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ENZIMOLOGIA CLINICA

Dr. Ronald Navarro Oviedo


Departamento de Biologa
Universidad Nacional de San Agustn
Introduccin

Prcticamente todas las reacciones qumicas que


tienen lugar en los seres vivos estn catalizadas
por enzimas.

Los enzimas son catalizadores especficos cada


enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi
siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un
grupo muy reducido de ellos.
Las protenas enzimticas son excelentes
reactivos analticos por que son muy sensibles y
selectivos

La selectividad es consecuencia de la
especificidad enzimtica

Herramientas eficaces en el diagnstico y


pronstico de una enfermedad
Valoracin enzimtica
Para la valoracin enzimtica hay que tener en cuenta:
Distribucin de las enzimas; o sea conocer la topologa enzimtica frente
a un aumento de una enzima para saber que correlacin clnica tiene.

Localizacin de las enzimas dentro de la clula; para poder entender


que tipo de dao sufri la misma. Por ejemplo si encontramos un aumento de enzimas
citoplasmticas indica que la alteracin no es tan severa, pero si adems aumentan las
enzimas mitocondriales significa que existen en ese tejido focos necrticos que
permiten el pasaje de las mismas que solamente aparecen en sangre en casos de
necrosis intracelular.

Conocer el tiempo de vida media de la enzima estudiada; para


poder interpretar los tiempos de desaparicin de esas actividades enzimticas
aumentadas. Por ejemplo si estamos frente al aumento plasmtico de una enzima de vida
media larga, llevar ms tiempo la normalizacin de sus valores desde el momento de su
entrada al plasma. En cambio, si estn aumentado los valores de cierta enzima y su vida
media es corta, esta se normaliza ms rpidamente.
Distribucin de las enzimas dentro
de la clula
En la clula las enzimas pueden encontrarse en el lquido celular
(citosol) o bien pueden estar fijadas a determinadas organelas (ej.
adheridas a las mitocondrias).

Hay enzimas 100 % citoplasmticas es decir que se encuentran


solamente en el citosol, a estas se las llama uniloculadas. Por
ejemplo GPT (glutmico-pirvico transaminasa) LDH (lctato
deshidrogenasa).

Otras enzimas estn en un cierto porcentaje en los organelos y otro


porcentaje en el citoplasma, es decir que son biloculadas, como la
GOT (glutmico-pirvico transaminasa) que est 60% en el
citoplasma y 40% en mitocondria, MDH (malato deshidrogenasa) 50
% en citoplasma y 50% en mitocondria.
Clasificacin de las enzimas que
aparecen en el plasma segn su origen
Alteraciones en la concentracin
enzimtica en suero

Podemos considerar dos casos:


1. Aumento de la actividad enzimtica
Incremento patolgico de la permeabilidad de membrana
Muerte y destruccin celular
Induccin enzimtica
Proliferacin celular

2. Disminuciones en la actividad enzimtica


Intoxicaciones
Enfermedades crnicas
Alteraciones del estado nutritivo
Liberacin y velocidad de aparicin de
las enzimas en la circulacin

Las enzimas son detenidas en las clulas por la membrana plasmtica.


La integridad de la membrana depende de la produccin de energa.
Cualquier proceso que altere la produccin de energa ya sea por disminucin de sustratos oxidables o de
oxgeno, promueve el deterioro de la membrana plasmtica, liberando las enzimas al torrente sanguneo.
Causas de dao o muerte celular
Hipoxia, por prdida de suministro sanguneo debido a estrechamiento (placas ateromatosas) o bloqueo
(trombosis) de arterias o venas, por lesin isqumica de la perfusin, por oxigenacin inadecuada debida a
fallo cardiorespiratorio, por prdida de la capacidad transportadora de oxgeno.
Agentes qumicos y farmacolgicos, contaminantes como Pb, Hg, alcohol, tabaco, frmacos.
Agentes fsicos, como traumas, fro, calor, radiaciones, energa elctrica.
Agentes microbiolgicos, bacterias, virus, hongos, protozoos, helmintos.
Mecanismos inmunitarios, anafilaxis, citotoxicidad, formacin de complejos inmunitarios.
Defectos genticos
Enfermedades nutricionales
La llegada de una enzima a la sangre vara de un tejido a otro:
Transferencia directa, tejidos muy vascularizados (hgado)
Transferencia indirecta, tejidos poco vascularizados o capilares impermiables (msculo esqueltico), por lo
tanto la enzima llega por la linfa
La localizacin intracelular de las enzimas afecta la velocidad con que aparecen en la
circulacin
primero la citoplasmticas: liberacin reversible; slo dao a membrana celualr
Luego las asociadas a organelos: lesiones necrticas
Qu caractersticas de las enzimas
debo conocer antes de poner a punto un
Mtodo enzimtico de anlisis?

