Laboratorio de Bioqumica Resumen

Se realiz el anlisis de la dependencia de la velocidad de reaccin en funcin de la cantidad enzimtica (composicin), de la temperatura y del pH. As mismo se analiz la especificidad de la accin enzimtica, empleando la presencia de ureasa en la harina de soya y contrastar su accin en la tiourea y la acetamida. Los resultados obtenidos demostraron que la velocidad enzimtica se ve influenciada por la cantidad de enzima presente en solucin. La grfica que se produce como consecuencia de la aparicin de eritrodextrinas del almidn genera una recta de pendiente positiva, lo cual permite pensar que a medida que la concentracin de la enzima es mayor el tiempo que se necesita para transformar el sustrato en producto es mucho menor (al graficar 1/t vs concentracin). Estos ltimos resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores biolgicos de una reaccin. As mismo se demostr que la temperatura tiene un efecto importante en la velocidad enzimtica. Si la temperatura aumenta considerablemente la reaccin puede no producirse debido a la desnaturalizacin de la enzima. Si la temperatura es alta y propicia se obtienen los productos de la accin enzimtica sobre el sustrato. Siendo 38C la temperatura optima para la accin enzimtica de la ptialina. De igual forma se pudo observar que la reaccin enzimtica tambin se ve influenciada por el cambio del pH del medio hasta alcanzar un pH ptimo, el cual para la ptialina est alrededor de 6.7-6.8 cerca del pH neutro. Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima ptialina as como muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actan en pH neutro. Este resultado puede ser ubicado en la punta de la campana. Finalmente se pudo comprobar la especificidad enzimtica de la ureasa sobre la urea, en la descomposicin de la urea en amoniaco y dixido de carbono.

1 Practica N 8 Cintica enzimtica

Laboratorio de Bioqumica Introduccin

Los enzimas son macromolculas, especficamente protenas, que tienen la propiedad de catalizar las reacciones bioqumicas. Pero las condiciones en las cuales se realice dicha catlisis afectarn la eficiencia de la reaccin por lo tanto estas se deben de controlar en todo momento. Por ejemplo son muy importantes los factores como la concentracin del enzima, la temperatura y el pH. Por ejemplo si la temperatura es muy elevada, el enzima se desnaturaliza y queda inactiva; si la temperatura es muy baja, el enzima no se desnaturaliza, pero igual queda inactiva. Mientras que valores de pH extremos pueden desnaturalizar a los enzimas. Los enzimas, tambin se caracterizan por tener un alto grados de especificidad, es decir slo actan para un solo tipo de sustrato. Esto puede deberse a la relacin estereoqumica entre el sustrato y el enzima, as como tambin al tipo de grupos funcionales que del sustrato. Por ejemplo la ureasa contenida en la harina de soya slo acta sobre la urea descomponindola en amoniaco y dixido de carbono. Pero este enzima no acta sobre la tiourea o acetamida a pesar de tener una estructura muy parecida.

H2N O H2N

H2O

ureasa

NH3

CO 2

2 Practica N 8 Cintica enzimtica

Laboratorio de Bioqumica Marco terico Cintica enzimtica La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas. Las enzimas son protenas (macromolculas) con la capacidad de manipular otras molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la ADN polimerasa, que es capaz de incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato. Fundamentos La reaccin catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y producto. Sin embargo, al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia.

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Laboratorio de Bioqumica Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en saturarse con un sustrato en particular y la mxima velocidad de reaccin que pueda alcanzar. El conocimiento de estas propiedades hace posible hipotetizar acerca del comportamiento de una enzima en el ambiente celular y predecir cmo responder frente a un cambio de esas condiciones.

