UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIRIQUÍ DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA DE LA ALFA AMILASA

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y
SALIVAL
EXACTAS
Resumen
ESCUELA DE QUÍMICA Esta experiencia se realizó con la finalidad de
determinar las actividades enzimáticas de la alfa
amilasa salival. Donde se estudió el papel de la
amilasa salival en el proceso de digestión de los
carbohidratos. En la experiencia se determinó el
INFORME DE LABORATORIO efecto de la concentración de la enzima donde
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD se variaron los volúmenes de la amilasa
ENZIMÁTICA DE LA ALFA AMILASA observando que a medida que aumenta la
SALIVAL concentración de la enzima el tiempo de
reacción disminuye, luego en la parte del efecto
de la concentración de sustrato donde se varió
el volumen de la solución de almidón, se
observó que a medida que aumentaba la
concentración de sustrato el tiempo de reacción
PRESENTADO POR
aumentaba, al determinar el efecto de la
SHARON CUBAS temperatura en la cual al ir aumentando la
temperatura el tiempo de reacción enzimático
(4-782-2072)
aumentaba y por ultimo procedimos a
determinar el efecto del pH, en el cual al
aumentar el pH el tiempo de reacción de la
ESTEBAN ARJONA
actividad enzimática disminuía hasta llegar a su
(4-779-2316) pH optimo, donde se concluyó que los factores
que afectan la velocidad de la actividad
enzimática son la concentración de la enzima, la
concentración del sustrato, temperatura y pH
cada uno aumentando o disminuyendo la
actividad enzimática (velocidad de reacción)
PROFESORA
Objetivos
Mgtra. ALBERTINA MONTENEGRO
Señalar el concepto de enzima y los factores que
pueden afectar su actividad biológica.
Estudiar el papel de la amilasa salival en el
proceso de digestión de los carbohidratos.
Determinar la actividad enzimática de la alfa
amilasa salival.

16 DE MAYO DE 2017 Introducción

Las enzimas son moléculas de proteínas que
tienen la capacidad de facilitar y acelerar las
reacciones química que tienen lugar en los
tejidos vivos disminuyendo el nivel de la energía
de activación propia de la reacción.
La a-amilasa es una enzima proteica que se
encuentra en la saliva humana y cataliza la
degradación del almidón, que es un polisacárido
de reserva vegetal. La presencia de las enzimas
dentro del cuerpo de los animales, permite que
muchas reacciones puedan llevarse a cabo bajo
condiciones de temperatura constante, y un pH
con poca variación.
Existiendo en el cuerpo una gran cantidad de
enzimas y de acorde a la práctica detallaremos
de la enzima amilasa salival.
Para el proceso de digestión, las biomoléculas
ingeridas en la dieta deben ser degradadas a
sus componentes más sencillos para ser
absorbidas a nivel del tubo digestivo y a si llegar
al lugar correspondiente a nivel celular donde
participan en diversos procesos metabólicos
indispensables para el mantenimiento de una
adecuada homeostasis. Entre las principales
enzimas que participan en la digestión podemos
citar; la amilasa salival y pancreática para la
digestión de carbohidratos; la lipasa y
fosfolipasa para la digestión de lípidos; pepsina
y quimiotrpsina pata las proteínas. (Walla,
2000).
La acción de las enzimas, por sus
características físico-químicas, puede afectarse
por las condiciones presentes en el lugar de
acción de estas. Entre los principales factores
que pueden modificar la acción enzimática
tenemos:
1-La temperatura: Debido a que las enzimas
presentan estructuras proteicas una variación de
temperatura podría desnaturalizarlas, quiere
decir que perderían su conformación.
2-PH: La mayoría de las enzimas tienen un pH
característico a la cual pueden realizar sus
funciones, una variación en el PH haría que
estas pasaran de un estado ionizado (con carga)
a uno no ionizado (sin carga).
3-Inductores e inhibidores: Existen sustancias
químicas que pueden afectar la interacción del
sustrato y la enzima, ya sea aumentando la
actividad enzimática (inductores) o
disminuyéndola (inhibidores).
La amilasa salival puede romper enlaces
químicos llamados alfa-bonos que se producen
en medio de largas cadenas de molécula de
glucosa en los almidones complejos. El
propósito principal de la amilasa salival es el de
dirigir parcialmente almidones en cadenas más
cortas de glucosas llamadas. (Lehninger, 1993).
El término cinética enzimática implica el estudio
de la velocidad de una reacción catalizada por
una enzima y los efectos que pueden tener
factores como los inhibidores. Uno de los
principales estudios que se realizan en una
enzima es medir el efecto en la velocidad de la
reacción cuando se modifican las
concentraciones del sustrato y se mantienen
constantes la concentración de enzima, el pH, la
fuerza iónica del medio, la temperatura, entre
otros.
