UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

ENZIMOLOGÍA

PRÁCTICA N°2

TEMA: CINÉTICA ENZIMÁTICA/ INHIBICIÓN. EFECTO DEL

TIEMPO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA.

Nombres: Mateo Castillo

María José Guerrero

Jimmy Gaibor

Stefanny Quinteros

Anthony Salguero

Curso: Nivel 6 Grupo 2.

Grupo de laboratorio: 1

Fecha de realización de la práctica: 29/11/19

Fecha de entrega del informe: 06/12/19

 Resumen

Existen varios métodos que permiten determinar la actividad enzimática, uno de estos es
el método colorimétrico, para la realización de esta práctica fue considerado debido a que
es uno de los métodos más rápidos y sencillos de realizar. Se determinó la actividad de la
catalasa sobre el peróxido de sodio, teniendo en cuenta intervalos de tiempo que iba desde
el minuto 0 hasta el minuto 6. Para alcanzar nuestros objetivos se preparó la catalasa en
base a una muestra de sangre de hígado bovino. La determinación de la actividad se
realizó una vez que se agregó 𝐻2 𝑆𝑂4 a la muestra, para la titulación se utilizo 𝐾𝑀𝑛𝑂4, se
debe tener en cuenta que para la titulación la muestra debía estar en constante agitación,
con el fin de determinar el efecto del tiempo sobre la reacción en la actividad enzimática.

Palabras claves: catalasa, enzima, titulación, actividad catalítica, tiempo de incubación

Objetivo general:
  Evaluar el efecto del tiempo de incubación sobre la actividad de la enzima
catalasa.

Objetivos específicos:

 Aplicar la metodología utilizada para preparar una muestra de sangre o de hígado

como fuente de la enzima catalasa.
 Determinar la concentración de µmoles de H2O2 degradados mediante la
metodología de titulación con permanganato de potasio.
 Determinar la actividad de la catalasa enzima en función del tiempo.

Marco teórico

Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica. Esto significa que son
proteínas cuya función es acelerar las reacciones bioquímicas. Aunque se trata de
proteínas muchas requieren, para ser activas, un componente no proteico conocido como
coenzima o grupo prostético, según se encuentre débil o firmemente asociado a la matriz
proteica. La estructura de este componente no proteico va a variar desde un ion (Ca+2,
Mg+2, Mn+2, y otros) hasta moléculas complejas como NAD+, NADP+ y FAD. En estos
casos la actividad enzimática va a depender de la presencia simultánea de una porción
proteica (apoenzima) y una porción no proteica (coenzima) y el conjunto activo
apoenzimamas coenzima, se conoce como holoenzima. En los sistemas biológicos, las
enzimas disminuyen la energía de activación y permiten que se produzcan reacciones de
mayor velocidad de catálisis. Las enzimas no se consumen en el proceso y las reacciones
catalizadas no alteran la naturaleza de la reacción, solo disminuyen la energía de
activación. Se caracterizan, además, por su elevada especificidad de éstas hacia el
substrato. Es decir, una enzima cataliza la transformación de un solo tipo de sustrato
(molécula o de unos tipos diferentes de moléculas estructuralmente muy relacionadas).
Las enzimas dependiendo de las reacciones que catalizan, se han clasificado por la
comisión internacional de enzimas (E.C) en cuatro dígitos que anteceden al nombre
recomendado para la enzima. Este nombre está compuesto por uno corto unido al nombre
de la reacción que cataliza, los dígitos son: el primero se refiere a la clase y van del 1 al
6, y representan la reacción general catalizada:
(1) OXIDOREDUCTASA (2) TRANSFERASA (3) HIDROLASA (4) LIASA (5)
ISOMERASA (6) LIGASA

El segundo número, la sub-clase; el tercero la sub-subclase y el cuarto designa a cada