La velocidad de la reaccin va aumentando a medida que aumenta la concentracin de sustrato hasta que la enzima se satura. (Imagen. Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. 1999) Ensayos enzimticos Un ensayo enzimtico es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante el cual se puede medir la velocidad de una reaccin enzimtica. Como las enzimas no se consumen en la reaccin que catalizan, los ensayos enzimticos suelen medir los cambios experimentados bien en la concentracin de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentracin de producto (que va aumentando). Existen diversos mtodos para realizar estas medidas. La espectrofotometra permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (segn la concentracin de estos) y la radiometra implica incorporacin o liberacin de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotomtricos son los ms utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reaccin de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiomtricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimtica. Tambin se puede utilizar la espectrometra de masas para detectar la incorporacin o liberacin de istopos estables cuando el sustrato es convertido en producto.

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Laboratorio de Bioqumica Los ensayos enzimticos ms sensibles utilizan lseres dirigidos a travs de un microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reaccin. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de catlisis o bien unir molculas fluorescentes en lugares especficos de la enzima, que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catlisis. Estos estudios estn dando una nueva visin de la cintica y la dinmica de las molculas individuales, en oposicin a los estudios de cintica enzimtica tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una poblacin de millones de molculas de enzima. En la figura de la derecha se puede observar la tpica evolucin de una curva obtenida en un ensayo enzimtico. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo lineal. A medida que avanza la reaccin, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reaccin), lo que se manifiesta en forma de curva asinttica en la grfica. Dependiendo de las Curva de saturacin de una reaccin enzimtica. La pendiente representa, en el perodo inicial, la velocidad de la reaccin. La ecuacin de Michaelis-Menten describe cmo va variando la pendiente con la concentracin de sustrato o de enzima. (Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. 1999) un comportamiento

condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el perodo inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. Los ensayos enzimticos suelen estar estandarizados para que el perodo inicial dure en torno a un minuto, para llevar a cabo las medidas ms fcilmente. Sin embargo, los modernos equipos de mezcla rpida de lquidos permiten llevar a cabo medidas cinticas de perodos iniciales cuya duracin puede llegar a ser inferior a un segundo.

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Laboratorio de Bioqumica La mayora de los estudios de cintica enzimtica se centran en el perodo inicial, es decir, en la zona lineal de la reaccin enzimtica. Sin embargo, tambin es posible medir toda la curva de la reaccin y ajustar estos datos a una ecuacin no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimticas es denominada anlisis de la curva de progreso. Esta aproximacin es muy til como alternativa a las cinticas rpidas, cuando el perodo inicial es demasiado rpido para ser medido con precisin. Factores fsico-qumicos que pueden modificar la actividad enzimtica Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada su actividad por este factor. Los rangos de temperaturas ptimos pueden llegar a variar sustancialmente de unas enzimas a otras. Normalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima ver incrementada su actividad hasta el momento en que comience la desnaturalizacin de la misma, que dar lugar a una reduccin progresiva de dicha actividad. pH: el rango de pH ptimo tambin es muy variable entre diferentes enzimas. Si el pH del medio se aleja del ptimo de la enzima, esta ver modificada su carga elctrica al aceptar o donar protones, lo que modificar la estructura de los aminocidos y por tanto la actividad enzimtica. Concentracin salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados, la concentracin de sales del medio es crucial para una ptima actividad enzimtica. Una elevada concentracin o una ausencia de sales en el medio pueden impedir la actividad enzimtica, ya que las enzimas precisan de una adecuada concentracin de iones para mantener su carga y su estructura. -Amilasa (Nombre alternativos: 1,4--D-glucano-glucanohidrolasa; glucogenasa) Las -amylasas son metaloenzimas de calcio, completamente afuncionales en ausencia de calcio. Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponindolos en maltotriosa y maltosa desde la amilosa o maltosa, glucosa y dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es ms rpida que la -amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH ptimo est entre 6.7 y 7.0. En fisiologa humana tanto la procedente de la saliva como la pancretica son -Amylasas. Puede encontrarse en algunas plantas, hongos y bacterias. 6 Practica N 8 Cintica enzimtica

Laboratorio de Bioqumica Cintica de Michaelis-Menten Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catlisis no muestra un comportamiento lineal en una grfica al aumentar la concentracin de sustrato. Si la velocidad inicial de la reaccin se mide a una determinada concentracin de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la reaccin (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad mxima (Vmax), que no sobrepasar en ningn caso, independientemente de la [S].

