Está en la página 1de 4

PRÁCTICA No.

7
CINÉTICA ENZIMÁTICA

Carlos García1​ ​ (201701330), Diana Fajardo1​ ​ (201701418), Susan Mancilla1​ ​(201701596), Javier
Ciragua1​ ​ (201712127)
1​
Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San
Carlos de Guatemala, Carrera de Química Biológica
INTRODUCCIÓN
Las reacciones químicas en el sistema biológico solo ocurre en presencia de catalizadores, que son
proteínas llamadas enzimas. En el estudio de la actividad catalizadora de las enzimas resulta de
gran importancia conocer algunos datos como la velocidad máxima (V​máx​) de la reacción catalizada
por determinada enzima, misma que se ve afectada por la cantidad de enzima disponible en los
tejidos, la cantidad de sustrato disponible, el pH y temperatura, entre otros (Oñate, 2010). Otro
valor de extrema importancia en la cinética enzimática es el K​M​, este valor expresa la cantidad de
sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, esto representa un índice
cualitativo útil para entender el comportamiento fisiológico de las enzimas, dado que un valor alto
de K​M ​indica una baja afinidad de la enzima por el sustrato, un valor bajo, por el contrario, indicaría
una alta afinidad de la enzima por el sustrato. La importancia de determinar la actividad
enzimática radica en que se puede revelar información útil sobre su mecanismo catalítico, su papel
en el metabolismo, los factores que afectan su actividad, y los mecanismos de la inhibición. Por
ello en la presente práctica se realizó con el fin de elaborar la curva estándar de p-nitrofenol y
determinar los datos cinéticos, de la enzima fosfatasa alcalina. Obteniéndose una relación
directamente proporcional a la concentración del sustrato con respecto a la velocidad de la
reacción catalizada.
METODOLOGÍA Lineweaver y Burk en la cual se determina la
Se utilizó para estudiar el mecanismo de velocidad máxima y la constante de
reacción de la enzima, cinética enzimática. La Michaelis de la reacción (Nelson, 2015).
cinética enzimática consiste en la
determinación de la velocidad de la reacción RESULTADOS
y del modo en que ésta cambia en respuesta Gráfica 1. ​Curva de calibración de estándar
de p-nitrofenol/ NaOH a longitud de onda
a cambios en los parámetros experimentales.
405 nm*.
Con respecto a la práctica, se evaluó la
velocidad de reacción que presentó la
enzima al estar disuelta en soluciones que
únicamente variaba la concentración de
sustrato disuelto en ellas. Para conocer la
cantidad de producto obtenido se midieron
las absorbancias a través de
espectrofotómetro a una longitud de onda Fuente: Datos experimentales, obtenidos
de 405 nm y se determinó la concentración a directamente en el Laboratorio de
través de un análisis de regresión lineal Bioquímica, Edificio T-12, USAC. *nm=
bivariado. Se utilizó la ecuación de nanómetros. µg/ml= microgramos por
mililitro. R​2​= coeficiente de determinación.
En la gráfica 1 se observa una relación Gráfica 3. ​Cinética enzimática de fosfatasa
directamente proporcional determinada con alcalina.
un análisis de regresión lineal bivariado para
las absorbancias de soluciones estándar de
p-nitrofenol determinadas a una longitud de
onda de 405nm. También se observa la
ecuación de la recta que mejor describe el
comportamiento de los datos.

Gráfica 2. ​Absorbancia de soluciones de


p-nitrofenol de distinta concentración a Fuente: Datos experimentales, obtenidos
longitud de onda de 405 nm*. mediante cálculos en el Laboratorio de
Bioquímica, Edificio T-12, USAC.
µg/ml/h = microgramos de sustrato por
mililitro por hora.
[S]mM=concentración milimolar de sustrato
p-nitrofenilfosfato.

