INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE

BIOTECNOLOGIA

LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES
Semestre 24/1 agosto-diciembre 2023

Practica 5: “Efecto de la concentración de enzima

sobre la actividad enzimática”.

5BM1
EQUIPO 6

INTEGRANTES:
- Martínez Vásquez Ximena
- De la Cruz Pérez Franklin
- Espinosa Balderas Genaro
- Salas Hernández Itzel Ameyalli
- Contreras Andrade Franco Emmanuel

Profesores:
• Dr. Enrique Durán Páramo
• Dra. Aída Margarita Zamora Contreras

Fecha de entrega: 19/10/2023

Objetivo General:
Estimar la actividad enzimática y determinar el efecto de la concentración de
la enzima sobre la actividad enzimática.

Objetivos específicos:
• Estimar la actividad invertasa.
• Estimar la actividad invertasa especifica.
• Determinar el efecto de la concentración de invertasa sobre la actividad
enzimática.

Resultados:

3500.000

3000.000

2500.000
Glucosa real (µmol/L)

2000.000

1500.000
y = 758.47x
1000.000

500.000

0.000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Tiempo (min)

Grafica 1. Estimación de la velocidad de reacción en términos de glucosa a una concentración de

7.5 mg/L de invertasa.

1
 9000.000
8000.000
7000.000

Glucosa real (µmol/L) 6000.000

5000.000
4000.000
y = 2488.7x
3000.000
2000.000
1000.000
0.000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Tiempo (min)

Grafica 2. Estimación de la velocidad de reacción en términos de glucosa a una concentración de

15 mg/L de invertasa.

8000.000

7000.000
Glucosa real (µmol/L)

6000.000

5000.000
y = 3917x
4000.000

3000.000

2000.000

1000.000

0.000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Tiempo (min)

Grafica 3. Estimación de la velocidad de reacción en términos de glucosa a una concentración de

30 mg/L de invertasa.

2
Tabla 1. Determinación del efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad invertasa, en
cinética de hidrólisis de sacarosa.

[Invertasa] (mg/L) en el Actividad invertasa (unidades

biorreactor invertasa/L)

7.50 758.47
15.0 2488.7
30.0 3917

4200

3700

3200
(unidades invertasa/L)
Actividad invertasa

2700

2200

1700

1200

700
6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00
[Invertasa] (mg/L) en el biorreactor

Grafica 4. Resultados de la actividad invertasa obtenida a diferentes concentraciones de enzima.

3
 Tabla 2. Estimación de la actividad invertasa especifica (unidades invertasa/mg proteína) en
cinética de hidrólisis de sacarosa a diferentes concentraciones de enzima.

Actividad invertasa
[Invertasa] (mg/L) en Actividad invertasa (unidades [Proteína] (mg/L) en específica
el biorreactor invertasa/L) el biorreactor (unidades invertasa/mg
proteína)
7.50 758.47 3.745 202.55
15.0 2488.70 6.473 384.48
30.0 3917.00 9.924 394.70

450.00

400.00
(unidades invertasa/mg proteína)
Actividad enzimática específica

350.00

300.00

250.00

200.00
6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00
[Invertasa] (mg/L) en el biorreactor

Grafica 5. Resultados de la actividad invertasa especifica obtenida a diferentes concentraciones de

enzima.

4
Análisis y discusión de resultados:
Las últimas dos gráficas representan visualmente el efecto de la concentración de
la enzima sobre la actividad enzimática y la actividad enzimática específica. Donde
se observa que, de las tres diferentes condiciones comparadas en la
experimentación, la concentración óptima para la actividad invertasa es de 30 mg/L,
ya que el aumento en la concentración enzimática es proporcional al aumento de la
velocidad de la reacción catalizada (Timberlake, 2013), y por ello en ese punto en la
gráfica 4 se denota la mayor conversión de producto a partir del mismo sustrato
(Sacarosa) en un minuto.
Sin embargo, a la hora de visualizar la gráfica 5 nos damos cuenta de que la actividad
invertasa específica incrementa mínimamente cuando se usa 15 mg/L y 30 mg/L de
enzima. Lo cual indica que la velocidad de reacción alcanza un punto máximo
(Vmax) que se mantiene y luego decae independientemente del incremento en la
concentración de enzima, porque las moléculas de sustrato se están agotando
(Escohotado Ibor, 2011). Esto quiere decir que el sustrato actúa como reactivo
limitante, porque en la gráfica 3 a partir de 7800 µmol de glucosa real/ L la curva
deja de crecer y se mantiene prácticamente igual frente al tiempo.
Lo anterior es evidenciado en la figura 1, ya que en la tesis de Martínez limón y
Morales Godos (2007) se observa el mismo comportamiento en la actividad
enzimática de la invertasa cuando se usan diferentes concentraciones de enzima y
sustrato, donde de igual manera ambas variables llevan a la velocidad de reacción
a un punto máximo donde se satura, limita y luego decae.

Figura 1. Efecto de la concentración de sacarosa sobre la actividad enzimática a diferentes

concentraciones de invertasa (0.01-0.1 g/L) (Martínez limón y Morales Godos, 2007).

5
Conclusiones:

• La actividad invertasa y actividad invertasa específica a una concentración de

7.5 mg/L de invertasa respectivamente es de 758.47 Unidad invertasa/L y
202.55 Unidad invertasa/mg de proteína.

• La actividad invertasa y actividad invertasa específica a una concentración de

15 mg/L de invertasa respectivamente es de 2488.70 Unidad invertasa/L y
384.48 Unidad invertasa/mg de proteína.