Factores que
Caractersticas afectan a la
cinticas de las velocidad de las
reacciones reacciones
enzimticas. Km enzimticas y por
y vmax, su tanto a la
significado. actividad
enzimtica.
Factores que influyen la
Actividad enzimtica
Concentracin de sustrato
Adems, para desarrollar un ensayo enzimtico deben
controlarse todas aquellas variables experimentales que
puedan afectar a la velocidad de la reaccin enzimtica.
Concentraciones de:
Enzima (Actividad enzimtica)
Activadores
Inhibidores
Temperatura
pH
Fuerza inica, naturaleza de los iones presentes en el medio, etc.
Determinacin de la actividad
enzimtica

La velocidad de una reaccin se puede


expresar como: (a) moles de substrato
consumidos, o (b) como moles de
producto formado por unidad de tiempo:
v= [S]/ T = [P]/ T

La formacin de producto o
desaparicin del compuesto de partida
puede monitorizarse
espectrofotomtricamente midiendo
cambios en la absorcin ptica de la
solucin que contiene los substratos y el 1 Unidad de actividad
enzima enzimtica se define como
aquella cantidad de enzima
capaz de transformar 1 mol
de substrato por minuto.
Para determinar la actividad enzimtica es
necesario conocer:
La estequiometra de la reaccin que cataliza (cantidades de
reactivos y productos a usar en la reaccin)

Si necesita o no cofactor. Identificar el cofactor si lo


necesitara.

Conocer la concentracin mnima de sustrato y cofactor para


alcanzar la Vmax de reaccin.

Las condiciones ptimas de medida (pH, tiempo de incubacin,


temperatura, posibles activadores e inhibidores endgenos y
exgenos de la muestra, procesado de las muestras biolgicas).

Caractersticas de la tcnica analtica para esa muestra


biolgica.
Al determinar la actividad enzimtica se
obtiene una curva de progreso con tres fases:

Fase de Retraso o Periodo de


Latencia

Fase de Velocidad Inicial

Fase de Velocidad Reducida


La reduccin de la velocidad se
debe a:
Disminucin de la [S]
Se alcanza el equilibrio
Aumenta la reaccin inversa
Se produce inhibicin por
producto
Inactivacin progresiva de la
enzima por disminucin de la
capacidad del tampn para
controlar el pH
Reacciones acopladas

Si no se pueden medir fcilmente los sustratos o productos de la reaccin


enzimtica en la que se transforma el analito debe optarse por un esquema de
reacciones acopladas
Determinacin de glucosa
(sistema HK-G6PDH)
Reaccin
Auxiliar

HK
Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADP
G-6PDH
Glucosa-6-P + NADP+ 6-fosfogluconato + NADPH + H+

Reaccin indicadora

HK (Hexoquinasa); G6PDH (Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa)


Mtodos cinticos

Se mide la velocidad de
la reaccin enzimtica

Basados en cintica Sustrato


de orden uno
Enzima
Basados en cintica Activadores
de orden cero
Inhibidores
En este procedimiento se obtiene un nmero de
mediciones de absorbancia lo suficientemente
elevado como para afirmar, mediante algn
parmetro estadstico, que la velocidad de
transformacin es constante durante todo el
perodo de medicin

A partir de las mediciones obtenidas se calcula


el incremento de absorbancia por unidad de
tiempo:
Mtodo de Punto Final o de un punto

La reaccin enzimtica transcurre


hasta alcanzar el equilibrio.
Se mide algn cambio fsico o qumico
producido en el medio de reaccin

medida de Producto
medida de Sustrato
medida de Cofactor
Se realiza una nica medicin de absorbancia en la mezcla de reaccin
a un tiempo determinado (At).

Se debe controlar el tiempo (t) transcurrido desde que se inicia la


reaccin hasta el momento en que se efecta la medicin.

Para calcular el incremento de la absorbancia (A) es preciso realizar


un blanco de reactivo (ABR).

La velocidad de transformacin viene dada en estos casos por la


ecuacin:

No debe ser utilizado cuando la reaccin presenta un periodo de latencia


1. Medida del Producto

Fosfatasa
cida

FA
p-Nitrofenil fosfato p-Nitrofenol + Pi
( = 420 nm )
2. Medida del Cofactor
Mtodo de dos puntos

Se realiza dos mediciones de


absorbancia (A1, A2) en la mezcla de
reaccin a dos tiempos distintos (t1,
t2).