En la gráfica 3 se observa la relación entre la


velocidad de reacción y la concentración de
sustrato (p-nitrofenilfosfato) hidrolizado por
acción de la enzima fosfatasa alcalina de
Fuente: Datos experimentales, obtenidos suero humano.
directamente en el Laboratorio de
Gráfica 4. ​Transformación de Lineweaver y
Bioquímica, Edificio T-12, USAC.
Burk de actividad de la fosfatasa alcalina.
*nm= nanómetros.
µg/ml= microgramos por mililitro.

En la gráfica 2 se observa una relación


directamente proporcional determinada con
un análisis de regresión lineal bivariado para
las absorbancias de muestras de
p-nitrofenol, obtenido por la actividad
enzimática de la fosfatasa alcalina en suero
humano, determinadas a una longitud de Fuente: Datos experimentales, obtenidos
onda de 405nm. mediante cálculos en el Laboratorio de
Bioquímica, Edificio T-12, USAC.
1/V= inverso de velocidad de reacción.
1/[S]= inverso de concentración de sustrato
milimolar. Km= constante Michaelis de enzima
fosfatasa alcalina. Vmax= velocidad máxima.

En la gráfica 4 se observa la relación


exponencial de los dobles recíprocos de la
velocidad de reacción y la concentración de concentración de p-nitrofenilfosfato era
sustrato consumido por la acción de la mayor. Esto es porque la fosfatasa alcalina, al
enzima fosfatasa alcalina, empleados para la estar presente en una solución con mayor
determinación de la constante de Michaelis concentración de p-nitrofenilfosfato, provoca
de la enzima y la velocidad máxima de que se produzca con mayor velocidad el
acción. p-nitrofenol. Por esta razón, la muestra que
DISCUSIÓN DE RESULTADOS contenía mayor concentración de sustrato;
En la gráfica 1 se observa la relación lineal presentó mayor cantidad de p-nitrofenol, a
directamente proporcional entre la pesar que se les agregó la misma
absorbancia y las distintas concentraciones concentración de suero sanguíneo y de
de las soluciones estándar, debido a que NaOH (Nelson, 2015).
obedecen la ley de beer-lambert, la cual La absorbancia se midió a 405 nm, debido a
establece una absorbancia directamente que el p-nitrofenol, al estar en medio
proporcional a la concentración de la alcalino, toma un coloración amarilla y se
muestra y la longitud del recipiente que la puede cuantificar a dicha longitud de onda.
contiene (Levine, 2014). La ecuación de la Por esta razón, se le agregó a las distintas
recta es la representación matemática de la muestras de p-nitrofenol, un solución de
linealidad que presentan los datos, en donde NaOH (López, Urbano y Cárdenas, 2012).
la pendiente indica la absortividad del Por otro lado, en la gráfica 3 se encuentra
p-nitrofenol, que es de 0.137. La importancia graficada la relación entre la velocidad de
de establecer una ecuación matemática para reacción y la concentración de
soluciones de p-nitrofenol es que a partir de p-nitrofenilfosfato hidrolizado por su enzima
ella se pueden determinar concentraciones fosfatasa alcalina presente en el suero
desconocidas de soluciones, leyendo su humano. Es sabido que la velocidad de
absorbancia (y) a la longitud de onda de reacción entre una enzima y su sustrato se ve
máxima absorción del p-nitrofenol, la cual se afectada por diversos factores, entre los que
presenta a 405 nm (Gutiérrez, 2006). R​2 figura la concentración de sustrato. Esto se
indica que el 99.9% de los datos para hace evidente en la gráfica, en donde se
disoluciones diluidas de p-nitrofenol se observa que a valores mayores de sustrato la
pueden determinar con dicha ecuación . La velocidad de reacción aumenta gracias a que
concentración de las soluciones actúa como la enzima dispone de una mayor cantidad de
