Bioquímica – QI 935. Marzo de 2024.

Universidad Tecnológica de Pereira

EXTRACCIÓN DE FOSFATASA ALCALINA, EFECTO DE pH,

TEMPERATURA, VELOCIDAD DE REACCIÓN Y ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA

ALKALINE PHOSPHATASE EXTRACTION, EFFECT OF pH, TEMPERATURE,

REACTION SPEED AND ENZYMATIC ACTIVITY
Autor 1: Agudelo Pelaez Juliana Andrea 2: Bueno Galeano Joan Sebastian

Programa de Química Industrial, Universidad Tecnológica de Pereira, Risaralda, Colombia.

Correo-e: a.agudelo2@utp.edu.co ; sebastian.bueno@utp.edu.co

Resumen— Para esta práctica se realizó la extracción de fosfatasa alcalina de la mucosa de intestino delgado de
cerdo, utilizando como sustrato el p-nitrofenilfosfato (PNFF). Se realizaron diferentes experimentos para
entender cómo factores como el pH, la temperatura, el tiempo de reacción y la concentración de enzima afectan
su actividad, con el objetivo de comprender su funcionamiento y sus aplicaciones. Además, se elaboró una curva
de calibración utilizando p-nitrofenol, un producto de reacción del PNFF, para establecer una relación entre la
absorbancia y la concentración de este compuesto, lo que facilita la evaluación precisa de la actividad
enzimática.

Palabras clave— actividad enzimática, enzima, fosfatasa alcalina, temperatura.

I. INTRODUCCIÓN
Un biocatalizador reduce o aumenta la energía de
activación de una reacción química, haciendo que ésta
sea más rápida o más lenta. Cada reacción química en
un ser vivo, ya sea unicelular o pluricelular, requiere la
presencia de uno o más biocatalizadores (enzimas),
pues si no existieran éstas ocurrirían en desorden total.
[1].
La actividad de las enzimas puede ser afectada por
otras moléculas. Las inhibidoras son moléculas que
disminuyen la actividad de las enzimas; mientras que
las activadoras son moléculas que incrementan la
actividad. Asimismo, gran cantidad de enzimas
requieren de cofactores para su actividad. Muchas
drogas o fármacos son moléculas inhibidoras. La
actividad es afectada por la temperatura, el pH, la
concentración del sustrato y otros factores
físicoquímicos. [2]
La fosfatasa alcalina Hidroliza una gran variedad de
ésteres fosfóricos y se caracteriza por tener un óptimo
de pH alcalino (en torno a 10). Requiere para su
actividad zinc y magnesio. No se conoce con exactitud
la función de esta enzima, que también cataliza
transfosforilaciones; no obstante, se cree que tiene un
papel importante en los procesos de osificación. Es
una enzima muy ampliamente distribuída y se presenta
en muchas formas isozimáticas: placentaria, seudo
placentaria, intestinal y tisular (a su vez, con formas
hepática, ósea y renal). Es un importante marcador en
Bioquímica Clínica, sobre todo de enfermedades del
aparato hepatobiliar y del sistema óseo (enfermedad de
Paget, tumores óseos primitivos, metástasis óseas de
tumores, etc.) [3].
El objetivo de esta práctica fue extraer la fosfatasa
alcalina de la mucosa de intestino delgado de cerdo
para observar los diferentes cambios en la actividad o
velocidad de reacción enzimática respecto al cambio
de pH, a la variación de temperatura, tiempo y efecto
de la concentración de la enzima. tiempo fue inhibida con el reactivo K2HPO4 para luego
medir el valor de la absorbancia de esta solución a 440
nm.