enzima especifica.
Factores que modulan la actividad enzimática:
4. Temperatura: La estructura terciaria de una proteína es muy sensible a los cambios
de la temperatura ya que, como sabemos, se mantiene gracias a fuerzas no covalentes
altamente sensibles al calor. Esto hace que la actividad enzimática muestre una
dependencia de la temperatura.
5. pH: debido a que los cambios de pH modifican las concentraciones de los iones H+ y
OH- del medio de incubación. Además, de las interacciones electrostáticas intra e
intermoleculares; de las interacciones entre las moléculas de proteínas y la solución de un
valor de pH a otro. Se altera también la estructura tridimensional y la actividad de la
proteína.
6. Fuerza iónica: Como la fuerza iónica está relacionada con la concentración de los
diferentes iones de una solución y éstos pueden influir sobre la estabilidad y la actividad
de una proteína debe mantenerse un control sobre este parámetro.
7. Agitación: Las soluciones de proteínas tienen baja tensión superficial, lo cual
determina que cuando estas soluciones se agitan violentamente, se forma espuma; la cual
es un factor que favorece la desnaturalización.
Determinación de la actividad enzimática.
Cuando en el laboratorio se desea estudiar la actividad de una enzima particular, se
comienza por controlar algunos parámetros que van a determinar la reproducibilidad de
los ensayos. Entre estos parámetros se pueden destacar:
1. Métodos de detección: Lo primero de que se debe disponer es de un método que
permita detectar y cuantificar el producto formado o el sustrato remanente después de la
reacción. Los métodos más usados por su rapidez y sencillez, son los colorimétricos y
espectrofotométricos; luego se encuentran la cromatografía en papel, en capa fina o de
gases; titulación y respirometría, entre otros.
2. Tiempo de incubación: Para determinar una actividad enzimática es necesario fijar un
intervalo de tiempo conveniente durante el cual se consuma una concentración medible
de sustrato; por lo que debe siempre garantizarse que haya un exceso de sustrato. Para
determinar el tiempo de incubación, se mezclan los reactantes en varios recipientes y se
detiene la reacción a diferentes tiempos. Se consigue que mientras no ha ocurrido la
saturación de la enzima por el substrato, la actividad es proporcional al tiempo de
incubación. En cambio, la saturación provoca la pérdida de la proporcionalidad. No
obstante, no se debe confundir la situación en que se alcanza la saturación con la situación
en que se ha agotado el substrato; por esto el sustrato debe estar en exceso.
3. Concentración de la enzima: Determinado el tiempo de incubación y en la seguridad
de que la concentración de sustrato es excesiva, se incuban las mezclas de reacción
durante el tiempo predeterminado, pero con cantidades diferentes de enzimas. Si el
sustrato se encuentra en exceso, se debe hallar una proporcionalidad directa entre la
actividad y la concentración de enzima. Además, se debe elegir una concentración de
enzima que permita una determinación confiable de la actividad.
4. Concentración del substrato: La determinación de este parámetro es muy importante
porque permite el cálculo de las propiedades cinéticas Km y Vmax para ese sustrato, y
porque indica definitivamente qué concentración de sustrato se puede considerar
saturante.
Por lo general, se considera saturante y se emplea rutinariamente una concentración de
sustrato [s] = 10 Km. En este sentido se debe calcular a qué fracción de Vmax corresponde
la actividad enzimática cuando [s] = 10 Km. Esta determinación se realiza empleando una
cantidad fija de enzima e incubando durante un mismo lapso de tiempo, pero con
diferentes concentraciones de sustrato.
Para la actividad práctica se deben de tomar en ciertas precauciones: Evitar de que no se
agote el sustrato en el lapso de tiempo fijado con la cantidad de enzima usada. Entre las
alternativas para evitar esto, se indican las siguientes:
a. No hacer ninguna modificación al tiempo ni a la cantidad de enzima determinada.
b. Reducir la cantidad de enzima e incubar durante el tiempo determinado.
c. Reducir el tiempo de incubación y mantener fija la cantidad de enzima determinada.
d. Reducir el tiempo de incubación y la cantidad de enzima.
e. No emplear concentraciones de sustrato demasiado bajas.
5. Temperatura de incubación: Sabemos que la velocidad de una reacción química
aumenta al elevarse la temperatura; esto también es cierto para las reacciones enzimáticas,
pero el rango de activación por la temperatura es limitado (0°C y 45°C); aunque estas
cifras no son absolutas. Por lo general, a menos de 0°C la actividad es prácticamente
indetectable; mientras que a más de 45°C la enzima se inactiva, por las razones expuestas
previamente. La temperatura óptima de reacción se determina incubando bajo
condiciones constantes de los parámetros previamente determinados y a temperaturas
diferentes.
6. pH de incubación: Se procede igual que para determinar la temperatura óptima pero
sólo se varía el pH de la mezcla de reacción.
Inhibición de la actividad enzimática.
Algunos compuestos actúan sobre las enzimas o coenzimas que intervienen en una
reacción enzimática afectando la Vmax. de reacción y/o la afinidad de la enzima por el
sustrato.
El uso de inhibidores ha permitido conocer la:
Naturaleza de grupos funcionales del centro activo.
Participación de estos grupos funcionales en el mantenimiento de la conformación de la
enzima específica para su actividad biológica.
Especificidad del sustrato y posibles mecanismos de reacción enzimáticos.
La inhibición puede ser: reversible o irreversible. En el primer caso es posible eliminando
el inhibidor por diálisis y recuperar la enzima intacta. En el segundo caso el inhibidor
reacciona con la enzima destruyendo uno o más grupos funcionales de la enzima y no
puede eliminarse dicho inhibidor por diálisis. En exceso de inhibidor su acción aumenta
con el tiempo ya que la formación del complejo EI es irreversible.
Inhibición reversible: cuando el inhibidor (I) se combina con el centro activo de la enzima
con grupos funcionales esenciales para la actividad enzimática pero que no están en el
centro activo. Este tipo de inhibición puede ser: Competitivo o no competitivo.
 Inhibición competitiva: La enzima puede enlazar en su centro activo un compuesto
estructuralmente relacionado a su verdadero sustrato previniéndose de esta manera la
unión al sustrato; el S y el I compiten por alcanzar el centro activo de la enzima; esta
inhibición se revierte por exceso de sustrato. En este caso, el valor de la Km cambia, pero
no Vmax alcanzada en la reacción sin inhibidor.
Inhibición no competitiva: Ocurre cuando se produce inhibición específica y reversible
que depende sólo de la concentración del inhibidor y no se elimina por aumento de la
concentración del sustrato. Esto indica que el I se une a E en un punto esencial para la
actividad enzimática diferente del centro activo. Con el inhibidor no competitivo la Km
permanece invariable pero la Vmax alcanzada es menor que la que se logra en ausencia
de inhibidor.
Recursos utilizados

