PRACTICA No.

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ACTIVIDAD CATALÍTICA DE LA AMILASA SALIVAL

1. OBJETIVO

Evaluar la dependencia de la reacción enzimática con respecto al pH del medio, la

temperatura y concentración de la enzima.

2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS

VARIABLES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD CATALITICA DE LAS ENZIMAS

Las enzimas son macromoléculas proteínicas con una actividad catalizadora que se ve
notoriamente influenciada por varios factores: concentraciones tanto del sustrato
como de la enzima, la ausencia o presencia de cofactores, inhibidores y efectores, el
aumento o disminución de la temperatura y las variaciones del pH.

Para visualizar las mejores condiciones que garanticen el óptimo funcionamiento de

una enzima, se tendrá que proceder a la evaluación de su actividad catalítica, ya sea
midiendo la velocidad inicial de la reacción enzimática en función de uno de los
parámetros (concentración del sustrato, de la enzima, variación del pH, temperatura) o
determinando la presencia o ausencia de un sustrato o de un producto de la reacción, a
medida que se varía uno de los parámetros.

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

La naturaleza proteínica de las enzimas indica que en su estructura primaria existen

restos de aminoácidos cuyas cadenas laterales son ionizables, dependiendo del pH del
medio. El funcionamiento máximo de una enzima dependerá por lo tanto de una
disposición específica de tales grupos, y el pH óptimo será una consecuencia de la real
contribución de los siguientes parámetros:

 Los pKa de las cadenas laterales de los aminoácidos presentes en el sitio activo y que
realizan la catálisis.
 Los pKa de las cadenas laterales de los aminoácidos, que en el sitio activo ayudan a fijar
el sustrato.
 Los pKa de las cadenas laterales alejadas del sitio activo, pero que ayudan a estabilizar
la conformación global de la enzima.
 Los pKa de los grupos ácidos y básicos del sustrato.

Someter a experimentación una enzima bajo condiciones de acidez alejadas de su pH

óptimo, significa alterar drásticamente su actividad catalítica, porque se afectará el
estado de ionización de los grupos referidos.

Para las enzimas existe un rango de pH en el cual su actividad catalítica es máxima,

por ejemplo:

 Para la tripsina, que cataliza la hidrólisis de péptidos en el intestino, el pH óptimo está

alrededor de 8.
 Para la pepsina, que funciona en el estómago, el pH óptimo está cercano a 2.
 La papaína, que es una peptidasa aislada de la cáscara de la papaya verde, trabaja bien
en un rango de pH entre 5 y 9.
 La fosfatasa ácida es más activa a pH 5, mientras que la fosfatasa alcalina lo es a pH
9.

EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD

ENZIMATICA.

Esta relación fue estudiada en 1913 por Michaelis y Menten, quienes midieron la
velocidad inicial (V) de una reacción sencilla de un solo sustrato, manteniendo
constante la concentración de la enzima y aumentando la concentración del sustrato y
determinaron que:

 A bajas concentraciones de sustrato, la velocidad de la reacción depende

proporcionalmente del mismo, siguiendo una cinética de primer orden: V = K [S].

Molecularmente significa que aún hay una cantidad de enzima libre. Al aumentar la
cantidad de sustrato, la enzima remanente puede actuar sobre él, formando el complejo
ES y la velocidad de la reacción se va incrementando.

 A altas concentraciones del sustrato, la velocidad de la reacción es independiente de su

concentración, siguiendo una cinética de orden cero: V i  V M

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Esto indica que, en condiciones de alta concentración de sustrato, la enzima se halla
saturada por éste y la reacción llega a su máxima velocidad ( V M ). Al agregar más
sustrato, la velocidad no aumenta porque no hay enzima disponible para para formar
el complejo ES.
Gráficamente, Michaelis y Menten observaron que para la mayoría de las reacciones
que estudiaron, la relación entre la velocidad de reacción y la concentración del sustrato
fue de tipo hiperbólico, describiendo una transición cinética de primer orden hasta
orden cero, con respecto al sustrato. Véase Figura 1.

Figura 1. Gráfico de velocidad de reacción (V) vs concentración de sustrato [S]

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA SOBRE LA VELOCIDAD DE LA

REACCION

El estudio de este efecto también fue realizado por Michaelis y Menten, aprovechando
los resultados de la relación hallada entre V i y [S]. La evaluación del efecto de la
concentración de la enzima se hizo en la región de la curva hiperbólica donde la cinética
es de orden cero con respecto al sustrato, es decir, donde la enzima se encuentra
saturada y hay sustrato en exceso. Al agregar más cantidad de enzima, se encontró un
aumento lineal en la velocidad de la reacción, proporcional a la cantidad de enzima
agregada. Véase Figura 2.

