TEMA 4: ENSAYO ENZIMÁTICOS

DEFINICIÓN

Es una metodología experimental diseñada para medir la actividad enzimática

mediante el estudio de la formación de producto o desaparición de sustrato en el tiempo.

S +E -----> ES -----> P

Con los datos puede calcularse la actividad de la enzima (velocidad de reacción). Se

obtienen midiendo la formación de productos o desaparición de sustratos y para ello se
usan métodos analíticos (espectrofotométricos, fluorimétricos, luminométricos,
radiométricos, cromatográficos, espectrométricos o electroquímicos).

Un ensayo debe tener especificidad absoluta, una única actividad enzimática); alta
sensibilidad, extractos mezclados de compuestos y en baja cantidad; alta precisión, basado
en la detección; y que sea conveniente metodológicamente.

CLASIFICACIÓN

Los ensayos pueden ser de tipo continuo o discontinuo:

 Continuos: Se monitoriza la lectura de la actividad de formación de productos o

desaparición de sustratos en tiempo real.
 Discontinuos: Se produce una parada en la reacción enzimática a distintos tiempos
y se determinan las [S] o [P].

De este último tipo son los más usados en laboratorio y se realiza de diferentes maneras.
Para parar la reacción enzimática se eleva la temperatura, se añade alguna sustancia
desnaturalizante (tricloroacético), se cambia el pH drásticamente o se secuestran metales
cuando se trata de metaloenzimas.

Algunas de las ventajas del tipo de ensayo discontinuo es que se pueden detectar
productos con técnicas más sensibles (MS, cromatografía, RMN, radioactividad), es útil en
la detección de actividades enzimáticas muy bajas. Entre las desventajas destacamos que
es un método muy laborioso, requiere un equipamiento sofisticado y un personal
especializado.

Otro tipo de clasificación es mediante el estado estacionario o pre-estacionario en

el cual se emplean métodos clásicos para determinar la velocidad inicial del estado
estacionario (en los primeros minutos de la reacción). En pre-estacionario se produce en
fracciones de segundo.
 También podemos decir que un ensayo es directo cuando el sustrato o producto
pueden ser detectados en la mezcla de la reacción; e indirecto cuando ni uno ni otro son
detectables y por ello acoplamos una nueva reacción enzimática hasta que podamos
cuantificarlos. Esto podemos verlo en el siguiente ejemplo:

En este proceso acoplamos una reacción en la que la segunda de ellas ha de ser más
rápida ya que es la velocidad de la reacción la que se determina a través de la enzima más
lenta. La enzima o enzimas que acoplemos han de estar siempre en exceso respecto a la
que se quiere estudiar y además deben estar puras.

FACTORES QUE AFECTAN A UN ENSAYO

A un ensayo afectan aquellos factores básicos que sabemos que tienen efecto sobre
las enzimas por naturaleza o lo que puede ser interferente como el pH, temperatura, grado
de oxidación de la enzima, contaminación con proteasas, polaridad del medio o presencia
de sustancias interferentes.

En cuanto al pH, la actividad de la enzima depende de este, y se controla con

sustancias tamponadoras. El tampón debe tener un pKa adecuado y una fuerza tamponante
determinada a través de la modificación de la concentración de este tipo de sustancias. La
temperatura la controlamos a través de baños termostatizados o con dispositivos Peltier.

El grado de oxidación de la enzima hace referencia a cuando se ensayan las enzimas

estás son desprovistas de su ambiente natural. SI hay grandes moléculas es más probable
que la enzima precipite y para que esto no pase hemos de añadir antioxidantes o reductores
como el glutatión, la propia cisteína con sus grupos SH, DTT o ß-marcaptoetanol).
 Respecto a los metales pesados sabemos que los grupos SH pueden reaccionar con
iones como Pb, Fe, Cu, … (buffers, resinas de intercambio iónico, agua). Se elimina con
adición EDTA (agentes quelantes). La presencia de proteasas por su parte puede degradar
a las enzimas al ser liberadas al medio por ruptura celular o de tejidos y se neutralizan con
adición de inhibidores como PMSF o inhibidores irreversibles de Serín Proteasas.

