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PRCTICA: ACTIVIDAD ENZIMTICA TIROSINASA

Universidad de Antioquia; Facultad de Qumica


Farmacutica;
Laboratorio de Bioqumica; Medelln/ Antioquia; 2015
Yeraldin Fernndez Anaya - Yessica Natalia Pea Prez
RESUMEN: En esta prctica se logr determinar la actividad enzimtica de la tirosinasa y la influencia de factores
fisicoqumicos como la temperatura, la concentracin y PH, este procedimiento se llev a cabo mediante la utilizacin
de un extracto de banano como fuente de la enzima, un sustrato L- Metil Dopa, y un blanco de reaccin. El
espectrofotmetro se calibro a 420 nm, primero se configuro el blanco y luego se adiciono a cada celda la mezcla del
preparado procediendo a obtener las lecturas de las absorbancias cada 20 segundos por tres minutos, tomando
datos por triplicado.
PALABRAS CLAVES: espectrofotmetro, Tirosinasa, factores fisicoqumicos, actividad enzimtica, L Metil Dopa,
1. PROCEDIMIENTO:
Para prepara el extracto de banano tomamos
primeramente 10 g de la fruta, lo maceramos en un
mortero, le agregamos 10 ml de buffer a PH 7.2, para
terminar el proceso se filtr para no dejar residuos en la
muestra. Este procedimiento se repite con las mismas
condiciones. Luego centrifugamos durante 10 minutos a
3500 RPM extrayendo el sobrenadante para diluir la
solucin 2/20 con la buffer PH 7.2, es decir 2 ml del
extracto, 18 ml de buffer.
Posteriormente se mide la influencia de la
concentracin de la enzima sobre la actividad enzimtica;
se tom 1 ml de L metildopa, 2ml de buffer y de extracto
fue: 1 ml, 1.5 ml, 2 ml, 2.5 ml un volumen de extracto
para cada grupo; usamos el espectrofotmetro y despus
de calibrar la primera absorbancia como tiempo cero se
registraron las absorbancias cada 20 segundos hasta
llegar a 180 segundos por cada volumen, mediante este
procedimiento este procedimiento observamos el cambio
de la velocidad de la reaccin.

Para determinar la influencia del pH sobre la actividad


enzimtica se agreg en un tubo de ensayo 1 ml de
extracto, 3 ml de buffer pH 6 y 1 ml de L-metildopa,
realizando
el
procedimiento
anterior
en
el
espectrofotmetro. Este se repiti con un cambio pH en
las soluciones buffer de 7.2 y 10.4. (Datos obtenidos de
los compaeros de laboratorio)
Posteriormente para observar la influencia de la
temperatura en la actividad enzimtica se realiz el
mismo procedimiento pero a 38C y 4C., tambin se tuvo
en cuenta los datos tomados en la primera lectura ya que
se hizo a Temperatura ambiente.

2. DATOS.
Al obtener el resultado de las absorbancias se realizan grficos
de absorbancia vs tiempo (s) correspondiente a cada uno de
los parmetros y sus variaciones.

Los datos presentados en las tablas son ya los promedios de


los datos obtenidos.

TABLA 1: resultados de la absorbancia a diferentes


concentraciones.
Tiempo - ml de extracto y absorbancia
promedio
(s)
1 ml
1.5
2 ml
2.5
ml
ml
0
0.06
0.142
0.115
0.090
8
20
0.08
0.167
0.134
0.107
5
40
0.1
0.181
0.152
0.12
60
0.11
0.196
0.169
0.139
4
80
0.12
0.209
0.189
0.155
8
100
0.14
0.227
0.203
0.170
1
120
0.15
0.239
0.219
0.186
5
140
0.16
0.251
0.237
0.201
8
160
0.18
0.263
0.266
0.218
1
180
0.19
0.276
0.269
0.231
3

Figura 1. Absorbancia vs. Tiempo. Diferentes


Concentraciones.

absorbancia 11
GRAFICO
0.3

Linear (absorbancia 1)

0.25

f(x)
f(x) =
= 0x
0x +
+ 0.15
0.12
Absorbancia
1.5
R
=
0.99
R = 0.99

0.25

0.2

f(x) = 0x + 0.09
RLinear
= 1 (Absorbancia 1.5)
f(x) = 0x + 0.07
R = 1
Linear (Absorbancia 1.5)