Pág. 2
 Vi

[E]

Figura 2. Gráfico de velocidad de reacción inicial (Vi) vs concentración de enzima

([E])

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.

Para la mayoría de las reacciones orgánicas, su velocidad aumenta con la temperatura,

no en forma lineal, sino exponencial, como lo indica la Ecuación de Arrhenius:

K: constante cinética de velocidad. Es característica de cada

reacción en particular

Ea A: factor de frecuencia de colisiones


k  Ae RT
Ea: energía de activación. Representa la energía cinética mínima
que deben poseer las moléculas para vencer las repulsiones entre
sus nubes electrónicas cuando chocan

T: temperatura (K)

R: Constante de los gases

A mayor temperatura, mayor energía cinética tendrán las moléculas del sustrato, cuyas
colisiones serán más frecuentes, favoreciendo, por lo tanto, la rápida transformación en
productos.

En las reacciones enzimáticas, y hasta aproximadamente 50 °C, la velocidad se

incrementa con la temperatura por el efecto normal de las colisiones. Después de ese
límite, el calor empieza a afectar la conformación nativa de la enzima hasta
desnaturalizarla por completo; en este estado ya se habrán destruido todas las
interacciones que estabilizan las estructuras secundarias y terciarias de la enzima, y

Pág. 3
 ésta, por lo tanto, habrá perdido toda su funcionalidad y actividad. Para la mayoría de
las enzimas, la inactivación empieza en el intervalo 50-60 °C, excepto para aquellas que
pertenecen a organismos que viven en manantiales calientes, donde la actividad
enzimática se mantiene aún a temperaturas superiores a 80 y 90 °C.

En la presente práctica se pretende conocer las condiciones óptimas de pH y

temperatura para el funcionamiento de la enzima -amilasa.

GENERALIDADES SOBRE EL SUSTRATO Y SU DIGESTIÓN

EL ALMIDÓN
El almidón es la principal fuente de reserva de carbohidratos de las plantas superiores,
hallándose en los granos de los cereales, las semillas de las leguminosas y en las frutas.
Es el principal constituyente de rizomas y tubérculos. En relación con la dieta humana,
el almidón funciona como fuente de energía, y sus propiedades físicas ayudan a mejorar
la textura y la aceptabilidad de los alimentos.

Estructuralmente, el almidón es un polímero de glucosas (glucano), unidas por enlaces

-glucosídicos, y formado por dos compuestos diferentes: la amilosa (10 – 20 %) y la
amilopectina (80 – 90 %):

 La amilosa es un polímero lineal que puede contener hasta mil unidades de glucosa,
ligadas entre sí por enlaces -1,4, sin ramificaciones. Es la fracción del almidón que con
el yodo (2) forma un complejo de coloración azul intensa; el análisis con rayos X indica
que su cadena se encuentra enrollada en forma de espiral, en cuyo interior se acomodan
los átomos de yodo.

 La amilopectina es un polímero ramificado que puede contener hasta 1 millón de

unidades de glucosa, agrupadas en centenares de cadenas cortas lineales de 20 – 25
glucosas, ligadas entre sí por enlaces -1,4; un extremo de cada una de estas cadenas se
une a otra mediante un enlace -1,6, originando así la múltiple ramificación del
polímero. En la Figura 3 se detalla la estructura de la amilosa y la amilopectina:

Pág. 4
 Figura 3. Estructuras químicas de la amilosa (izquierda) y amilopectina (derecha)

DIGESTIÓN DEL ALMIDÓN

Junto a la sacarosa y la lactosa, el almidón completa la tríada de carbohidratos que
normalmente hacen parte de la dieta humana. Para ser absorbido a través de la pared
intestinal, el almidón debe ser digerido e hidrolizado hasta las unidades de glucosa, lo
cual es realizado gradualmente por las enzimas digestivas que se hallan en la boca (-
amilasa salival), y en el intestino delgado (-amilasa pancreática, maltasa, isomaltasa y
glucamilasa). La amilasa salival solo cataliza la hidrólisis de las uniones -1,4 y genera
básicamente dextrinas, maltosa, isomaltosa, maltotriosa y eventualmente glucosa libre.
La amilasa pancreática hace el mismo trabajo, pero sobre las dextrinas y
ocasionalmente almidones que llegan intactos al intestino. La maltasa, isomaltasa y
glucoamilasa secretadas por el duodeno finalizan la digestión, acelerando la hidrólisis
de las uniones -1,4 y -1,6, liberando glucosa que será absorbida a nivel del intestino
delgado.

