Caracterización de fosfatasa alcalina

de intestino de ternera
Braulio Coronado e Ignacio Martínez

Resumen :

Introducción:

Las enzimas son proteínas que cumplen un

rol fundamental para la existencia de la vida
misma, ya que permiten que procesos
necesarios para la vida como, por ejemplo, la
transducción de señales, contracción
muscular y transporte activo se lleven a cabo
a una velocidad mayor de lo que se
producirían sin estás. Velocidades más bajas
de estos procesos no permitirían el
funcionamiento celular.

El fósforo es un mineral esencial utilizado por

todos los seres vivos para el crecimiento y el
transporte de energía (1). Está involucrado
en muchos procesos biológicos tales como la
fotosíntesis y la síntesis de ácidos nucleicos
(2) y (3). Las fosfatasas son enzimas
importantes ya que permiten hidrolizar
moléculas con fosfato que sirven como
fuente de fósforo para las plantas o
microorganismos, al ser liberados al suelo (4)
y (5). Este estudio se enfocó en las
fosfatasas alcalinas (EC 3.1.3.1),
particularmente en la fosfatasa alcalina de
intestino de ternera. La estructura y
mecanismo de este tipo de enzimas está
ampliamente estudiado y definido (6), pero se
necesitan muchos estudios cinéticos
producto de la gran variedad de sustrato que
puede hidrolizar esta enzima, como por
ejemplo GMP, fructosa-6-fosfato, p-
nitrofenilfosfato y en general moléculas que
contengan una molécula de fosfato.

