Universidad Científica del Sur

Carrera de Medicina Humana

Practica N.º 06 FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

INFORME LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

1. INTRODUCCIÓN

Las enzimas son proteínas que tienen la propiedad de acelerar las

reacciones químicas sin modificar la constante de equilibrio ni el cambio de
energía libre de la reacción.

Las reacciones químicas que se dan en los seres vivos no podrían tener lugar
sin la presencia de las enzimas. Estas macromoléculas, que generalmente
son proteínas, catalizan las reacciones bioquímicas, permitiendo que los
sustratos se conviertan en los productos que necesita la célula. Como todo
catalizador, las enzimas no se consumen en las reacciones que catalizan,
pero a diferencia de otros catalizadores de naturaleza inorgánica, las
reacciones que catalizan son muy específicas: sólo interaccionan con
determinados sustratos, y sólo facilitan el curso de determinadas
reacciones.(1)

La velocidad de una reacción enzimática es afectada por la concentración de

sustrato, cuando la concentración de sustrato es relativamente baja con
respecto al valor Km, la velocidad de la reacción depende linealmente de la
concentración de sustrato (reacción de primer orden), luego a medida que se
incrementa éste se pierde la linealidad, hasta que la velocidad de reacción
 prácticamente ya no se incrementa (reacción de orden cero), es decir, hemos
alcanzado la velocidad máxima (Vmax) de la reacción. Por este motivo, al
graficar la velocidad de la reacción en función de la concentración de sustrato
obtendremos una curva hiperbólica.(2)

2. OBJETIVOS
•Determinar el Km y Vmáx experimental de la pepsina a partir de la gráfica de
Vo contra [S].
•Determinar el Km y Vmáx experimental de la pepsina a partir de la gráfica de
dobles recíprocas 1/Vi contra 1/[S].
3. FUNDAMENTO TEÓRICO

Los biocatalizadores específicos sintetizados por el organismo, llamados

enzimas, son proteínas que intervienen en las reacciones biológicas,
acelerando la velocidad de reacción hasta alcanzar su punto de equilibrio.
Las enzimas son sumamente específicas en las reacciones que catalizan y
en los compuestos (llamados substratos) sobre los que actúan. (3)

La cinética enzimática es el estudio del comportamiento de la velocidad en

reacciones catalizadas por enzimas. Las mediciones de la cinética
proporcionan una herramienta bioquímica muy útil para calcular la
concentración de una enzima en una muestra biológica y comparar su
actividad catalítica con la de otras enzimas. Además, las mediciones cinéticas
permiten describir de manera cuantitativa el efecto de un veneno o
medicamento sobre la actividad de una enzima.

La velocidad a la que procede una reacción enzimática está controlada en

parte por las concentraciones de la enzima y el substrato. A medida que
progresa la reacción, aumenta la concentración de los productos a expensas
de la desaparición de los correspondientes sustratos, en tanto que la
concentración de la enzima no se altera.

La actividad de una enzima describe qué tan rápido se está catalizando la

reacción que convierte un sustrato en producto. Esta actividad depende en
 gran medida de las condiciones de la reacción, que incluyen temperatura, pH,
concentración de la enzima y concentración del sustrato.

En el siguiente informe se estudiará el efecto de estos factores sobre la

actividad enzimática de la pepsina en presencia de albúmina. La pepsina es
un enzima proteolítico (proteasa ácida) segregada por las células principales
de las glándulas gástricas, tiene un peso molecular de 34 644 Da. Hidroliza
los enlaces peptídicos, descomponiendo así las proteínas en aminoácidos. La
pepsina sólo realiza la proteólisis en medio ácido, actúa a un pH bajo, por lo
que es precisa la presencia de ácido clorhídrico para la realización de la
digestión gástrica de las proteínas. Las células de las glándulas gástricas no
producen directamente pepsina, sino que su producto es el pepsinógeno,
sustancia precursora sin capacidad digestiva que se convierte en pepsina en
la luz de la glándula, al entrar en contacto con el ácido clorhídrico y con la
pepsina ya producida.

4. MATERIAL Y MÉTODOS
❖ MATERIALES:
a. 01 gradilla
b. 17 tubos de ensayo 13x100mm
c. 01 hígado de pollo (enzima fosfatasa ácida del hígado)
d. 01 termómetro
e. 01 piseta con agua destilada
f. 02 pipetas graduadas o volumétricas 10mL
g. 01 propipeta
h. 01 albúmina a [1.3] absorbancia 450 nm frasco 12 mL
i. 01 pepsina 2% frasco 3 mL
j. 01 buffer acetato 0.1M pH 3.6 frasco 5mL
k. 01 baño maría 37°C o plancha de calentamiento
l. 01 beaker 250 mL
m. 01 termómetro
❖ MÉTODOS: Por la Desaparición del Substrato
5. PARTE EXPERIMENTAL
La actividad enzimática se medirá por la desaparición del substrato
(disminución de la turbidez en los tubos que contienen albúmina), la cual se
determinará en el Espectrofotómetro a 450 nm.
Procedimiento:
1. Enumerar 8 tubos de ensayos de 13x100 mm
2. Adicionar los reactivos como se describen en la tabla para cada tubo de
ensayo:
3.Mezclar
4. Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 en el espectrofotómetro.
Considerar las Absorbancias como Lectura Inicial.
5. Luego, incuba los nueve tubos a 37ºC por 5 min.
6. Añadir 0.5 mL de pepsina a cada tubo (del tubo 9 a los tubos 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10. Incubar a 37ºC por 5 min o hasta que el tubo 1 este claro.
7. Detener la reacción colocando los tubos en un baño de hielo.
8. Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 en el espectrofotómetro.
9. Considerar las Absorbancias como Lectura Final.