Materiales y reactivos
Solución de almidón al 1 y 2%, lugol, soluciones
amortiguadoras de pH 5.0, 6.8 y 10, agua
destilada, saliva humana, NaCl 0.9%, gradillas,
tubos de ensayo, vasos químicos (50-100ml),
varillas de vidrio, micropipetas Labmate de
100/1000 µL, baño termostático, placas de
porcelana.
Procedimiento
A. Obtención de la amilasa salival:
Se eligió dos voluntarios de salón y en un vaso
químico, salivaron 4ml de saliva. Esta se diluyo
en una proporción de 1:9 (2ml de saliva + 18ml
H20 destilada).
B. Experimentación:
I. Efecto de la concentración de la
enzima:
En 4 tubos de ensayos se añadieron a cada uno:
0,1mL enzima + 0,4mL H2O + 2mL almidón
0,5%.
0,2mL enzima + 0,3ml de H2O + 2mL almidón En 3 tubos de ensayos agregue a cada uno 2ml
0,5%. de soluciones amortiguadora de pH 5,0; 6,8; y
8,0.
0,3mL enzima + 0,2ml de H2O + 2mL de almidón Se añadió a cada tubo 2ml de la solución de
0,5%. almidón al 0.5% y 2ml de la solución de enzima,
incube 40 0C y se ensayó la prueba de Lugol
0,4ml enzima + 0,12ml de H2O + 2mL de almidón cada minuto.
0,5%. Grafique pH vs Velocidad de reacción.
-Al adicionar almidón se accionó el cronómetro,
y se realizó la prueba de Lugol cada minuto, para Resultados y discusión
ello se adicionó una gota de solución de Lugol y I. Efecto de la concentración de la enzima.
una gota del contenido del tubo en cada pocillo Cuadro 1. Efecto de la concentración de la enzima.
de la placa de porcelana. Esto se realizó hasta Concentración
N° Tiempo Velocidad
de la enzima
que la prueba del Lugol diera negativa, es decir, ensayo (minutos) (1/t)
(mL)
que el color del Lugol permanezca. 1 0.1 31 0.032
Con los datos obtenidos se construyó el gráfico 2 0.2 11 0.091
[E] en X vs inverso de tiempo en Y. 3 0.3 7 0.143
4 0.4 2.5 0.400
II. Efecto de la Concentración del
sustrato:
En cuatro tubos de ensayo se añadieron a cada
uno:
0,5ml almidón +1,5mL H2O.
1,0ml almidón + 1,0mL H2O.
1,5ml almidón + 0,5 mL H2O.
2,0ml almidón (solamente).
Se adicionaron 0,5mL de enzima y se
incubaron, accionó el cronómetro. Y se ensayó
la prueba de Lugol como en la parte I.
Se graficó Velocidad vs [S] en reacción. Figura 1. Gráfica de velocidad de reacción versus la
concentración de enzima.
III. Efecto de la temperatura:
En 4 tubos de ensayos. Se añadió a cada uno Discusión:
1ml de solución desaliva 1:9, se incubaron por En la gráfica numero 1 podemos observar y
5min cada tubo a la temperatura determinar la relación que existe entre la
correspondiente: concentración y la velocidad de reacción el cual
se observa que a medida que se aumentaba la
 tubo1 a 0 °C
concentración de la enzima (alfa amilasa salival)
 tubo2 a temperatura ambiente. la velocidad de la reacción aumentaba de forma
 tubo3 a 40 °C proporcional por lo tanto el tiempo de reacción
 tubo4 a 100 °C disminuye a mayor concentración de enzima.
Se agregaron a cada tubo 5ml de solución de Según (Gámez, 1986) en todas las reacciones
almidón 1%, y se realizó la prueba de yodo cada enzimáticas, si se incrementa la concentración
tres minutos hasta obtener un resultado de la enzima, se forma una mayor cantidad de
negativo. producto por unidad de tiempo. El incremento en
Se graficó temperatura en X vs Velocidad en Y. la velocidad de reacción es directamente
proporcional al incremento en la concentración
IV. Efecto del pH: de la enzima, siempre y cuando la cantidad de
 sustrato no sea limitante o variante, es decir que de sustrato, la velocidad inicial aumenta hasta
el sustrato no llegue agotarse. que la enzima está completamente saturada por
el sustrato.
II. Efecto de la concentración del sustrato.
Cuadro 2. Efecto de la concentración de sustrato. III. Efecto de la temperatura.
Concentración Cuadro 3. Efecto de la temperatura.