LA ENZIMA AMILASA SALIVAL

La amilasa salival es una enzima digestiva presente en la boca, secretada por las
glándulas parótidas, submaxilares y sublinguales. Se conoce como ptialina o -
amilasa; tiene una masa molar de 50.000 Da y al ion calcio como factor. El contenido
de -amilasa en saliva es variable, 0-3 mg/mL.

La -amilasa es una endoenzima que cataliza el rompimiento hidrolítico de los enlaces

-1,4 glicosídicos de la región central de las cadenas de amilosa y amilopectina,
generando maltosa, maltotriosa y en menor grado, glucosa. Como no actúa sobre los
enlaces ramificantes -1,6, la -amilasa hidroliza en mayor grado a la amilosa sobre la
amilopectina. La -amilasa tampoco tiene acción sobre las uniones -1,4 de la celulosa,
cuya hidrólisis la realizan glucanasas específicas como la -1,4-glucanglucanohidrolasa

Pág. 5
y la -1,4-glucancelobiohidrolasa, llamadas comúnmente celulasas, que no están
presentes en el aparato digestivo de los humanos. La degradación de la amilosa por la
-amilasa se puede representar como se aprecia en la Figura 4:

amilosa

O O O O

O O O O

 -a m ilas a

O O O O O

O + O O

 - ma ltosa ma ltot r ios a

O

g l uco s a
Figura 4. Acción de -amilasa sobre la amilosa

En la presente práctica se experimentará con la enzima -amilasa, para explorar el

efecto del pH, la temperatura y su concentración, en su funcionamiento. El seguimiento
de la acción catalítica se evaluará con base en la formación del complejo de la amilosa
con el yodo (2) que genera un producto coloreado (azul):

amilasa
AMILOSA productos de hidrolisis



producto coloreado

Tenga en cuenta que: si se visualiza una solución azul es porque la amilosa está intacta
y por lo tanto la enzima no ha actuado lo suficiente o está inactiva.

Pág. 6
 3. MATERIALES Y REACTIVOS.

 Soluciones buffer 0.1 M: Citrato con pH  3.0, citrato con pH  4.0, fosfato con pH  5.0,
fosfato con pH  7.5, borato con pH  9.0, borato con pH  10.0 y carbonato con pH=11.
 Solución de almidón extraído de arroz.
 Solución salina (solución NaCl al 0.9 %).
 Solución de lugol: 5 mmoles de 2 por litro de K (30 g/L).
 Solución de Fehling A (Sulfato de cobre 3.5% en agua) y solución de Fehling B (tartrato
de sodio y potasio 15% + NaOH 20%).
 Solución acuosa de saliva (fuente de la -amilasa) en diferentes proporciones.
 Guantes de látex.

4. PROCEDIMIENTO

Importante: Horas previas al desarrollo de la práctica, los estudiantes deben colectar

aproximadamente 10 mL de saliva en recipientes limpios y almacenar en refrigeración.

4.1 EVALUACION DEL CAMBIO DE pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA

AMILASA

4.1.1. Prepare 10 mL de una solución de amilasa al 25% de la siguiente forma: en una

probeta de 10 mL, adicione 2.5 mL de saliva y complete hasta 10 mL con solución salina.

4.1.2. Marque 8 tubos de ensayo y adicione (en estricto orden), lo que se indica en la
siguiente Tabla, recordar agitar después de la adición de cada reactivo:

Buffer NaCl 0.9% Amilasa 1%

Tubo pH Almidón (mL)
(mL) (mL) (mL)

1 3.0 4 2 1 4
2 4.0 4 2 1 4
3 5.0 4 2 1 4
4 7.5 4 2 1 4
5 9.0 4 2 1 4
6 10 4 2 1 4
7 11 4 2 1 4
8 7.5 4 3 0 4

Pág. 7
Coloque todos los tubos en baño de agua a 37 °C durante 10 minutos.

4.1.3. Terminada la reacción, tome 1 mL de muestra de cada tubo para realizar la prueba
de Fehling y los otros 10 mL úselos para la prueba con Lugol.

4.1.4. Prueba de Fehling para presencia de azucares reductores (Glucosa,

Maltosa, Sacarosa): Marque 8 tubos de ensayo y adicione en cada uno 1 mL de la
mezcla de reacción del punto anterior, luego adicione 1 mL de solución de Fehling A y
1 mL de solución de Fehling B y agite bien hasta que el color sea uniforme, llévelos a
baño maría a 60 °C durante 5 min. Registre el color y la intensidad para cada tubo en la
siguiente tabla, compare con el color y la intensidad del tubo #8.