II. METODOLOGÍA Efecto de la temperatura sobre la actividad

Preparación extracto crudo de fosfatasa alcalina de
intestino de cerdo.
Para preparar el extracto crudo de fosfatasa alcalina
del intestino de cerdo, se abrió y raspó la mucosa
intestinal, transfiriendo los raspados a un mortero
donde se trituraron con arena lavada y 10 mL de buffer
TRIS pH 10.5 durante aproximadamente 5 minutos. Se
añadió 0,5 mL de glicerol para evitar la acción de
enzimas proteolíticas y se continuó triturando hasta
obtener una pasta homogénea. Posteriormente, se
centrifugó la mezcla y se recogió el sobrenadante, el
cual se filtró y almacenó en un frasco para su posterior
utilización en ensayos enzimáticos.
enzimática
Se determinó el comportamiento que tenía la variación
de la temperatura en la fosfatasa alcalina adicionando
el buffer TRIS de pH 9, agua y p-nitrofenil fosfato
sometiendo la solución junto con esta enzima a
temperaturas diferentes por diez minutos para
posteriormente inhibir la reacción y medir el valor de
la absorbancia para cada ensayo.
III. RESULTADOS

Curva de calibración p-nitrofenol

A partir de una solución de p-nitrofenol 2mM, se
prepararon una serie de patrones con la adición de
agua y Buffer Tris para tamponar la solución, a cada
tubo se le determinó la absorbancia mediante un
espectrofotómetro a una longitud de onda de máxima
absorción de 410 nm cuando se encuentra en solución
acuosa alcalina.
Gráfica 1: Curva de calibración para p-nitrofenol
Efecto del tiempo de reacción en la aparición de un
producto. Teniendo en cuenta la ecuación de la recta:
Se pudo estudiar el efecto del tiempo en la formación
de un producto por medio del siguiente tratamiento 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏
para las muestras. En un baño maría a 30ºC fueron
analizados a diferente tiempo 5 tubos de ensayo, a los La ecuación correspondiente a la Gráfica 1 es:
cuales se les adicionaron 1mL del buffer TRIS a pH
9,1mL del sustrato PNFF 2mM y finalmente 1mL de 𝑦 = 13,744𝑥 + 0,0645
preparación enzimática a cada uno de los tubos,
excepto al blanco, que usó otro mililitro de la solución Se obtiene la absortividad molar del p-nitrofenol:
tampón para nivelar su volumen. Las muestras fueron
analizadas en el espectrofotómetro a 410 nm de ∴ 𝜀 = 13,744 𝑐𝑚−1𝑚𝑀−1
longitud de onda en secciones de 5 min para cubrir
diferentes tiempos en un intervalo de 5 a 20 minutos. La absortividad molar para el 4-nitrofenol a un pH
alcalino fuerte a longitud de onda de 410 nm es igual
Efecto de pH sobre la actividad enzimática a 16 (1/mM*min) [4], el valor obtenido en la práctica
En este caso, fueron adicionados a cada tubo de ensayo fue igual a 13,744 (1/mM*min), la posible causa de
soluciones buffer TRIS a diferentes valores de pH, que esta diferencia pudo ser la variación del pH, esta
se pusieron en contacto con agua, p-nitrofenilfosfato y condición es fundamental puesto que la especie
la preparación enzimática durante 10 minutos a reducida del compuesto puede llegar a una
temperatura ambiente, cuya reacción al finalizar este absortividad molar igual a 0,2 (1/mM*min).