Mecanismo de unin de nico sustrato para una reaccin enzimtica. k1, k-1 y k2 son las constantes cinticas para cada una de las etapas de la reaccin. (Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. 1999) El modelo de cintica micheliana para una reaccin de nico sustrato se puede ver en la figura de la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reaccin qumica bimolecular entre la enzima E y el sustrato S, formndose el complejo enzima-sustrato ES. Aunque el mecanismo enzimtico para una reaccin unimolecular puede ser bastante complejo, existe una etapa

enzimtica limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cintica nica cuya constante es k2. (Ecuacin 1) k2 tambin llamado kcat o nmero de recambio, hace referencia al mximo nmero de reacciones enzimticas catalizadas por segundo.

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Laboratorio de Bioqumica A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante entre la forma libre E y el complejo enzima-sustrato ES. Aumentando la [S] tambin aumentamos la [ES] a expensas de la [E], desplazando el equilibrio de la reaccin hacia la derecha. Puesto que la velocidad de reaccin depende de la [ES], la velocidad es sensible a pequeos cambios en la [S]. Sin embargo, a altas [S], la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato ES. Bajo estas condiciones, la velocidad de la reaccin (v k2[E]tot = Vmax) deja de ser sensible a pequeos cambios en la [S]. En este caso, la concentracin total de enzima ([E]tot) es aproximadamente igual a la concentracin del complejo ES:

La ecuacin de Michaelis-Menten7 describe como la velocidad de la reaccin depende del equilibrio entre la [S] y la constante k2. Leonor Michaelis y Maud Menten demostraron que si k2 es mucho menor que k1 (aproximacin del equilibrio) se puede deducir la siguiente ecuacin:

(Ecua cin 2) Esta famosa ecuacin es la base de la mayora de las cinticas

Representacin grfica de la curva de saturacin de una enzima donde se puede observar como evoluciona la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin. (Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. 1999)

enzimticas de sustrato nico. Representacin de la ecuacin de Michaelis-Menten La grfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que aumenta la

8 Practica N 8 Cintica enzimtica

Laboratorio de Bioqumica concentracin de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla, poda llegar a ser realmente difcil estimar los valores de la Km y la Vmax en las grficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuacin de Michaelis-Menten, dando como resultado la grfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el siguiente tutorial de la cintica de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de Virginia , se puede simular el comportamiento de una enzima variando las constantes cinticas. La grfica de Lineweaver-Burk o representacin de doble recproco es la forma ms comn de mostrar los datos cinticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuacin de Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la figura de la derecha, el resultado de este tipo de representacin es una lnea recta cuya ecuacin es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/Km.

Obviamente, no se pueden tomar valores negativos para 1/[S]; el mnimo valor posible es 1/[S] = 0, que correspondera a una concentracin infinita de sustrato, donde 1/v = 1/Vmax. El valor del punto de corte entre la recta y el eje x es una extrapolacin de datos experimentales obtenidos en laboratorio. Generalmente, las grficas de Lineweaver-Burke distorsionan las medidas realizadas a bajas concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones no muy exactas de la V max y de la Km.9 Un modelo lineal mucho ms exacto es el diagrama de Eadie-Hofstee, pero en las investigaciones cientficas actuales, todo este tipo de linearizaciones han quedado obsoletos y han 9 Practica N 8 Cintica enzimtica La grfica de Lineweaver-Burke o del doble recproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, y el gradiente de la velocidad. (Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. 1999)