N° Tiempo Velocidad
del sustrato Conc.
ensayo (s) ([S]/t)
(%) N° Temperatura Tiempo de V
1 0.1 40 2.50𝑥10−3 ensayo (°C) (min) sustrato ([S]/t)
2 0.2 60 3.33𝑥10−3 (%)
3 0.3 100 3.00𝑥10−3 1 5 >30 0.42 0.014
4 0.4 140 2.86𝑥10−3 2 28 5 0.42 0.084
3 90 >40 0.42 0.01

Figura 2. Gráfica de velocidad de reacción versus la

concentración del sustrato.
Discusión:
En la gráfica 2 podemos observar que a la
velocidad de la reacción aumento hasta cierto
punto en este caso el punto 0.2 y de ahí
comenzó a disminuir, esto se debe a una
saturación de sustrato. De acuerdo con
(Federick, 1979), usando concentraciones
crecientes de sustrato se llega a observar un
compartimiento especial llamado Michaelis–
Menten, en donde a bajas concentraciones de
sustrato la velocidad de reacción enzimática es
directamente proporcional a la concentración del
mismo, siendo una reacción de primer orden. A
mediana concentraciones de sustrato, la
velocidad de la reacción enzimática ya no
es directamente proporcional a la cantidad del
sustrato, aunque sigue aumentando la
velocidad, lo que corresponde a una reacción de
orden mixto. A elevadas concentraciones de
sustrato, la velocidad de la reacción enzimática
ya no aumenta más, por más sustrato que se le
adicione, indicando una saturación de la enzima
con su sustrato y siendo una reacción de orden
cero. A medida que aumenta la concentración
Figura 3. Gráfica de velocidad de reacción versus la
temperatura.
Discusión:
En la gráfica 3 podemos observar que a
temperatura 5 0C la velocidad de reacción fue
más rápida en comparación con las otras
temperatura también podemos observar que el
tiempo de reacción fue mucho más rápido como
lo demuestra el cuadro 3 por ende se observó
una mayor actividad enzimática a una
temperatura de 28 oC esto se debe a que esta
temperatura la alfa amilasa salival se encuentra
a una temperatura normal lo cual sus reacciones
son satisfactoria a estas temperatura ya q está
temperatura es la más cercana a la temperatura
optima de la amilasa salival que de 37oC (porque
en la boca y en las glándulas salivales está a esa
temperatura). Al disminuir demasiado la
temperatura como en el caso de 5 0C, los
choques entre las moléculas disminuyen
también, por lo que la actividad enzimática baja
hasta el punto de no reaccionar. Por el contrario,
al aumentar la temperatura de incubación a 80
0
C, los choques entre las moléculas se van a
acrecentar de tal forma que la enzima se va a
desnaturalizar
 En general, los aumentos de temperatura
aceleran las reacciones químicas por cada 10o
C de incremento, la velocidad de reacción se
duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas
siguen esta ley general. Sin embargo, al ser
proteínas, a partir de cierta temperatura, se
empiezan a desnaturalizar por el calor. La
temperatura a la cual la actividad catalítica es
máxima se llama temperatura optima, por
encima de esta temperatura, el aumento de
velocidad de la reacción debido a la temperatura
es contrarrestado por la pérdida de la actividad
catalítica debida a la desnaturalización térmica,
y la actividad enzimática decrece rápidamente
hasta anularse, (Walla, 2000).
IV. Efecto del pH.
Cuadro 4. Efecto del pH.
Conc. de
N° Tiempo Velocidad
pH sustrato
ensayo (min) ([S]/t)
(%)
1 5.0 2 0.42 0.21
2 6.8 1.53 0.42 0.27
3 10.0 >30 0.42 0.014
Figura 4. Gráfica de velocidad de reacción versus EL
pH.
Discusión:
En la gráfica 4 podemos observar que al pH 6.8
se observa una mayor velocidad de reacción y
un menor tiempo de reacción como lo demuestra
la tabla 4 esto se debe a que el pH óptimo de la
alfa amilasa salival es de 6.8, Todas las
enzimas tienen un pH óptimo, en donde tienen
mayor actividad, y a medida que se alejan de
ese pH (para ambos lados) disminuye en su
actividad, como lo pudimos observar a pH 5 y
pH10 su velocidad de reacción disminuyo por lo
tanto su tiempo de reacción fue más lento.
De acuerdo a (Marks, 2006) los cambios del
mismo pueden alterar al estado de ionización de
las cadenas laterales de los aminoácidos ácidos
y básicos, en donde estos cambios pueden
afectar a la afinidad de la enzima por el sustrato,
si las cargas se ven alteradas las cargas de los
aminoácidos que participan en la formación de
interacciones no covalentes entre la enzima y
el sustrato para formar complejo. El pH óptimo
de una enzima puede puede guardar relación
con cierta carga eléctrica de la superficie o con
condiciones óptimas para la fijación de la enzima
a su sustrato. Cuando hay exceso de iones
hidrógenos, las enzimas los unen a sus
moléculas y ante un déficit los ceden, como
todas las proteínas las enzimas desempeñan su
función por los residuos de aminoácidos.