Dependiendo del origen del enzima y de la su naturaleza pueden necesitarse en los

ensayos la adición de sustancias que disminuyan o aumenten la polaridad del medio. En
enzimas cuyo ambiente original es hidrofóbico se añadirá sacarosa, glicerol, DMSO o DMF.
En enzimas cuyo ambiente ha de ser polar, se añadirá una alta fuerza iónica con sustancias
como KCl, NaCl, NH4Cl o (NH4)SO4.

Cuando se usan extractos crudos es muy común tener sustancias interferentes en la

reacción (sustratos no deseados, presencia de otros enzimas, etc.) Esto se soluciona:
1) Corriendo ensayos en blanco (extracto sin sustrato). Con lo que podemos restar
toda actividad que se detecte al ser distinta a la de la enzima que se quiere
estudiar.
2) Diluyendo el extracto (hasta que las interferencias sean poco importantes)
3) Purificando la enzima parcialmente.

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA VS OTROS PARÁMETROS

Escogeremos si queremos estudiar en la curva de reacción la cantidad de sustrato

que queda o la cantidad de producto formado.
Efecto de la concentración de enzima

A mayor número de centros activos, mayor será la velocidad a través de la expresión

v = Kcat · ET. La Kcat o número de recambio informa sobre el número de reacciones que se
producen por unidad de tiempo en cada centro activo.

Efecto de la concentración de sustrato

Las gráficas de concentración de sustrato frente a la velocidad nos sirven tanto para
determinar la Km como para determinar la Vmáx construyendo esta a través de métodos
analíticos. La gráfica que representa una sigmoide se corresponde con una enzima
alostérica.

EXPRESIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La actividad enzimática puede ser absoluta y específica; además puede con ella
puede medirse la velocidad de reacción y la concentración de la enzima. La unidad de
actividad enzimática en el SI es el katal (muy grande), que se corresponde con la
equivalencia de que 1 mol de sustrato convertido en un segundo es lo mismo que 1 katal.
La unidad de la actividad enzimática común es el UI o cantidad de enzima que cataliza la
conversión de 1 µmol de sustrato por unidad de tiempo.

AEE=AEA/mg de proteína 1UI=16,67 nKat 1kat=6·107 UI

PROCEDIMIENTOS AUTOMÁTICOS

Si el número de muestras es muy alto, la determinación de la actividad enzimática

puede automatizarse. Una unidad de 2-4 personas realiza una media de 500
determinaciones enzimáticas a la semana; sin embargo, con un robot se hacen de media
50.000 determinaciones enzimáticas a la semana y se suelen hacer en volúmenes mucho
más pequeños y en un mayor número de placas.

DETECCIÓN DE ACTIVIDADES EN MEDIO GEL Y PLACAS

Se emplean zimogramas que sirven para la detección de actividades de proteasas.

Se incluye en la solución de gel la sustancia de gelatina caseína para enturbiar un poco dicho
medio. Se realiza una electroforesis a 4˚C en gel nativo para así disminuir la actividad de las
proteasas para que no degraden la caseína. Aparece tras la migración un halo de
aclaramiento al aumentar la temperatura del gel y reanudar por tanto la actividad de las
proteasas a 37˚C.

También se pueden medir actividades enzimáticas de proteasas en medio gel con

placas, si ponemos en un medio de cultivo una proteína como la caseína que podamos
encontrarla en exceso para enturbiar el gel. Al haber esta proteína podremos observar
también halos de aclaramiento en el medio de cultivo que no indicaran la presencia de
actividad de proteasas en bacterias.

De igual modo, la actividad de lipasas se mide en medio gel con placas haciendo que
por hidrólisis de lípidos se produzcan ácidos grasos libres. Estos ácidos grasos reaccionan
con rodamina dando lugar a compuestos fluorescentes que a luz UV podrán ser observados
en la placa si las bacterias son productores de este tipo de enzimas lipasas.