0.2

Absorbancia 0.15
0.1

Absorbancia Ph

0.1
0.05
0

Linear (Absobancia 2.5)


0

f(x) = 0x + 0.07
R = 1

0.15

Absobancia 2.5

0.05
0

GRAFICO 2

f(x) =
= 0x
0x +
+ 0.02
0.03
f(x)
R =
=1
0.99
R
0

Tiempo

Absorbancia 2
20 40 60 80 100120140160180200

Tiempo 2)
Linear (Absorbancia

50 100 150 200

Ph 6
Linear (Ph 6)
ph 7.2
Linear (ph 7.2)
ph 10.4
Linear (ph 10.4)

Taba 2. Resultado de la medicin de absorbancia a


Diferentes PH.
ABSORBANCIA
TIEMPO
6
(S)
0
0.023
20
0.026
40
0.029
60
0.032
80
0.035
100
0.037
120
0.040
140
0.042
160
0.045
180
0.047

7.2
0.068
0.085
0.1
0.114
0.128
0.141
0.155
0.168
0.181
0.193

PH
10.4
0.027
0.031
0.034
0.034
0.038
0.041
0.044
0.046
0.049
0.052

Figura 2. Absorbancia vs. Tiempo (s) para diferentes


valores de pH

Tabla 3: Resultados de la medicin de absorbancia


con diferentes Temperaturas
TIEMPO
ABSORBANCIA
TEMPERATURA
(S)
4 C
T Amb
38c
0
0.038
0.068
0.054
20
0.040
0.085
0.054
40
0.043
0.1
0.061
60
0.045
0.114
0.063
80
0.048
0.128
0.065
100
0.051
0.141
0.068
120
0.053
0.155
0.070
140
0.055
0.168
0.072
160
0.056
0.181
0.075
180
0.057
0.193
0.077

Figura 3.Absorbancia vs. Tiempo (s) para diferentes


valores de temperatura

GRAFICO 3
0.3
0.2

Absorbancia T

0.1
0

f(x) = 0x + 0.07
R = 1
f(x)
f(x) =
= 0x
0x +
+ 0.05
0.04
R
=
0.99
R
=
0.98
0
50 100 150 200

Tiempo
4 C
Linear (4 C)
T amb
Linear (T amb)
38 C
Linear (38 C)

La pendiente mayor que me indica cual es la


que tiene mejor actividad enzimtica es la de el
volumen de 2 ml.

3. ANLISIS DE RESULTADOS
A partir de los resultados obtenidos se realizaron
Diferentes grficos, donde se evidencia como Vara la
actividad enzimtica de la tirosinasa,
Comparando las pendientes para hallar la que tiene la
mejor actividad enzimtica, llegamos a que la de mayor
pendiente son los datos y por ende la grfica del efecto
del volumen de la enzima en actividad enzimtica, y ms
precisamente la de 2 mL. Esto se puede deber a que en
este volumen hay una concentracin ms alta de la
actividad enzimtica y esto nos lleva los resultados
obtenidos, tambin podemos apreciar que en estos datos,
el de mayor valor de R es el de 2.5 ml.
En la figura 2 vemos como la absorbancia de la LDopacromo que es el producto de reaccin Entre la
tirosina y la L-Metildopa tiende a un Comportamiento
lineal, la reaccin muestra Mayor absorbancia a PH acido
(7.2
-10.4),
un
Comportamiento
decreciente
respectivamente.
En el momento de tomar la primera absorbancia
como ya se ha juntado la enzima con el sustrato ya hay
producto formado queriendo decir que en el tiempo cero,
la reaccin ya ha avanzado. Por lo tanto las
observaciones que podemos realizar de las grficas es la
cantidad de producto que se ha formado a determinado
tiempo de reaccin.
Por lo anterior podemos decir que la cintica de reaccin
depende del medio donde se encuentre la enzima; a pH
alcalinos habr un cambio conformacional en la
estructura nativa de la protena modificando su carga
elctrica al aceptar o donar protones, lo que modificar la