En este estudio cinético se utilizó como

sustrato Glicerol-2-fosfato, el cual da como
productos glicerol más fosfato de sodio (7).
La cinética de la fosfatasa alcalina con este
sustrato no está muy estudiada, por lo que la
importancia de este estudio radica en esto,
en generar conocimiento sobre los
parámetros cinéticos de esta reacción.
El vasto conocimiento de técnicas de
laboratorio nos permite descubrir varios
parámetros cinéticos, como por ejemplo la
constante de Michaleis-Menten, la velocidad
de reacción, el pH óptimo, el efecto de un
inhibidor, entro otros. Todo esto utilizando
métodos que son económicos y fáciles de
llevar a cabo, como lo es medir la
concentración de producto, que en este caso
fue fosfato.
2. Materiales y métodos
2.1 Materiales.
Fosfatasa alcalina fue preparada desde
intestino de ternera. En todos los
experimentos se utilizó un Buffer de
Glicina/NaOH 0,1 M pH 9,4 NaCl 1% (p/v),
Beta glicerofosfato de sodio 6 mM como
sustrato, Molibdato de amonio al 2,5% en
H2SO4 5N para detener la reacción y Acido
1,2,4 amino naftol sulfónico como solución
reductora, la cual nos permitió medir las
absorbancias producto de la coloración que
otorgaba a las muestras. Para medir las
absorbancias se utilizó un espectrofotómetro.
2.2 Cuantificación de proteínas y
determinación de la actividad enzimática
de fosfatasa alcalina.
Para la cuantificación de proteínas utilizamos
el método de Bradford (1), el cual se basa en
la unión del colorante coomassie blue G250 a
las proteínas. Realizamos una curva de
calibración (fig.1.) con una solución estándar
de albumina de suero bovino 100 µg/mL
preparando 6 muestras diluidas para obtener
distintas concentraciones de proteínas en un
rango de 1 a 20 µg/mL. Luego preparamos
tres muestras de enzimas de
concentraciones distintas y desconocidas a
las cuales medimos sus absorbancias a 595
nm e interpolamos en la curva de calibración
para conocer sus concentraciones.
Para determinar la actividad enzimática
utilizamos el método de Fiske y Subbarow
(2), el cual se basa en la formación de
fosfomolibdato de amonio para luego dar
lugar al azul de molibdeno al agregar la
solución reductora, a este compuesto se le
puede medir la absorbancia a 620nm. El
fosfomolibdato de amonio se formó al
agregar molibdato de amonio al fosfato
(producto de la reacción enzimática) esto
además, detuvo la formación de fosfato, lo
que nos permitió medir la actividad de la
enzima a un tiempo determinado, que en
este caso fue de 10 min. Finalmente
comparamos la muestra con una solución
patrón de fosfato de sodio 1µmol/mL de
concentración conocida, para poder estimar
su concentración. Esto lo realizamos en 2
muestras y calculamos la media.
2.3 Determinación de la curva de
progreso.
La curva de progreso nos permitió calcular la
velocidad inicial de la enzima, para esto
medimos la concentración de producto cada
5 minutos durante un intervalo de una hora.
Para esto preparamos un tubo de incubación
el cual tenía tampón glicina, sustrato y agua
destilada, esto se incubo a 37ºC por 5
minutos para que al agregar la enzima esta
estuviera en condiciones favorables desde el
tiempo cero, posteriormente se agregó la
enzima y se dejó incubando por 1 hora. En
paralelo se prepararon 15 tubos con
molibdato de amonio, 13 de ellos se utilizaron
para medir la concentración de producto
desde el tubo de incubación, otro para
preparar el patrón fosfato y otro para el
blanco. Para calcular sus concentraciones se
midieron sus absorbancias y luego se
compararon con la del patrón. Para finalizar
se corrigió la concentración debido al error en
la muestra tiempo cero, restando la
concentración obtenida en este tiempo a
todas las demás. Calculamos la velocidad
inicial a partir de la pendiente, obtenida por la
curva de progreso, entre los 0 y 10 min.
2.4 Curva de saturación y determinación
de Km y Vmax de fosfatasa alcalina.
Para realizar la curva de saturación
mantuvimos contantes los valores de pH
(9,4), el tiempo de incubación (10 min) y la
concentración de la enzima, cambiando la
concentración de sustrato en 8 tubos en un
rango de 0,1 a 1 mM. Estos se incubaron a
37ºC para luego agregarles molibdato de
amonio y medir su absorbancia a 620nm,
luego empleamos la lectura del patrón
obtenida en la curva de progreso para
calcular los micromoles de producto en cada
tubo, para luego dividir estos valores por 10
para obtener las velocidades iniciales. Con
estos datos creamos una curva de saturación
y estimamos la Vmax y Km. Finalmente
realizamos un grafico de dobles recíprocos
(Lineweaver-Burk) y para obtener un valor
exacto de Vmax y Km trabajamos con la
ecuación de Michaelis-Menten y con la
ecuación de la recta obtenida en este grafico.
2.5 Efecto de la concentración de enzima
y del pH en la actividad enzimática de
fosfatasa alcalina.
Para demostrar el efecto de la concentración
de enzima mantuvimos un exceso de la
concentración de sustrato y a la vez
mantenemos constante el pH, temperatura y
fuerza iónica. Preparamos 6 tubos con
tampón glicina, sustrato, agua destilada para
luego agregar la enzima en un rango de
concentraciones de fosfatasa alcalina entre
0,01 mg/mL y 0,06 mg/mL en intervalos de
0,01 mg /mL. Incubamos a 37ºC durante 10
minutos y luego detuvimos la reacción con
molibdato de amonio. Finalmente agregamos
solución reductora para medir su absorbancia
y calculamos la concentración de fosfato
usando nuestra muestra patrón.
Para demostrar el efecto del pH mantuvimos
constantes los factores de tiempo de
incubación, concentración de sustrato,
concentración de enzima y temperatura.
Preparamos 8 tubos con un rango de pH 5 a
11, luego realizamos los mismos pasos que
en el experimento anterior.
2.6 Efecto de un inhibidor en la actividad
enzimática de la fosfatasa alcalina.
Medimos el efecto del inhibidor citrato de
sodio 0,01M usando una curva de saturación.
Mantuvimos contantes los valores de pH
(9,4), el tiempo de incubación (10 min) y la
concentración de la enzima, cambiando la
concentración de sustrato en 8 tubos en un
rango de 0,1 a 1 mM. Estos se incubaron a
37ºC para luego agregarles molibdato de
amonio y medir su absorbancia a 620nm,
luego empleamos la lectura del patrón
obtenida en la curva de progreso para
calcular los micromoles de producto en cada
tubo, para luego dividir estos valores por 10
para obtener las velocidades iniciales. Con
estos datos creamos una curva de saturación
y estimamos la Vmax y Km. Finalmente
realizamos un grafico de dobles recíprocos
(Lineweaver-Burk) y para obtener un valor
exacto de Vmax y Km trabajamos con la
ecuación de Michaelis-Menten y con la
ecuación de la recta obtenida en este grafico.
Posteriormente comparamos la actividad de
la enzima vs la concentración de inhibidor,
para ello obtuvimos datos de otro grupo, el
cual hizo el mismo experimento, pero con
citrato de sodio 0,02M
3. Resultados.