Para hallar la concentración de PNF se realizó el
cálculo con base al volumen de la solución (10 ml), al
volumen usado de PNF y a la concentración a la que se
encuentra este.
Para hallar la velocidad de reacción en cada una de las
pruebas, se empleó la ecuación 1.
2
(𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑃𝑁𝐹)
𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜
(Ecu
1.)
Efecto de la temperatura sobre la actividad
enzimática
Gráfica 2: Curva Velocidad de reacción vs
Temperatura.
En la Gráfica 2, se puede observar que se obtuvo el
comportamiento un poco bajo al inicio pero que fue en
aumento hasta su temperatura óptima, ya que, a bajas
temperaturas, la mayor parte de las enzimas muestra
poca actividad porque no hay suficiente cantidad de
energía para que tenga lugar la reacción catalizada y a
una mayor temperatura implica una mayor energía
cinética de las moléculas, por lo que aumenta las
colisiones y provoca que estas sean productivas [5],
esto se pudo dar al no retirar e inhibir a tiempo la
solución con la enzima a la temperatura requerida. Sin
embargo, al emplear una enzima se debe controlar la
temperatura, pues a temperaturas muy elevadas que
superan su temperatura óptima, esta se puede
desnaturalizar, perdiendo su función biológica. Cabe
resaltar, que la estabilidad estructural de la fosfatasa
alcalina frente a la temperatura podría deberse en parte
a los dos puentes disulfuro que están bien conservados
entre los mamíferos [6].
Determinación de la actividad enzimática o
variación de la velocidad de la reacción con
respecto a la concentración de la enzima a una
concentración de sustrato constante
Gráfica 3: Curva velocidad de reacción vs volumen
enzima.
En la mayoría de los experimentos cinéticos la
concentración de enzima es mucho menor que la de
sustrato, pues éste suele encontrarse en condiciones de
saturación, por lo que el factor limitante de la reacción
es la cantidad de enzima presente en el ensayo. Así la
velocidad de reacción será proporcional a la
concentración total de enzima [7]. En este caso se
comprobó lo dicho anteriormente, pues analizando la
Gráfica 3, se observa que el comportamiento de la
reacción cuando se varía la cantidad de enzima es
creciente, este va relativamente aumentando con el
aumento de la concentración de PNF o de la velocidad
de reacción; en ese mismo orden de ideas, si se
mantiene constante concentración de enzima, la
adición de más sustrato aumentará la velocidad de la
reacción, y, si la concentración del sustrato es alta, esta
puede saturar todas las moléculas de la enzima.
Entonces la velocidad de la reacción alcanza su
máximo y la adición de más sustrato no aumenta más
la velocidad de la reacción. [8].
Efecto de pH sobre la actividad enzimática
Para este ensayo se expresó la velocidad de reacción
en μmoles de PNFF transformado (Iguales a las moles
de PNF que aparecen) por minuto
 corresponde a la pendiente de la recta [7].

Aplicando la Ecuación 2, se calcula la concentración

del producto p-nitrofenol, como ejemplo se toma el
patrón 1 y el mismo procedimiento se realiza con los
demás patrones:

A= Ɛ * C * l

𝐴
𝐶= Ɛ*𝑙

Gráfica 4: Curva velocidad de reacción vs pH.

Al estudiar el efecto del pH, se observa en la Gráfica

4, que se presenta un aumento en la actividad
enzimática a un pH entre 9,9-10,1 aproximadamente,
este incremento es razonable puesto que el pH óptimo
de esta enzima se encuentra entre 8 a 10 [9], por ende,
a valores de pH bajos la actividad enzimática es casi
constante porque la afinidad entre el sustrato y la
enzima disminuye, por ello se estaría dando un cambio
conformacional en la enzima que no haría posible la
unión entre ambos, teniendo en cuenta que a pH de 5,
esta estaría desnaturalizada.
Gráfica 6 : Concentración de producto vs tiempo de
reacción.
Efecto del tiempo de reacción en la aparición de un
En el gráfico 6, se visualiza una caída en la
producto
concentración del producto frente al tiempo, ya que la
velocidad inicial no se está graficando contra una
cantidad de sustrato inicial, sino contra el producto
que, corresponde a la cantidad de sustrato que
transformó la enzima en el tiempo.

IV. DISCUSIÓN

Según estudios realizados en el Departamento de

Bioquímica y Biología Molecular del Campus
Universitario de Rabanales [10], se pueden observar
resultados que pueden ser comparados con los
obtenidos experimentalmente.
Gráfica 5: Curva velocidad de reacción vs tiempo de
reacción.