limitante del método debido a que solo se reactivo para catalizar la reacción,
establece una relación lineal cuando se recordando que la velocidad de reacción está
trabaja con sustancias muy diluidas para que dada por la concentración de producto de
su absorbancia no sea mayor a 1, de lo reacción producido cada hora, por lo que, a
contrario se perdería la linealidad de los mayor cantidad de sustrato disponible,
datos (Daniel & Cross, 2013; Sierra, Pérez, mayor cantidad de producto formado por la
Gómez y Morante, 2010; Walton y Reyes, catálisis de la enzima se obtendrá (Sadava,
2005). 2009).
En la gráfica 2 se observa la absorbancia En la gráfica 4 se observa la representación
presentada por las distintas muestras de de los inversos de los valores de
p-nitrofenol. Estas presentan un aumento en Michaelis-Menten, estos inversos son
la absorbancia a medida que la utilizados para la obtención del km que es la
concentración del sustrato cuando la Dean, R. (2002). Kinetic studies with alkaline
velocidad es la mitad de su velocidad phosphatase in the presence of
máxima, esta última se define como la absence of inhibitors and divalent
velocidad constante, de formación de cations. ​The American Biology
producto, por lo que un valor bajo de km, Teacher,​ 64(8), 540-547. doi:
representa mayor afinidad enzima-sustrato. https://doi.org/10.1662/0002-7685(
Se determinó que el Km de la fosfatasa 2002)064[0620:ILCTDY]2.0.CO;2
alcalina es de 1.49 mM y la Vmax es de 1.6 Gutiérrez, J. (2006). ​Fundamentos de ciencias
mM/h (Gráfica 4). El valor de KM obtenido básicas aplicadas a la odontología.
para la fosfatasa alcalina si coincide con el Colombia: Editorial Pontificia
valor de km descrito en la literatura, el cual Universidad Javeriana.
es de 1.5mM. Sin embargo, el valor obtenido Levine, I. (2014). ​Principios de fisicoquímica.
para la Vmax no coincide con la descrita en la México: McGraw-Hill.
literatura la cual es de 0.1. Esto indica una López, J., Urbano, A. y Cárdenas, M. (2012).
baja afinidad enzima-sustrato, y se podría Manual de laboratorio para el
deber a la baja pureza de la enzima utilizada estudio del semen. Bogotá:
(Dean, 2002). OmniaScience.
CONCLUSIONES Nelson, D. y Cox, M. (2015). ​Lehninger
- Se comprobó la utilidad de la Principios de Bioquímica.​ España:
ecuación de la recta para soluciones Omega.
de p-nitrofenol, obtenida por análisis Oñate, L. (2010). ​Biología. México: Cengage
de regresión lineal, para la Learning.
determinación de concentraciones Sadava, D. (2009). ​Vida. Argentina: Médica
desconocidas de algunas muestras. Panamericana.
- Se comprobó una relación Sierra, I., Pérez, D., Gómez, S. y Morante, S.
directamente proporcional a la (2010). ​Análisis Instrumental.
concentración del sustrato con España: Netbiblo.
respecto a la velocidad de la reacción Walton, H. y Reyes, F. (2005). ​Análisis
catalizada, ya que, a mayor químico e instrumental moderno.
concentración de p-nitrofenilfosfato; España: Reverté.
la velocidad de la fosfatasa alcalina ANEXOS
aumenta. Anexo 1. ​Cálculos para transformación
- Se determinó los valores de km y matemática de Lineweaver-Burk.
vmax experimentales de la enzima
fosfatasa alcalina son, 1.49 mM y la
Vmax es de 1.6 mM/h,
respectivamente.
REFERENCIAS Fuente: Fuente: Datos experimentales,
Berg, J. Tymoczko, J. Stryer, L. (2008). obtenidos mediante cálculos en el
Bioquímica.​ España: Reverté. Laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12,
Daniel, W. & Cross, C. (2013). ​Biostatistics: a USAC.
foundation for analysis in the health
sciences. ​USA: Wiley.