3.1. Cuantificación de proteínas y

determinación de la actividad enzimática
de fosfatasa alcalina. Al interpolar las 0.5
absorbancias de las muestras de fosfatasa 0.4

Absorbamcia
alcalina en la curva de calibración (fig.1.)
obtuvimos concentraciones de 3,65 µg/mL, 0.3
10,35 µg/mL y 12,15 µg/mL. Para la actividad 0.2
enzimática obtuvimos en promedio una
concentración de 0,75 µmol/mL de fosfato a 0.1
los 10 min de incubación. 0
0 5 10 15 20 25

Concentración (µg/mL)

Tabla 1 Comparación entre volumen extraído

y concentración de enzima.
0.5

Concentración
(µmol/mL)
Volumen de Concentración de 0.4
enzima extraído enzima
0.3
0.050 mL 3.65 µg/mL
0.2
0.100 mL 10.35 µg/mL
0.150 mL 12.15 µg/mL 0.1
0
Fig.1. Curva de calibración con albumina de 0 5 10 15
suero bovino. Y=0,020x +0,041 En rombos Tiempo (min)
albumina de suero bovino y en cuadrados
fosfatasa alcalina Fig.3. Curva de progreso en los primeros 10 minutos de la
reacción. Ecuación de la recta: Y =0,043x + 0,009

3.3 Curva de saturación y determinación

3.2 Determinación de la curva de progreso. de Km y Vmax de fosfatasa alcalina.
La velocidad inicial de la fosfatasa alcalina es
de 0,043 [µmol/mL]/min], este valor es la Los valores de Vmax y Km estimados a partir
pendiente de la fig.3. de la curva de saturación fueron de 0,0859
(µmol/mL)/min y 0,21 µmol/
respectivamente.
2
1.5
[HPO4] (µmol/mL)

1
0.5
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (min)
Fig.2. Curva de progreso para fosfatasa alcalina en
intervalos de 5 minutos hasta llegar a los 60 min.
 0.07
0.1
0.06
Vi [(µmol/mL)/min]

[Enzima](mg/mL)
0.08 0.05
0.06 0.04
0.03
0.04
0.02
0.02 0.01
0 0
0 0.10.20.30.40.50.60.70.80.9 1 1.1 0 0.1 0.2 0.3
[S] mM Vi [(µmol/mL)/min]
Fig. 4. Curva de saturación de la fosfatasa Fig. 6. Efecto de la concentración de la
alcalina. Ecuación de la recta Y = 1,000x + enzima, fosfatasa alcalina, en la
7,564. actividad enzimática.
1.4
Los valores de Vmax y Km calculados a partir

[HPO4] [µmol · mLˉ¹)

del grafico de dobles recíprocos (Lineweaver- 1.2
Burk) de la figura 5 fueron 0,132 1
(µmol/mL)/min y 0,132 µmol/mL 0.8
respectivamente. 0.6
0.4
0.2
20 0
1/V ( 1 · min · µmol ˉ¹)