● Determinar la actividad enzimática: Actividad Enzimática = Lectura

Final- Lectura Inicial
● Graficar en papel milimetrado para Calcular el Km y Vmáx de la
pepsina en cada una de las gráficas
● Calcular el Km y Vmáx
-Km
(constante para cada enzima) = concentración de S a la que V0 es ½
Vmax. Es una medida de la afinidad de la enzima por S. Cuanto menor
es Km, mayor es la afinidad de la enzima por S.
-Vmax
Velocidad máxima teórica = la velocidad cuando todos los centros
activos están ocupados con sustrato.
6. RESULTADOS
5.1. COMPLETE EL CUADRO SEGÚN LO INDICADO EN CLASE.

5.2. DETERMINE LA: Vo y Km

La Vmax y Km para la pepsina bajo estas condiciones experimentales es

de 0.44 Abs y 2.86 %, respectivamente.
Vo= ½ Vmáx= 0.44/2= 0.22 Vo=0.22
Km= 2.86 %
 5.3. GRAFIQUE C2 (S) vs ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (Vo)

5.4 GRAFIQUE 1/ (S) vs 1 /(Vo)

7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Como se puede evidenciar en los gráficos, se realizó el análisis de la
actividad enzimática mediante la desaparición del sustrato, todo mediante la
visualización de resultados en el espectrofotómetro de manera virtual. Como
resultados pudimos observar que la actividad enzimática es de constante
variación según la cantidad de sustrato. A su vez se pudo determinar cuál es
el punto de velocidad máxima mediante el análisis de los cuadros, dándonos
 un resultado de 0.44 y esto influye en la concentración de sustrato a mitad de
la Vmax (Km) el cual queda con un valor de 2.86 dándonos a entender su
afinidad por el sustrato.

A su vez es importante indicar que los resultados obtenidos en la ecuación

son directamente proporcional a la curva que se forma, permitiéndonos
concluir que la enzima presente en el experimento aumenta la velocidad de la
reacción química, a su vez de manera teórica indica que la enzima no se
degrada durante la reacción.

8. CONCLUSIONES

- Las enzimas tienen la capacidad de controlar las reacciones químicas,

acelerando o incrementando la velocidad de reacción. Tienen la propiedad de
ser específicas con respecto a las reacciones que catalizan y hacia los
sustratos, en el cual ejercen su función.
- La actividad enzimática depende de dos factores importantes; la
concentración de la enzima y la concentración del sustrato , esto teniendo en
cuenta que el pH y la temperatura estén estables, ya que también influyen en
la actividad enzimática. En este trabajo, la enzima pepsina necesita de un pH
bajo o ácido para ejercer su actividad enzimática.
- La actividad enzimática se logró medir por la desaparición del sustrato a
medida que avanza la reacción, para lo cual se utilizó el espectrofotómetro,
albúmina en diferentes tubos de ensayo y la pepsina.
- La velocidad de la reacción enzimática depende linealmente de la
concentración del sustrato hasta alcanzar una velocidad máxima, el cual
empieza a tener valores constantes a medida que se incrementa el sustrato,
lo cual indica que existen cantidades específicas de enzima para un sustrato,
es decir todas las enzimas ya están combinadas con sustrato, por tanto el
exceso de sustrato satura a las enzimas, entonces la velocidad de la reacción
alcanza su máximo y la adición de más sustrato no aumenta más la velocidad
de la reacción.
9. RECOMENDACIONES
- Ampliar las cantidad de muestras
- Sería interesante ampliar la práctica con el estudio de la influencia de otros
factores como el pH o la temperatura.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Amat Marco M, Ivars Rodríguez A,(s/f). ESTUDIO DE LOS FACTORES

QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA
Recuperado el 30 de septiembre de 2021, de
https://www.cac.es/cursomotivar/resources/document/2010/1.pdf

2. Fundamentos de biocatálisis(2010). Ucm.es. Recuperado el 30 de

septiembre de 2021, de
https://webs.ucm.es/info/btg/personales/jvsgago/fundaments%20de%20biocat
alis3%20%5bModo%20de%20compatibilidad%5d.pdf

3. Guìa práctica de Bioquímica. 3ª edición. Salazar Sánchez JA & Salazar

García JB. (2021-II). Facultad de Ciencias de la Salud-Medicina Humana