La determinación de la concentración del p-nitrofenol

se basa en la ley de Lambert-Beer:

𝐴 = 𝜀. 𝐶.𝐼 Ecuación 2.
Donde: I = 1 cm
C = Concentración del sustrato
ε = Coeficiente de extinción milimolar que

Gráfico 7. Representación del progreso de reacción:
aparición de producto frente al tiempo de reacción.
En los Gráficos 6 y 7, se observan gráficas diferentes y
a pesar de que, las condiciones de trabajo eran
similares se dan algunas discrepancias, se presenta una
relación entre el tiempo en que transcurre la reacción
con la aparición de producto, o lo que es lo mismo con
la desaparición de sustrato, que indica la vi de la
misma, a partir de la cual se puede determinar la
concentración de la enzima necesaria para que
transcurra la reacción en esas condiciones.
Gráfico 8. Efecto de la concentración de enzima sobre
la velocidad de reacción.
Como se evidencia en ambos estudios, al comparar los
gráficos 3 y 8, una vez que todo el sustrato se adhirió
la reacción dejó de acelerar, ya que las enzimas no
tenían algo adicional a lo que pudieran unirse, de esta
forma se puede decir que, cuando se opta por aumentar
la concentración de la enzima está acelerará la
reacción, siempre que se disponga de sustrato al cual
unirse.
V. PREGUNTAS
¿Cuáles son las razones por las que el pH afecta la
actividad enzimática?
Las enzimas son más activas a su pH óptimo, el pH
que mantiene la estructura terciaria adecuada de la
proteína. Si un valor de pH está arriba o abajo del pH
óptimo, se alteran las interacciones de los grupos R, lo
que destruye la estructura terciaria y el sitio activo.
Como resultado, la enzima ya no puede unirse a un
sustrato de manera adecuada y no ocurren reacciones.
Si se revierte un pequeño cambio en el pH, una enzima
puede recuperar su estructura y actividad. Sin
embargo, grandes variaciones respecto del pH óptimo
destruyen de manera permanente la estructura de la
enzima [8].
VI. CONCLUSIÓN
Se logró realizar una exitosa extracción de la enzima
fosfatasa alcalina de la mucosa del intestino delgado
del cerdo, lo que permitió conocer los factores que
afectan la actividad enzimática, así como medir sus
velocidades para más análisis cinéticos, donde, se
concluye que, las enzimas funcionan mejor dentro de
rangos de temperatura y de pH específicos, y bajo
condiciones que no son las óptimas una enzima puede
perder su capacidad de unirse a un sustrato, por ende,
su actividad enzimática, adicional a esto, cuando se
estudia el progreso de la reacción utilizando
concentraciones variables de enzima, se puede
comprobar cómo ésta es factor limitante de la
velocidad, siendo dicha velocidad proporcional a la
concentración de enzima siempre que el sustrato se
encuentre en condiciones de saturación tal y como
ocurre en las condiciones de trabajo utilizadas.
VII. REFERENCIAS
[1]. Studocu. (2022). Guia Estudio #10
Biocatalizadores - Universidad Autónoma de Santo
Domingo PRIMADA DE AMÉRICA Fundada -
Studocu.
https://www.studocu.com/latam/document/universidad
-autonoma-de-santo-domingo/bioquimica-i/guia-estudi
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[2]. Enzima. (2019). Quimica.es. Recuperado el 29 de
marzo de 2024, de
https://www.quimica.es/enciclopedia/Enzima.html fosfatasa alcalina. Revista UCO Bioquímica y
Biología molecular.
[3]. Battaner Arias, E. (2013). Introducción a la
bioquímica parte 2, enzimología. Recuperado el 29 de
marzo de 2024, de
https://www.google.com/url?sa=t&source=web&rct=j
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[4]. Cocotle R. Y, Hernández Lozano M, Ocaña

Sánchez M. F, Sánchez Medina A, Soto Ojeda G. A,
Vázquez Luna A. (2020). MANUAL DE
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA.

[5]. Dumitrașcu, L., Stănciuc, N., Aprodu, I., Ciuciu,

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[6]. Herrero Villen, M. A., Atienza Boronat, M.,

Noguera Murray, P. S., Tortajada Genaro, L. A., &
Morais Ezquerro, S. B. (2015). Problemas y cuestiones
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[7]. Díaz, N. A., Ruiz, J. A. B., Reyes, E. F., Cejudo,

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[8]. Timberlake, K. C., & Olguín, V. C. (2013).

Química general, orgánica y biológica. Pearson
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[9]. Mazorra, M. T., Rubio, J. A., & Blasco, J. (2002).

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[10]. Bárcena, J., García, C., Padilla, C., Martínez, E.,

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