Laboratorio de Bioqumica sido sustituidos por mtodos ms fiables basados en anlisis de regresin no lineal. Para analizar los datos es conveniente la normalizacin de los mismos, ya que esto puede ayudar disminuyendo la cantidad de trabajo experimental a realizar e incrementando la fiabilidad del anlisis. Especificidad Las enzimas suelen ser muy especficas tanto del tipo de reaccin que catalizan como del sustrato involucrado en la reaccin. La forma, la carga y las caractersticas hidroflicas/hidrofbicas de las enzimas y los sustratos son los responsables de dicha especificidad. Las enzimas tambin pueden mostrar un elevado grado de estereoespecificidad, regioselectividad y quimioselectividad. Algunas de estas enzimas que muestran una elevada especificidad y precisin en su actividad son aquellas involucradas en la replicacin y expresin del genoma. Estas enzimas tienen eficientes sistemas de comprobacin y correccin de errores, como en el caso de la ADN polimerasa, que cataliza una reaccin de replicacin en un primer paso, para comprobar posteriormente si el producto obtenido es el correcto. Este proceso, que tiene lugar en dos pasos, da como resultado una media de tasa de error increiblemente baja, en torno a 1 error cada 100 millones de reacciones en determinadas polimerasas de mamferos. Este tipo de mecanismos de comprobacin tambin han sido observados en la ARN polimerasa, en la ARNt aminoacil sintetasa y en los ribosomas. Aquellas enzimas que producen metabolitos secundarios son denominadas promiscuas, ya que pueden actuar sobre una gran variedad de sustratos. Por ello, se ha sugerido que esta amplia especificidad de sustrato podra ser clave en la evolucin y diseo de nuevas rutas biosintticas. Ureasa La ureasa (EC 3.5.1.5) es una enzima que cataliza la hidrlisis de urea a dixido de carbono y amoniaco. La reaccin ocurre de la siguiente manera: (NH2)2CO + H2O CO2 + 2NH3 En 1926, James Batcheller Sumner demostr que la ureasa es una protena. Es producida por bacteria, hongos y varias plantas superiores.

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Laboratorio de Bioqumica Caractersticas Peso molecular: 480 kDa o 545 kDa para la ureasa de frijol. Metal en el sitio activo: Niquel(II). pH ptimo : 7.4 Temperatura ptima: 60C Especificidad enzimtica: urea e hidroxiurea Inhibidor enzimtico: metales pesados

Diagnstico Los organismos que producen ureasa tienden a ser patgenos del tracto gastrointestinal o urinario, siendo que la ureasa les permite neutralizar el cido presente en estos medios acdicos. Los patgenos ureasa positivos, incluyen: Helicobacter pylori Bacterias entricas incluyendo Proteus, Klebsiella y Serratia Nocardia, una bacteria filamentosa Ureaplasma urealyticum, relacionada con mycoplasma Cryptococcus, un hongo oportunista

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Laboratorio de Bioqumica Procedimiento Experimental

Materiales de laboratorio: Rejilla, 10 tubos de ensayo, cocinilla, vasos de 100 y 500mL, probeta, termmetro,

Reactivos: solucin de almidn al 1%, solucin de yodo en yoduro de potasio (Lugol), buffer fosfato citrato 0,1M con pH 5,6;6,4;7,2;8,0.

Material biolgico: solucin de saliva diluida. Dependencia de la velocidad de reaccin de la cantidad de enzima 1. Primero se diluye la saliva en 20, 40,80 y 160 veces su volumen.

2. Se toma 4 tubos de ensayo y se coloca en cada uno de ellos 1mL de cada una de las soluciones preparadas. 3. A cada uno de los 4 tubos se agrega 1mL de solucin de almidn y se coloca en un bao de 38C y se controla el tiempo inicial de la reaccin.

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Laboratorio de Bioqumica 4. Despus de unos 2 minutos toman 2 gotas del lquido de cada muestra y le agregan a ellas 1 gota de solucin de Lugol. Se registra el tiempo en que la reaccin ha terminado pues primero se presenta una coloracin azul, luego rojo-violeta y por ultimo roja.