estructura de los aminocidos y por tanto la actividad


enzimtica.
Tericamente la concentracin de la enzima aumenta
proporcionalmente
la
actividad
enzimtica
para
concentraciones constantes de sustrato, es decir, La
velocidad inicial se duplica al duplicar la concentracin de
enzima. Como la concentracin de sustrato es la misma,
la concentracin final de producto al alcanzar el equilibrio
ser la misma para todos los casos. Sin embargo, el
equilibrio ser alcanzado ms lentamente cuanto menor
sea la cantidad de enzima.
En cuanto a la temperatura, esta aumenta la Velocidad de
la reaccin qumica, del mismo Modo la actividad
enzimtica aumenta con el Incremento de la temperatura.
Sin embargo llegando a una determinada Temperatura
pueden aparecer los fenmenos De desnaturalizacin de
una enzima como es el Caso de la T a 4c la grfica
denota una inhibicin. Experimentalmente algunos
trabajos han reportado que
los cambios fsicos
comnmente utilizados
para una inhibicin son la
reduccin de la temperatura, el oxgeno, el uso de
atmsferas modificadas o agentes quelantes que pueden
unirse coordinadamente a los centros activos de cobre
que tiene la enzima.
La temperatura crtica es caracterstica de cada enzima y
oscila generalmente entre 50 y 60C. por lo tanto la
velocidad mxima de las reacciones catalizadas
enzimticamente se consiguen muy por debajo de la
temperatura critica de la enzima.
Estudios recientes demuestran que en el banano (Musa
cavendishii), la temperatura ptima para evaluar su
actividad es de 30C a un pH de 7.0,
En nuestro caso podemos ver que esto no se
Cumple del todo, ya que temperaturas por debajo 4c la
grfica nos modela una recta donde la
Absorbancia es prcticamente constante en
En el tiempo, lo que interpretamos como una inactivacin
de la enzima o bloqueo de sus
Funciones cataltica impidiendo que se una
Al sustrato. La pequea magnitud de la pendiente
Nos permite afirmar que su actividad enzimtica
Est muy limitada, aunque la pendiente en la curva que
nos muestra un comportamiento de > 38C
Vemos que es mucho mayor que la de 4C pero Estn
relativamente cercanas entre s, razn por La que
asumimos
que
temperaturas
extremas
Afectan
conformacional mente la enzima Disminuyendo o
inhibiendo la velocidad de Reaccin.

4. CONCLUSIN
Experimentalmente no podemos determinar cules seran
los valores ptimos para estos parmetros, ya que los
resultados no coinciden con los reportes tericos, esto se
puede deber a que experimentalmente se tienen mltiples
errores asociados al tiempo en que cada equipo de
trabajo se tom en medir las primeras concentraciones de
producto.
El error experimental se ve fuertemente asociado debido
a que los datos fueron tomados por diferentes personas,
en espectrofotmetros diferentes, sumado a ello las
interferencias del equipo como partculas o suciedades en
las celdas.
Vemos que la actividad enzimtica de la tirosinasa se ve
afectada por los diferentes parmetros: la cantidad de
enzima, pH y temperatura.
Valores de temperatura muy bajos
o condiciones
extremas al medio ambiente afectan la conformacin y/o
afinidad de la enzima por el sustrato.

Se determin que el de mayor actividad enzimtica es el


del volumen de 2 ml, porque su pendiente es la mayor de
todas igual a 0,0009.

5. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
1.
Cintica
enzimtica.
Available
from:
http://www.agro.unlpam.edu.ar/catedras-pdf/04Cineticaenzimatica.pdf
2.
Daz Portillo, Mara Teresa Fernndez del Barrio
FP salido. Aspectos Bsicos de Bioqumica Clnica
[Internet].
Available
Fromm:
http://books.google.com.co/books?
id=Y1Qm0nRmAtsC&pg=PA99&dq=actividad+enzimatica
+factores+que+influyen&hl=es&sa=X&ei=Ht12UbKlPIec8

gT3koHQCw&ved=0CDgQ6AEwAg#v=onepage&q=activi
dad enzimtica factores que influyen=false
3. Bifsicos S, Con A, cido IY. No TitleINHIBICION DE
LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA POLI FENOL
OXIDASA EXTRADA DEL BANANO (Cavendish valery)
MEDIANTE SISTEMAS BIFSICOS ACUOSOS CON
ISOESPINTANOL Y CIDO ASCRBICO [Internet].
Universidad Nacional; 2009. p. 191. Available from:
http://www.bdigital.unal.edu.co/1820/1/98380674.2009.pdf

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