Cuando la concentración de iones hidrogeno es
muy baja en comparación con la concentración
optima la molécula les cede desapareciendo
cargas positivas o apareciendo cargas en sus
superficies. Ante una concentración elevada de
iones hidrogeno, algunos se fijan a la molécula
desapareciendo cargas negativas o poniendo
cargas positivas que no existían.
A lo largo de cada una de las pruebas discutidas
anteriormente se realizó la prueba con el
reactivo de Lugol con el fin de poder calcular la
principalmente como se daba la velocidad de
reacción de la enzima alfa amilasa cuando fue
sometida a variaciones en concentración,
temperatura y pH. La prueba de Lugol se empleó
para determinar el momento cuando ya se ha
producido la hidrolisis de la enzima salival, lo
que implica perdida de toda su actividad
enzimática.
Dado que el almidón está integrado por dos
fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe
tenerse en cuenta las reacciones que ambas
producen (así como sus respectivos productos
de hidrólisis) con el reactivo de Lugol:
Figura 5. Reacción entre el reactivo de Lugol y el
almidón.
Conclusiones:
 Se comprobó que una variación excesiva ya
sea de la temperatura y el pH pueden afectar
la actividad biológica enzima negativamente.
 Se comprobó que la velocidad de reacción
enzimática tiene una relación directamente
proporcional a la concentración de la
enzima, a mayor cantidad de enzima mayor
velocidad de reacción.
 Por efecto del pH comprobamos que cuando
una enzima se encuentra en su pH óptimo
alcanza su velocidad máxima de reacción.
 Por efecto de la temperatura concluimos que
el aumento de la temperatura puede
aumentar la velocidad de reacción pero solo
hasta cierta temperatura dependiendo de la
temperatura optima de la enzima ya que un
aumento brusco o elevado desnaturaliza la
proteína.
 Es necesario conocer el ph ya que es la
intensidad máxima de la actividad de la
enzima, ocurre en el pH óptimo, con rápida
disminución de la actividad a cada lado de
este valor de pH. La actividad óptima
generalmente se observa entre los valores
de 5 y 9. El pH óptimo de una enzima puede
guardar relación con cierta carga eléctrica de
la superficie, o con condiciones óptimas para
la fijación de la enzima a su sustrato.
Bibliografía:
-Federick. L. (1979), Química general. Buenos
aires: McGRAW-HILL.
-Gámez. G. (1986), Química general con manual
de laboratorio. México: McGRAW – HILL.
-Lehninger, A. David, L. Cox, M. (1993)
Principios de Bioquímica´. Barcelona, España:
Ediciones Omega.
-Marks, R.; Collen S.; Lieberman, M. (2006),
BIOQUIMICA BASICA. Un enfoque clínico.
España: Mcgraw-HILL Interamericana.
-Walla, M. Marchuk, D. (2000). Activated
enzymatic: Identificacion de alfa-amilasa salival.
España: Lancet.
Cuestionario:
1. Describa las características estructurales del
almidón que permiten su identificación con
Lugol.
R: La prueba del yodo (Lugol) es una reacción
química usada para determinar la presencia o
alteración de almidón u otros polisacáridos. El
almidón es un polisacárido formado por la
polimerización de miles de monómeros de
glucosa que forman largas cadenas. El almidón
está realmente formado por una mezcla de dos
sustancias, amilasa y amilo pectina. La reacción
entre el reactivo de Lugol y el almidón da como
resultado la formación de cadenas de
poliyoduro. La amilosa, el componente del
almidón de cadena lineal, forma hélices donde
se juntan las moléculas de yodo, formando un
color azul oscuro a negro.
2. Señale las dificultades en la realización del
experimento.
R: Las dificultades que se tuvieron al momento
de realizar este experimento fue en parte porque
se utilizó una concentración de almidón muy alta
que se encontraba al1%, lo que hiso que se
demorara más el momento final de la reacción,
lo que quiere decir que para una próxima
experiencia es recomendable utilizar una
concentración más baja; también pudo
haber afectado el hecho de que los
voluntarios que procedieron a salivar no se
encontraban en completo ayuno y esto pudo
provocar que la amilasa salival no se encontrara
muy pura. Por otro lado también la medición del
tiempo adecuadamente, pudo influir para
calcular la velocidad de reacción de la enzima.
3. ¿Qué otro prueba podría emplearse para la
realización de este experimento? Explique.
R: Otra prueba que podría emplearse en la
prueba con reactivo de Benedict, ya que esta
prueba permite identificar azúcares reductores.
Si existe hidrólisis del almidón se formará un
precipitado rojo ladrillo que indica la presencia
de azúcares como la glucosa y la maltosa.