Dependencia de la velocidad de la reaccin enzimtica de la temperatura 1. Se coloco en un tubo de ensayo 5 gotas de saliva. Luego se hirvi por 2 minutos en un bao de agua y se paso a enfriar. 2. En otros dos tubos se coloca 5 gotas de saliva tambin pero sin hervir. 3. A todos los tubos se les agrego 10 gotas de solucin de almidn. 4. Al primer y segundo tubo se les coloco en un bao de 38C y al tercer tubo en agua con hielo por 3 minutos. 5. Por ultimo se aadi a cada tubo 1 gota de solucin de Lugol y se comparo las coloraciones.

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Laboratorio de Bioqumica Dependencia de la velocidad de la reaccin enzimtica del pH del medio 1. En 5 tubos se miden 10 gotas de solucin buffer de fosfato-citrato con los diferentes pH mencionados.

2. Luego a cada uno de los tubos se le agr3go 5 gotas de saliva diluida 10 veces su volumen y 10 gotas de solucin de almidn y todo se coloca en un bao de agua a 38C.

3. Luego de 2 a 3 minutos se toma 1 gota de cada tubo y se le realiza el ensayo de Lugol en donde anotaremos el tiempo de aparicin de la coloracin roja.

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Laboratorio de Bioqumica Demostracin de la especificidad absoluta de la ureasa (Laboratorio N9) 1. En un tubo de ensayo se coloca 1mL de urea ya preparada, en un segundo tubo se coloca tiourea y en el tercero acetamida. 2. A cada tubo se le agrego aproximadamente 100mg de harina de soya y 2 gotas de fenolftalena, mezclamos cuidadosamente y dejamos reposar a temperatura ambiente. 3. Por ultimo se observa la aparicin de color rosado claro y detectamos la presencia de amoniaco por el olor caracterstico.

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Laboratorio de Bioqumica Reacciones Qumicas El mtodo est basado en el estudio de la velocidad de hidrlisis del almidn revelado con Lugol, en dependencia de la cantidad aadida del alfa-amilasa de la saliva. As mismo se cumplen las reacciones al influir la temperatura y el pH. La amilasa del almidn forma con el yodo un complejo de color azul, el glucgeno pardo rojizo o amarillento. La primera reaccin que se describe a continuacin es el fraccionamiento del almidn en maltosa y dextrina por la enzima amilasa, esto ocurre en la boca.

Demostracin de la especificidad absoluta de la ureasa El mtodo se bas en la determinacin del amonaco que se forma por la accin de la ureasa de la harina de soya sobre la urea: (NH2)2CO + H2O CO2 + 2NH3 El desprendimiento de amoniaco se detect por el olor y por el cambio de color de la fenolftalena y del papel de tornasol rojo.

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Laboratorio de Bioqumica Clculos Experimentales Dependencia de la velocidad de reaccin de la cantidad de enzima T(s) 8 10 14 20 1/T(s) 0.13 0.10 0.07 0.05 [amilasa diluida] 20 40 80 160

Dependencia de la velocidad de reaccin de la cantidad de enzma

0.14 0.12 0.1 1/T(s) 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 50 100 [concentracion] de amilasa 150 200

Dependencia de la velocidad de la reaccin enzimtica de la temperatura Enzima Amilasa Amilasa Amilasa Sustrato Almidn Almidn Almidn Coloracin con Lugol Transparente Transparente Azul Temperatura (C) 38 38 8

Dependencia de la velocidad de la reaccin enzimtica del pH del medio pH 5.6 6.4 6.8 7.2 8.0 1/T (min) 0.070 0.170 0.330 0.200 0.125

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Laboratorio de Bioqumica

Dependencia de la velocidad de la reaccin enzimtica del pH del medio

0.35 0.3 0.25 1/T(min) 0.2 0.15 0.1 0.05 0 5 6 7 pH del buffer fosfato-citrato 8 9

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Laboratorio de Bioqumica Discusin de resultados