Tubo pH Color % Intensidad

1 3.0
2 4.0
3 5.0
4 7.5
5 9.0
6 10
7 11
8 7.5

Para la columna de % Intensidad, asigne 100% al tubo que presente la intensidad de

color mayor y compare los demás tubos con este.

4.1.5. Prueba de Lugol para presencia de amilosa: Adicione dos gotas de Lugol en
cada tubo de la mezcla de reacción sobrante del punto 4.1.3. Observe el grado de
intensidad del color formado (complejo amilosa-I2) en cada uno de los tubos y complete
la información de la siguiente tabla. Para la columna de % Intensidad, asigne 100% al
tubo #8 (control sin enzima) y compare los demás tubos con este control, de acuerdo al
grado de similitud asigne un valor en % a cada tubo. La intensidad de color se mide en
%, siendo 0% el tubo de ensayo incoloro y 100% el tubo de coloración completamente
oscura (control sin enzima).

Pág. 8
 Tubo pH % Intensidad
1 3.0
2 4.0
3 5.0
4 7.5
5 9.0
6 10
7 11
8 7.5

4.1.6. Calcule el porcentaje de reacción (% Reacción) de la siguiente manera:

% Reacción = 100 - % Intensidad y complete los datos en la siguiente tabla:

% Reacción para % Reacción para

Tubo pH
Fehling Lugol
1 3.0
2 4.0
3 5.0
4 7.5
5 9.0
6 10
7 11
8 7.5

4.2 EVALUACIÓN DEL CAMBIO DE CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA SOBRE LA

REACCIÓN DE HIDRÓLISIS DE LA AMILOSA

4.2.1. Prepare 7 soluciones acuosas con las siguientes concentraciones de saliva: 50%,
25%, 12.5%, 6.2%, 3.1%, 1.6%, 0.8% aproximadamente, para lo cual proceda como se
explica a continuación:

Disponga 7 tubos de ensayo y márquelos con su número respectivo.

Tubo #1 Solución 50%: tome 1 mL saliva sin diluir y adicione 1 mL de solución salina.
Tubo #2 Solución 25%: tome 1 mL saliva al 50% y adicione 1 mL de solución salina.
Tubo #3 Solución 12.5%: tome 1 mL saliva al 25% y adicione 1 mL de solución salina.
Tubo #4 Solución 6.2%: tome 1 mL saliva al 12.5% y adicione 1 mL de solución salina.
Tubo #5 Solución 3.1%: tome 1 mL saliva al 6.2% y adicione 1 mL de solución salina.

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Tubo #6 Solución 1.6%: tome 1 mL saliva al 3.1% y adicione 1 mL de solución salina.
Tubo #7 Solución 0.8%: tome 1 mL saliva al 1.6% y adicione 1 mL de solución salina,
mezcle y deseche 1 mL de la mezcla.

4.2.2. Tome otro tubo de ensayo y márquelo como “control” y adicione en el 1 mL de

solución salina.

4.2.3. A cada uno de los 8 tubos de ensayo adicione 4 mL de buffer (pH 7.5), 2 mL de
solución salina y 4 mL de solución de almidón, de forma que los tubos contengan todo
lo mostrado en la siguiente tabla.

Buffer pH 7.5 NaCl 0.9% Almidón 1%

TUBO % SALIVA
(mL) (mL) (mL)
1 50 4 2 4
2 25 4 2 4
3 12.5 4 2 4
4 6.2 4 2 4
5 3.1 4 2 4
6 1.6 4 2 4
7 0.8 4 2 4
Control 0 4 3 4

4.2.3. Agite cada tubo hasta completa disolución y lleve a baño de agua a 37 °C durante
10 minutos.

4.2.4. Adicione 2 gotas de Lugol a cada tubo, mezcle y observe el grado de intensidad
del color en cada uno de los tubos y complete los datos en la siguiente tabla:

TUBO % SALIVA % Intensidad % Reacción

1 50
2 25
3 12.5
4 6.2
5 3.1
6 1.6
7 0.8
Control 0

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4.3. EVALUACION DEL CAMBIO DE TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA
AMILASA

4.3.1. Prepare 4 ambientes de temperaturas diferentes:

 Baño de agua/hielo (± 2 °C)

 Temperatura ambiente (medir con termómetro)
 Baño de 37 °C.
 Baño de agua hirviendo (94 °C)

4.3.2. Disponga 6 mL de una solución de amilasa al 25% de la siguiente forma: en una

probeta de 10 mL, adicione 1.5 mL de saliva y complete hasta 6 mL con la solución
salina.