Materiales

- Vaso de precipitación de 500ml (1) R: 0 – 500 mL A±500mL

- Soportes Universales (1)
- Pinzas y Nueces (1)
- Buretas de 50 ml (1) R: 0 – 50 mL A±50mL
- Pipetas de 10 y 5 ml (1) R: 0 – 10 mL A±10mL
- Erlenmeyers de 125 ml (5) R: 0 – 125 mL A±125mL
- Varilla de vidrio (1)
- Balón 250ml (1) R: 0 – 250 mL A±250mL
- Embudos (1)
- Probeta 5, 10 y 50 ml (1) R: 0 – 50 mL A±50mL

Equipos

- Aguja (1) - Baño maría (1)

- Centrífuga (1) - Refrigeradora (1)

Reactivos

- Agua destilada (2 L) - Permanganato de Potasio (0,1N

- Ácido sulfúrico (50 mL) 150 mL).
- H2O2 (100mL)

Procedimiento
PARTE I:

1. Preparación de la enzima: A un balón aforado con un litro de agua destilada

enfriada en hielo agregue 1 ml de sangre humana obtenida por punción y mezcle
volteando suavemente el recipiente dos veces. Esta solución se mantiene siempre
en hielo. Puede usarse 1 ml de homogeneizado de hígado o riñón de res o rata.
2. Preparación de soluciones: A.-Solución de ácido sulfúrico 1.5 M. Se depositan
82.6 mL de H2SO4 de 98 % en matraz aforado y se lleva a 1000 mL. B.-Solución
de permanganato de potasio 0.01 M. Se pesan 1.5804 g de KMnO4 y se depositan
en un matraz erlenmeyer. Se adicionan 400 mL de agua destilada, agitando con
agitador magnético y calentando hasta su disolución completa. Se deja enfriar, se
filtra y se afora a 1 000 mL utilizando un matraz aforado.
Se guarda en frasco ámbar. La solución se debe valorar cada vez que se utilice
con oxalato de sodio para conocer su normalidad. C.-Solución de peróxido de
hidrógeno 1:100. Se toma una alícuota de 1 mL de H2O2 (agua oxigenada) al 30
%, se afora a 100 mL. Esta solución debe prepararse inmediatamente antes de su
uso.
3. Determinación del tiempo de reacción:
a. Realice la siguiente experiencia:
b. El ácido sulfúrico se agrega después de transcurrido el tiempo prescrito a partir
de la adición de la enzima excepto en fiola 1.
c. Titule el H2O2 remanente en cada fiola y haga una gráfica que represente la
cantidad de moles de H2O2 descompuestos en función del tiempo de incubación
y en base a ella elija el tiempo de incubación que empleará en las experiencias
sucesivas.
d.-Proceda a iniciar el experimento, de acuerdo a la siguiente Tabla:

f.- Medición del peróxido de hidrógeno remanente

Cada volumen de cada enlermeyer se titula lentamente con la solución de KMnO4
0.01M, con agitación (con agitador magnético).Para llegar al vire se debe ser muy
observador, ya que las primeras gotas del permanganato se decoloran más
 lentamente y pero luego la reacción se hace más rápida. El punto final de la
valoración lo señala la aparición del primer color rosa permanente.
Se hace una gráfica representativa del número de moles de H2O2 descompuesta
por minutos en función del volumen de enzima empleado y en base a esa gráfica
el grupo escogerá el volumen de enzima que empleará en el experimento
siguiente.
h. Detección de la actividad enzimática: a.- La actividad enzimática de la
catalasa será detectada titulando el agua oxigenada presente en cada fiola, con
KMnO4 0 1N, después de agregársele ácido sulfúrico 2N. La ecuación en que se
basa el método de detección es: MnO4- + H2O2 + H + ⇔ O2 + Mn ++ + H2O