4 5 6 7 8 9 10 11 12
15
pH
10

5 Fig. 7. pH vs concentración final del

producto fosfato transcurridos 10 minutos
0 de incubación a 37ºC.
-10 -5 0 5 10 15
-5
3.5 Efecto de un inhibidor en la actividad
1/[S] (1 · mmolˉ¹) enzimática de la fosfatasa alcalina. En la
figura 8 vemos un gráfico de dobles
Fig. 5. Gráfico de dobles recíprocos recíprocos a partir del cual calculamos los
valores de Km y V máxima de la enzima en
(Lineweaver-Burk) de la fosfatasa alcalina.
presencia de un inhibidor, los cuales fueron
0,132 µmol/mL y 0,104(µmol/mL)/min.
3.4 Efecto de la concentración de enzima y
del pH en la actividad enzimática de
fosfatasa alcalina. La concentración de
producto fosfato aumenta directamente
proporcional a la concentración de enzima
(Fig.6.) Mientras en nuestro gráfico de pH vs
actividad (Fig. 7) podemos observar una
forma de campana de Gauss en donde el pH
óptimo es de 9,6.
 25 4.3 Curva de saturación y determinación
de Km y Vmax de fosfatasa alcalina.
1/V ( mL · min · µmol ˉ¹) 20
En la curva de saturación (fig. 4) no
observamos una asíntota que nos permita
15
concluir claramente que se haya saturado la
enzima, es sugerible realizar más mediciones
10 en un tiempo más prolongado que nos
permita asegurar en los últimos puntos de la
5 curva que la velocidad no seguirá
aumentando.
0
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 4.4 Efecto de la concentración de enzima y
1/[S] (mL · μmolˉ¹) del pH en la actividad enzimática de
fosfatasa alcalina
Fig. 8. Gráfico de dobles recíprocos (Lineweaver-Burk).
Podemos observar a partir de la fig.6 que en
Los cuadrados representan a la enzima sin inhibidor,
mientras que los rombos a la enzima con inhibidor. En condiciones favorables de sustrato la
la intersección de las líneas de tendencia con el eje de velocidad de reacción es directamente
las abscisas está el valor -1/Km, en la intersección de proporcional a la concentración de enzima.
las líneas de tendencia con el eje de las ordenadas
está el valor 1/Vmáx y la pendiente de cada línea Del efecto del pH en la actividad de fosfatasa
corresponde al valor Km/Vmáx. alcalina: obtuvimos un valor máximo de
actividad en un pH similar al que la literatura
describe como óptimo.(8) y (9).

4.5 Efecto de un inhibidor en la actividad

enzimática de la fosfatasa alcalina.

Vemos en la fig. 8 como cambia el valor de la

velocidad máxima de reacción y que los
valores de Km de fosfatasa alcalina con y sin
presencia de citrato de sodio como inhibidor
son iguales, lo que nos indica que éste es un
Fig.9. Gráfico del efecto de la concentración de inhibidor no competitivo. De la fig. 9 podemos
inhibidor en la actividad enzimática. Barras blancas observar que a mayor concentración de
0,01mM Citrato de Sodio y Barras negras 0,02mM
4. Discusión. inhibidor la actividad enzimática disminuye.
Citrato de Sodio
4. Discusión:

4.1 Cuantificación de proteínas y

determinación de la actividad enzimática
de fosfatasa alcalina.

Los valores de concentración de enzima en

razón con los volúmenes de enzima extraídos
no fueron del todo lineales.

4.2 Determinación de la curva de progreso.

En la curva de progreso obtuvimos un

resultado esperado, en donde la velocidad de
reacción va disminuyendo gradualmente a
medida que la enzima se satura, hasta llegar
a una meseta en donde la velocidad se
mantiene constante.
 Bibliografía:

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