ilv2/Ilv2- 55 RKY2491 (carriles 7
a 9) fueron fraccionados por centrifugación. T, fracción total
(carriles 1, 4 y 7); P, fracción del botón (carriles 2, 5 y 8); S,
fracción del sobrenadante (carriles 3, 6 y 9). Las proteínas
fueron detectadas por Western blot con anticuerpos anti-Ilv2
(los dos paneles superiores) y anticuerpos anti-aconitasa (panel
inferior). En el segundo panel la región del precursor Ilv2 fue
realizado selectivamente. P, precursor Ilv2; m, Ilv2 maduro. La
banda de referencia esta marcada con un asterisco.
Fig. 3: Alta formación de diacetil con Ilv2 N-terminal truncado. Las fermentaciones se llevaron a cabo en medio
MEX a 30 °C con RKY2139 (WT, ) y RKY2491 (Ilv2 ) por los tiempos indicados. Los perfiles de azúcar y
formación de etanol fueron similares a los de la Fig. 1 (no se muestra). Los experimentos se llevaron a cabo por
lo menos tres veces. Se muestran los resultados de un experimento representativo.
FORMACION REDUCIDA DE DIACETIL
POR LA EXPRESION DE ATP3-5

 La acumulación citosólica del precursor 1Iv2 es la responsable del

aumento de la producción del diacetil.
 Se le atribuye la poca eficacia en el importe mitocondrial en las
células petite a su bajo potencial de membrana.

Saccharomyces
cerevisae
 En levaduras rho- el potencial de membrana es mantenido por el
acarreador ADP/ATP.
 Una mutación en la subunidad γ en el gen ATP3-5 puede incrementar
el estado energizado de la membrana.
INSERTOS EN CELULAS PETITE /
SILVESTRES CRECIDAS EN SD/CAS o MEX

Inserto
ATP 3-5 Petit crecidas en
SD/CAS
ATP3 Silvestres SD/CAS

ATP 3-5 Petit crecidas en MEX

ATP3 Silvestres MEX

 Medio SD/CAS Medio MEX

Fig. 4A: Reducción de los niveles de diacetil por la expresión del ATP3-5. Las fermentaciones fueron llevadas a
cabo a 30 °C con la cepa rho - RKY2399 transformada con el plásmido Prk1108 (que contenía el gen ATP3-
5, ). Los niveles de diacetil fueron determinados a los tiempos indicados. Los Experimentos se llevaron a
cabo al menos 3 veces. Se muestran resultados de experimento representativo.

 Después del experimento se observó una disminución de un 40% en

la producción de diacetil en células petit con inserción de ATP3-5 en
el medio SD/CAS.
 Hubo una disminución del 30% en la producción de diacetil en las
células crecidas en medio MEX.
DISCUSION Y CONCLUSIONES
• Acumulación de
I1v2 en el
citosol.
• Sobreexpresión
de I1v5.
• Localización
citológica de
I1v2.
• Potencial de
membrana
disminuido.
 Bibliografía
Fernando Lizcano Losada ,”Fundamentos moleculares en medicina", manual
moderno, pp.61-63

MacFaddin, J.F. 1985. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance

of a medical bacteria, vol. I. Williams & Wilkins, Baltimore, MD.

R. Plank. El empleo del frio en la industria de la alimentacion. Editorial Reverte.

Pag. 639

Terry Brown. Genomas. Editorial Panamericana. Pag. 528

Agustin Lopez, Mariano Garcia. Biotecnologia Alimentaria. Editorial Limusa. Pag.

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