La velocidad de transformacin
puede calcularse empleando la
frmula:
Mtodo de tres puntos o ms

Se realiza tres o ms mediciones de


absorbancia, siendo estas
suficientes para asegurar que la
velocidad de transformacin es
constante.

Las mediciones se realizan en una


misma mezcla de reaccin y se
calcula el incremento de
absorbancia promedio por unidad de
tiempo:
Procedimientos continuos

Se obtiene un nmero de mediciones


de absorbancia lo suficiente grande
como para afirmar que la velocidad 1

Absorbancia
de transformacin de mantiene
constante durante todo el periodo de 2
mediciones.
A partir de las mediciones obtenidas
se calcula el incremento de la
absorbancia por unidad de tiempo.

Tiempo
Procedimiento continuo. 1. Medicin correcta. 2.
Medicin incorrecta por agotamiento de sustrato.
Medida de la actividad enzimtica de
muestras biolgicas

Primero se preparan los reactivos y se mezclan en una cubeta


de espectrofotmetro, de manera que las concentraciones de
los substratos estn por encima de sus respectivos Km.
La enzima se aade al aadir la muestra de suero.
Se mide la velocidad de reaccin como moles de S
consumidos por minuto.
Se expresa este valor en Unidades de Actividad Enzimtica
(IU)
Se refiere dichas unidades al volumen que se haba aadido
de suero
Se expresa el resultado final como Unidades de actividad
enzimtica por litro de suero.
Ejemplos de medicin de actividad
enzimtica en muestras biolgicas
340 nm
Otros mtodos utilizados
Principales causas de errores en las
determinaciones enzimticas
1. Errores en la colecta de la muestra
2. Errores en la conservacin de la muestra
3. Errores en la determinacin de la actividad enzimtica
Optimizacin, Estandarizacin y
control de calidad
1. Optimizacin
Buscar la mejor manera de realizar una actividad

La optimizacin de las condiciones de la reaccin se


realiza:
Variando un solo factor y estudiando su efecto sobre la
velocidad de reaccin.
Se selecciona una combinacin ptima de variables, en
base a los experimentos.
2. Estandarizacin
Tipificar, ajustar a un tipo de modelo o norma.
Se refiere a la expresin de los resultados y a las
modalidades de medida de las actividades enzimticas
Las comisiones Nacionales e Internacionales especifican:
Temperatura
Naturaleza y concentracin de tampn y pH
[S]
[Cofactor]
[Efectores]
Duracin de la preincubacin
[Adyuvantes]
Productos empleados para visualizar la reaccin
Dilucin de la muestra en el medio de reaccin

Para lograr la estandarizacin se debe:


Suministrar preparaciones enzimticas con determinada
actividad cataltica, para ser usadas como calibradores
Estandarizar las condiciones de anlisis
3. Control de Calidad
El control de calidad de las reacciones enzimticas es
complicado porque las enzimas tienden a desnaturalizarse
y perder actividad.

Usar:
Preparaciones liofilizadas que contienen diversas enzimas
Mezclas de sueros preparados en el laboratorio (no usar
sueros con VH, VIH)

Se debe realizar:
Control de calidad interno
Control de calidad externo
Grficas de control de calidad
Grfica de Levey-Jennings (se observa la media y la desviacin
estndar
Grfica de Cusum (mtodo de sumas acumuladas)
Principales enzimas
de inters clnico
ENZIMAS PRESENTES EN LAS
ENFERMEDADES HEPTICAS
Transaminasas
Alanina Aminotransferasa
Siglas: ALT, GTP, TGP

Nombre antiguo: Transaminasa glutmico-pirvica

pH ptimo: 7.4

Especificidad tejido: hgado rin, msculo (cardaco y esqueltico)

Localizacin: (90% citoplasma y 10% mitocondria)

Causas del incremento de ALT: Hepatitis, cirrosis, necrosis heptica,


colestasis, isquemia heptica, tumor heptico, drogas hepatotxicas, ictericia
obstructiva, miositis y pancreatitis

Factores interferentes: ALT: Anticonceptivos orales, acetominofen,


alopurinol, cido aminosaliclico, cido nalidxico, ampicilina, carbamazepina,
cefalosporinas, codena, tetraciclinas, dicumarol, indometacina, tetracilinas,
oxacilinas, salicilatos etc.
Aspartato Aminotransferasa

Siglas: AST, GOT, TGO

Nombre antiguo: Transaminasa glutmico-oxaloactico

pH ptimo: 7.4

Especificidad tejido: msculo esqueltico, hgado, msculo cardaco


riones y pncreas

Localizacin: 40% citoplasma y 60% mitocondria.