4.3.3. Tome 4 tubos de ensayo y adicione en todos ellos 1 mL de la solución de amilasa

al 25% y 4 mL de buffer pH 7.5. Prepare 4 controles de la siguiente manera: En 4 tubos
de ensayo adicione 1 mL de solución salina y 4 mL de buffer pH 7.5.

4.3.4. Lleve cada uno de los tubos que contienen la enzima y su respectivo control a las
temperaturas previamente indicadas durante 10 minutos.

4.3.5. Posteriormente, agregue a cada tubo 2 mL de solución salina y 4 mL de solución

de almidón y someta nuevamente los tubos a su temperatura respectiva durante 5
minutos más.

4.3.6. Finalizado este tiempo adicione 2 gotas de Lugol tanto a los tubos que contienen
la enzima como a los controles, agite y compare la intensidad del color, registre sus
datos en la siguiente tabla:

Tubo Temp. % Intensidad % Reacción

1 2 °C
Control 1 2 °C
2 Ambiente
Control 2 Ambiente
3 37 °C
Control 3 37 °C
4 94 °C
Control 4 94 °C

Pág. 11
5. RESULTADOS Y PREGUNTAS

5.1. Para el procedimiento 4.1 complete la tabla de datos y resultados de % reacción y

pH como se indica en la tabla 4.1. Conteste las siguientes preguntas:

Realice una gráfica de “% Reacción vs pH” para Fehling y otra para Lugol.

¿Qué función cumple el Lugol en el procedimiento?

¿Qué función cumple el reactivo de Fehling en el procedimiento?

De una explicación de cómo el pH afecta la actividad catalítica de la enzima, ¿Cuál es el

pH óptimo obtenido en el experimento?

¿Cuál será a funcionalidad del tubo No 8 durante la evaluación de la actividad catalítica

de la enzima?, ¿es un control positivo o negativo de la reacción de hidrólisis de amilosa?

¿Cuál es la función de la solución de NaCl 0.9 % en los experimentos realizados?

5.2. Para el procedimiento 4.2, elabore una tabla de datos y resultados de % de Reacción
y concentración de enzima, como se indica en la tabla del punto 4.2. Conteste las
siguientes preguntas:

a. Realice una gráfica de “% Reacción vs [Enzima]”.

b. ¿Cómo se interpretan los resultados en términos de la reacción de hidrólisis de
amilosa y de la concentración de amilasa? ¿Cuál concentración de la enzima fue la de
mayor actividad?

5.3. Para el procedimiento 4.3 elabore una tabla de datos y resultados y responda:

a. Realice una gráfica de “% Reacción vs Temperatura”.

b. ¿En cuál temperatura la actividad de la enzima fue máxima? y ¿En cuál fue mínima?,
c. ¿Cómo se puede explicar el comportamiento de la enzima con respecto a los cambios
de temperatura?

Pág. 12
6. BIBLIOGRAFÍA

 AMARIS, R. y LOPERA, P. Prácticas de Bioquímica. Universidad de Antioquia.

Facultad de Educación. Departamento de Extensión y Educación a Distancia. p 89-
94.1995
 BOYER, R. Conceptos de Bioquímica. México. International Thomson Editores
2000.
 ROBINSON, D. S. Bioquímica y Valor Nutritivo de los Alimentos, Zaragoza. Editorial
Acribia, S.A. 1991.
 SIERRA A, I. D. Metabolismo de los Hidratos de Carbono y su Importancia Clínica.
Universidad Nacional de Colombia. Bogotá. 1990.
 FENNEMA, O. R. Química de los alimentos. Zaragoza. Editorial Acribia, S.A. 1993.
 STENESH, J. Experimental Biochemistry. Ed. Allyn and Bacon, Inc. p 149-155.
1984.

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 PREINFORME

Nombre:____________________________________________________________ C.C.________________________
Nombre:____________________________________________________________ C.C.________________________
Grupo:_______________________

RESULTADOS PRÁCTICA #3

1. Efecto del pH
Tubo pH % Reacción Fehling % Reacción Lugol
1 3.0
2 4.0
3 5.0
4 7.5
5 9.0
6 10
7 11
8 7.5

2. Efecto de la Concentración
TUBO % SALIVA % Intensidad % Reacción
1 50
2 25
3 12.5
4 6.2
5 3.1
6 1.6
7 0.8

3. Efecto de la Temperatura
Tubo Temp. % Intensidad % Reacción
1 2 °C
Control 1
2 Ambiente
Control 2
3 37 °C
Control 3
4 94 °C
Control 4

Nota: Imprima esta hoja y entrégala al docente al finalizar la práctica.

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