Dependencia de la velocidad de reaccin de la cantidad de enzima Los resultados obtenidos demuestran que la velocidad enzimtica se ve influenciada por la cantidad de enzima presente en solucin. La grfica que se produce como consecuencia de la aparicin de eritrodextrinas del almidn genera una recta de pendiente positiva, lo cual permite pensar que a medida que la concentracin de la enzima es mayor el tiempo que se necesita para transformar el sustrato en producto es mucho menor (al graficar 1/t vs concentracin). Estos ltimos resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores biolgicos de una reaccin. Por otro lado se pudo corroborar cualitativamente la presencia de eritrodextrinas del almidn, como consecuencia de la accin enzimtica de la ptialina sobre el sustrato (almidn). Cabe destacar por ultimo, que se pudo observar que la reaccin enzimtica sigui una cintica de Michaelis por tener un comportamiento lineal al ser graficada la velocidad versus la concentracin. As mismo destacar que la reaccin enzimtica de la amilasa sobre el almidn es de naturaleza especfica. Dependencia de la velocidad de reaccin enzimtica de la temperatura Los resultados del experimento demuestran que la temperatura tiene un efecto importante en la velocidad enzimtica. Si la temperatura aumenta considerablemente la reaccin puede no producirse debido a la desnaturalizacin de la enzima. Si la temperatura es alta y propicia se obtienen los productos de la accin enzimtica sobre el sustrato. Como es el caso de la ptialina actuando sobre el almidn. As mismo se produce este resultado a 38C, que es una temperatura ideal de accin de la enzima. Finalmente la accin enzimtica no se produce a 7C debido a que no es la temperatura de accin de la ptialina. 19 Practica N 8 Cintica enzimtica

Laboratorio de Bioqumica Estos resultados pues indican, que la accin enzimtica es especfica no solamente a la estructura del sustrato sino tambin a una temperatura adecuada, para que se puedan generar los enlaces de naturaleza covalente y se pueda producir el fenmeno termodinmico y por ultimo la transformacin de los reactantes en productos. Dependencia de la velocidad de reaccin enzimtica del pH del medio Los resultados demuestran que la reaccin enzimtica tambin se ve influenciada por el cambio del pH del medio hasta alcanzar un pH ptimo, el cual para la ptialina est alrededor de 6.7-6.8 cerca del pH neutro. Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima ptialina as como muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actan en pH neutro. Este resultado puede ser ubicado en la punta de la campana. El pH funciona de esta manera como un tercer factor adems de la temperatura y la composicin del sistema.

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Laboratorio de Bioqumica Conclusiones El estudio de la cintica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas. La velocidad enzimtica se ve influenciada por la cantidad de enzima presente en solucin. La grfica que se produce como consecuencia de la aparicin de eritrodextrinas del almidn genera una recta de pendiente positiva, lo cual permite pensar que a medida que la concentracin de la enzima es mayor el tiempo que se necesita para transformar el sustrato en producto es mucho menor (al graficar 1/t vs concentracin). Los resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores biolgicos de una reaccin. La temperatura tiene un efecto importante en la velocidad enzimtica. Si la temperatura aumenta considerablemente la reaccin puede no producirse debido a la

desnaturalizacin de la enzima. Si la temperatura es alta y propicia se obtienen los productos de la accin enzimtica sobre el sustrato. Como es el caso de la ptialina actuando sobre el almidn. As mismo se produce este resultado a 38C, que es una temperatura ideal de accin de la enzima. Finalmente la accin enzimtica no se produce a 7C debido a que no es la temperatura de accin de la ptialina. Los resultados demuestran que la reaccin enzimtica tambin se ve influenciada por el cambio del pH del medio hasta alcanzar un pH ptimo, el cual para la ptialina est alrededor de 6.7-6.8 cerca del pH neutro. Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima ptialina as como muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actan en pH neutro. Este resultado puede ser ubicado en la punta de la campana.

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Laboratorio de Bioqumica Bibliografa

1.- BIOQUMICA, Legninger, Edit. Omega. Segunda edicin. 1981. Madrid. 2.- BIOQUMICA PRCTICA, Plummer. Edit. McGraw-Hill. 3.- GUA DE PRCTICAS DE BIOQUMICA, Garca Alayo, Fred, FQIQIA, UNMSM, Per, 2011.

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