Cociente AST/ALT: Superior a 1 en pacientes con cirrosis alcohlica,


hepatitis crnica, congestin heptica y tumor metastsico de hgado.
Menor a 1 en la hepatitis vrica aguda y mononucleosis infecciosa.
Causas del incremento de AST: Hepatitis, cirrosis heptica, metstasis
heptica, drogas hepatotxicas, infarto de miocardio, trauma muscular
esqueltico, quemaduras graves, anemia hemoltica aguda, distrofia muscular
progresiva, mononucleosis infecciosa con hepatitis, enfermedad muscular
primaria (miopata), enfermedad renal aguda y convulciones recientes.

Factores interferentes: Anticonceptivos orales, antihipertensivos, agentes


colinrgicos, anticoagulantes tipo cumarina, drogas hepatotxicas,
eritromicina, isoniazida, metildopa, opiceos, salicitatos y verapamil
Fosfatasa Alcalina

Siglas: AP, ALP, SAP

Nombre sistmico (IUB): Fosfohidrolasa monoster ortofosfrica

pH ptimo: 8.5 a 10.3

Especificidad tejido: Hgado, epitelio tracto biliar y hueso


Mucosa intestinal, placenta

Localizacin: asociado a membrana.

Causas del incremento de AP: cirrosis heptica, obstruccin biliar intra y


extra heptica, tumor primario o metastsico de hgado, tumor metastsico
de hueso, recuperacin de fracturas seas, enfermedad de Paget,
hiperparatiroidismo, fases de crecimiento normal del hueso.
Causas de la disminucin de AP: hipotiroidismo, hipofosfatemia, desnutricin
y enfermedad celiaca.

Factores interferentes: Aumentados despus de la ingestin de alimentos.


Las drogas que : cido nicotnico, alopurinol, antibiticos, colchicina,
indometacina, metildopa, metotrexano, tetraciclinas, etc.
Las drogas que : arsnico, cianuro, fluoruro, nitrofurantona, oxalatos y sales
de zinc.
-Glutamil Transpeptidasa
Siglas: GGT, GT, GTP, GGTP

Nombre sistmico (IUB): -Glutamil transferasa

pH ptimo: 8.0 a 8.5

Especificidad tejido: en mayor concentracin en hgado y en menor


concentracin en rin, epitelio del tracto biliar, intestino, corazn,
pncreas, bazo y cerebro.

Localizacin: membrana y citoplasma (5%).

Causas del incremento de GGT: Hepatitis, cirrosis, necrosis heptica,


tumor heptico, colestasis, drogas hepatotxicas, ingestin alcohlica,
isquemia heptica, infarto del miocardio (4 a 10 das despus) e
insuficiencia cardiaca congestiva.
Factores interferentes: Pueden estar disminudos en la fase final del embarazo.
Las drogas que pueden aumentar los niveles de GGT son: alcohol, fenobarbital y
fenitona. Las drogas que pueden disminuir los niveles de GGT son: anticonceptivos
orales, citrato, oxalato, etc.
Colinesterasa/Pseudocolinesterasa

Siglas: CHE, CHS

Nombre sistmico (IUB): Acil-colina acil-hidrolasa

pH ptimo: 7.8 a 8.6

Localizacin: Dos tipos de colinesterasa


Acetilcolinesterasa: membranas de eritrocitos y membranas de neuronas.
Butirilcolinesterasa: plasma, hgado, msculo liso y adipocitos

Causas de la disminucin de CHE: envenanamiento por insecticidas


organofosforados, enfermedad hepatocelular, desnutricin y en personas
con deficiencia congnita de enzimas.

Factores interferentes: disminuidos durante el embarazo. Las drogas que


pueden disminuir los niveles son: anticonceptivos orales, atropina, cafena,
codena, citrato, oxalato.
ENZIMAS PRESENTES EN LAS
ENFERMEDADES CARDIACAS
Creatina Kinasa
Siglas: CK, CPK

Nombre sistmico (IUB): ATP Creatino N-fosfotransferasa

pH ptimo: 6.8 cuando se usa como sustrato creatinfosfato y 9.0 cuando se usa
como sustrato creatina

Especificidad tejido: msculo cardiaco, msculo esqueltico y cerebro

Localizacin: citoplasma y mitocondria.

Isoenzimas:
CK-BB (CK1): cerebro.
CK-MB (CK2): msculo cardaco.
CK-MM (CK3): msculo esqueltico.
Causas del incremento de CK total: infarto agudo al miocardio, distrofia
muscular, infarto pulmonar, convulsiones, alcoholismo crnico, hipocalcemia,
etc.