• La actividad invertasa y actividad invertasa específica a una concentración de

30 mg/L de invertasa respectivamente es de 3917 Unidad invertasa/L y
394.70 Unidad invertasa/mg de proteína.

Bibliografía:

• Timberlake, K. (2013). Química general, orgánica y biológica: estructuras de la vida. México:

Pearson Educación.

• Escohotado Ibor MT. Aplicaciones enzimáticas en procesos de conservación y restauración

de obras de arte. consolidación de celulosa. Universidad del pais Vasco.
https://addi.ehu.es/handle/10810/14292?show=full. Published 15 de julio de 2011. Accedido
octubre 18, 2023.

• Martínez Limón, J., & Morales Godos, F. (2007). Caracterización cinética de la hidrólisis de
sacarosa con invertasa libre e inmovilizada [Tesis de Licenciatura, Instituto Politécnico
Nacional].https://tesis.ipn.mx/bitstream/handle/123456789/14662/Binder1.pdf?sequence=1
&isAllowed=y

6
Memoria de cálculo:

Determinación de la concentración de proteína de la solución invertasa.

Grafica 6. Curva de calibración para la estimación de la concentración de proteína BSA

(Albúmina sérica Bovina)

Ecuación de la recta obtenida a partir de la linealización de la curva de calibración

para BSA del primer experimento.

𝑦 = 0.0046𝑥

Despeje de la ecuación para determinar la concentración (g/L) de invertasa a partir

del promedio de las absorbancias resultantes de la muestra de la solución de
invertasa.

0.345
𝑥= = 74.891
0.0046

7
Para estimar la concentración de la proteína en el biorreactor, se debe dividir entre
20 la concentración de la solución de invertasa, ya que es una dilución 1/20 el
reactor enzimático.

74.891 𝑚𝑔
= 3.745 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑣𝑒𝑟𝑡𝑎𝑠𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑏𝑖𝑜𝑟𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟.
20 𝐿

Estimación de la velocidad inicial de reacción en cinéticas de hidrolisis de sacarosa

con invertasa = 15 mg/L

Grafica 7. Curva de calibración para la estimación de la concentración de azucares

reductores (Glucosa)

Ecuación de la recta obtenida a partir de la linealización de la curva de calibración

para glucosa del primer experimento.
𝑦 = 0.7874𝑥

Despeje de la ecuación para determinar la concentración (g/L) de azúcares

reductores para cada una de las cinéticas realizadas:

𝑦
𝑥=
0.7874

Donde “y” es el valor de cada uno de los promedios de absorbancia obtenidos para
cada cinética a diferente tiempo.

8
Por motivos de memoria de cálculo solo se colocarán los valores obtenidos en
condiciones de 25 °C.
Tabla 3.- Concentración de azúcares reductores.

Tiempo (min.) Concentración de glucosa real (g/L)

0.5 0.115
𝑥= = 0.146
0.7874

1
0.215
𝑥= = 0.273
0.7874

1.5 0.425
𝑥= = 0.540
0.7874

2 0.720
𝑥= = 0.914
0.7874

3 0.914
𝑥= = 1.160
0.7874

Eliminación de la Fructuosa dividiendo entre 2 la concentración obtenida para cada

cinética de azucares reductores que estaba en términos de Glucosa.

Figura 1. Ecuación estequiométrica de la hidrólisis de sacarosa por invertasa.

Este tratamiento de datos se puede realizar ya que el producto de azucares

reductores está en la relación 1:1, por ello la mitad de la concentración pertenece a
la glucosa real.

9
 Tabla 4.- Concentración de Glucosa real para cada cinética enzimática.

Tiempo (min.) Concentración de glucosa real (g/L)

0.146𝑔/𝐿
0.5 = 0.073
2

0.273𝑔/𝐿
1 = 0.137
2

0.540𝑔/𝐿
1.5 = 0.270
2

0.914 𝑔/𝐿
2 = 0. .457
2

1.160𝑔/𝐿
3 = 0.580
2

Conversión de unidades para graficar la evolución de una reacción enzimática,

donde la invertasa hidroliza la sacarosa. Peso molecular de la glucosa = 180 g/mol

𝑔 𝑚𝑜𝑙 1000 𝑚𝑚𝑜𝑙 1000 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝜇𝑚𝑜𝑙

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑙 = ∗ ∗ ∗ =
𝐿 180 𝑔 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐿

Tabla 5. Concentración de glucosa real ((𝜇𝑚𝑜𝑙 /L)

Tiempo (min.) Concentración de glucosa real (𝜇𝑚𝑜𝑙 /L)

0.5 405.695

758.474
1
1499.309
1.5
2540.005
2
3223.219
3

10
La velocidad inicial de reacción se obtiene de la pendiente de la recta que pasa por
los tres primeros puntos de la curva que se forma al graficar el tiempo vs
concentración de glucosa. Véase gráfica 1.

𝑦 = 758.47𝑥
m = 758.47 µmoles de glucosa/L*min

Debido a la relación estequiométrica que se observa en la figura 1, podemos deducir

que 1µmol de sacarosa produce 1µmol de glucosa. Por lo tanto, la velocidad de
reacción en términos de sacarosa es:

758.47 µmoles de glucosa/L*min = 758.47 µmoles de sacarosa/L*min

µmoles de sacarosa/min = 1 unidad de actividad de invertasa

La actividad de la invertasa es:

758.47 Unidad invertasa/L

La actividad invertasa específica es:

758.47 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑖𝑛𝑣𝑒𝑟𝑡𝑎𝑠𝑎/𝐿 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑖𝑛𝑣𝑒𝑟𝑡𝑎𝑠𝑎

𝑚𝑔 = 202.55
3.745 𝐿 𝑑𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑏𝑖𝑜𝑟𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎

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