Causas del incremento de CKBB: infarto pulmonar, lesin cerebral, accidente


cerebro-vascular, embolia pulmonar, hemorragia subaracnoidea y cncer en el
cerebro.

Causas del incremento de CKMM: distrofia muscular, convulsiones recientes,


ciruga reciente, hipotiroidismo, hipocalemia, inyecciones intramusculares y
delirum tremens.

Causas del incremento de CKMB: infarto agudo del miocardio, desfibrilacin


cardiaca, isquemia cardiaca, miocarditis, distrofia muscular, ciruga de
aneurisma cardiaca
Factores interferentes: inyecciones intramusculares, ejercicios
intensos o moderados, cirugas recientes.
Drogas que pueden provocar aumento: ampicilina, anfotericina B,
alcohol, aspirina, captopril, colchicina, dexamtasona, furosemida,
lovastatina, litio, lidocana, morfina, succinilcolina
Lactato Deshidrogenasa
Siglas: LDH, LD

Nombre sistmico (IUB): L-lactato NAD-xido-reductasa

pH ptimo: 8.8 a 9.8 (cido lctico) y 7.4 a 7.8 (cido pirvico).

Especificidad tejido: corazn, hemates, hgado, msculo esqueltico, rin,


cerebro, pulmones y tejido linfoide.

Localizacin: citoplasma.

Isoenzimas:
LDH1 (CCCC):corazn, eritrocitos y rin
LDH2 (CCCM): corazn y sistema retculo endotelial
LDH3 (CCMM): pulmones y otros tejidos
LDH4 (CMMM): placenta y pncreas
LDH5 (MMMM): hgado y msculo esqueltico
Causas del incremento de LDH total: infarto del miocardio,
infarto pulmonar, hepatitis, cirrosis, ictericia obstructiva,
distrofia muscular, anemias, tumores, accidente cerebro-vascular.

Factores interferentes: Hemlisis. Drogas que pueden provocar


aumento: alcohol, aspirina, fluoruros, narcticos, anestsicos. El
cido ascrbico puede provocar una disminucin en los valores de
LDH.
Marcadores bioqumicos en el
infarto agudo al miocardio

Marcadores clsicos
Creatn fosfoquinasa (CPK total y CK-MB)
Lactato deshidrogenasa (LDH total y LDH1)
Aspartato aminotransferasa (AST/TGO)

Nuevos Marcadores
Troponina
Mioglobina
Miosina de cadena ligera
Tras el infarto, hay una liberacin de protenas intracelulares de las clulas
daadas. La primera en ser detectada es la troponina (5 10 horas post
infarto), seguida de la CK-MB, y finalmente la LDH, cuyo mximo se alcanza
a los 2 - 3 das post infarto
Enzimas presentes en las
enfermedades pancreticas
Amilasa
Siglas: AMS

Nombre sistmico (IUB): a-1,4-Glucan-glucano hidrolasa

pH ptimo: 7

Especificidad tejido: clulas acinares del pncreas, glndulas salivales

Localizacin: citoplasma.

Causas del incremento de AMS: pancreatitis aguda primaria, pancreatitis


crnica, ulcera pptica, perforacin de intestino, cetoacidosis diabtica,
obstruccin duodenal, embarazo ectpico, insuficiencia renal

Factores interferentes: Aumento: cido aminosaliclico, anticonceptivos


orales, aspirina, corticoides, etanol, furosemida, medios de contraste que
contienen yodo. Disminucin: citrato, glucosa y oxalatos
Lipasa

Siglas: LPS

Nombre sistmico (IUB): Triacilglicerol acilhidrolasa

pH ptimo: 3.5 a 7

Especificidad tejido: pncreas y mucosa gstrica

Localizacin: clulas acinares pancreticas

Causas del incremento de LPS: pancreatitis aguda primaria, pancreatitis


crnica, obstruccin duodenal, insuficiencia renal

Factores interferentes: drogas que producen aumento: codeina, metacolina,


indometacina, morfina.
Enzimas presentes en la
enfermedad prosttica
Fosfatasa Acida

Siglas: ACP, FAC

Nombre sistmico (IUB): Fosfohidrolasa monoster ortofosfrica

pH ptimo: 4.8 a 6.0

Especificidad tejido: prstata, eritrocitos, plaquetas, hgado y mdula sea.

Localizacin: asociada a membrana.

Causas del incremento de ACP: cncer de prstata, hipertrofia benigna de


la prstata, metstasis seas de cncer no prosttico, manipulacin reciente
de la prstata.

Factores interferentes: fluoruros, fosfatos, oxalatos, alcohol


Clofibrato (Atromid S)
Analizador
Bioqumico