Biorreacciones

 Primera reacción.
Superóxido disminutasa
2𝑂− 2 + 2𝐻 + 𝐻2 𝑂2 + 𝑂2
2𝐻2 𝑂2 catalasa 2𝐻2 𝑂 + 𝑂2

 Segunda reacción.
+
[catalasa + Fe(III)] + 2𝐻 + + 𝐻2 𝑂2 𝐻2 𝑂 + [𝑐𝑎𝑡𝑎𝑙𝑎𝑠𝑎 − 𝐻2 𝑂 – 𝐹𝑒(𝑉)]2
Complejo I
+
[𝑐𝑎𝑡𝑎𝑙𝑎𝑠𝑎 − 𝐻2 𝑂 – 𝐹𝑒(𝑉)]2 + 𝐻2 𝑂  𝐻2 𝑂 + 𝑂2 + 2𝐻 + + [catalasa – Fe(III)]
Complejo I
Observaciones

Normalmente la actividad de la catalasa realiza las funciones de un mecanismo de defensa

que actúa sobre el anión radical de superóxido (O2-), el cual es un peligroso subproducto
de la oxidación metabólica de lípidos y carbohidratos. La enzima superóxido dismutasa
es la primera línea de defensa contra este compuesto, ya que convierte el ion superóxido
a peróxido de hidrógeno, sustancia conocida por ser super tóxica para las células. La
acción de la catalasa se da luego de la formación del peróxido, siendo ésta la responsable
de convertir el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.

En la segunda reacción el peróxido de hidrógeno sufre tanto una oxidación

como una reducción. Se piensa que es un proceso que ocurre en dos pasos en
los cuales se ve involucrada la catalasa. como primer paso, una molécula de
peróxido de hidrógeno es reducida a agua y la catalasa es oxidada al complejo I. La
segunda molécula de peróxido de hidrógeno se oxida y el complejo I se reduce lo que
causa una regeneración de la catalasa (Robles, 2014)

Cálculos y Resultados

Indicar en la tabla de resultados el volumen de KMnO4 utilizado en cada matraz y

según la titulación realizada en “f” (medición del peróxido de hidrógeno remanente).
Nº T (MIN) KMNO4 (ML)
1 0 66.50
2 1 42.5
3 2 30.4
4 4 28.5
5 6 20.4

KMnO4 + H2O2 + H2SO4  O2 + Mn

5 H2O2 + 2KMnO4 + 3 H2SO4  5O2 + 2MnSO4 + 8H2O + K2SO4

KMnO4= 0,1 M

PM H2O2= 34g.

Nº T (MIN) KMNO4 (ML)

1 0 66.50

1𝐿 0,1𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐾𝑀𝑛04
66.50 𝑚𝐿 KMnO4 ∗ ∗ = 6.65 ∗ 10−3 𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4
1000𝑚𝐿 1𝐿 𝐾𝑀𝑛04

5𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐻2𝑂2 34𝑔 𝐻2𝑂2

6.65 ∗ 10−3 𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4 ∗ ∗ = 0.5652 𝑔 𝐻2𝑂2
2𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4 1 𝑚𝑜𝑙 𝐻2𝑂2
𝑔
𝑑𝑒 30% 𝐻2𝑂2 = 1,195
𝑚𝑙

1𝑚𝑙
0, 5652 𝑔 𝐻2𝑂2 ∗ = 0,4729 𝑚𝐿 𝐻2𝑂2
1,195 𝑔

Nº T (MIN) KMNO4 (ML)

2 1 42.5

1𝐿 0,1𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐾𝑀𝑛04
42.5 𝑚𝐿 KMnO4 ∗ ∗ = 4.25 ∗ 10−3 𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4
1000𝑚𝐿 1𝐿 𝐾𝑀𝑛04

5𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐻2𝑂2 34𝑔 𝐻2𝑂2

4.25 ∗ 10−3 𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4 ∗ ∗ = 0.3612 𝑔 𝐻2𝑂2
2𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4 1 𝑚𝑜𝑙 𝐻2𝑂2
 𝑔
𝑑𝑒 30% 𝐻2𝑂2 = 1,195
𝑚𝑙

1𝑚𝑙
0, 3612 𝑔 𝐻2𝑂2 ∗ = 0,3022 𝑚𝐿 𝐻2𝑂2
1,195 𝑔

Nº T (MIN) KMNO4 (ML)

3 2 30.4

1𝐿 0,1𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐾𝑀𝑛04
30.4 𝑚𝐿 KMnO4 ∗ ∗ = 3.04 ∗ 10−3 𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4
1000𝑚𝐿 1𝐿 𝐾𝑀𝑛04

5𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐻2𝑂2 34𝑔 𝐻2𝑂2

3.04 ∗ 10−3 𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4 ∗ ∗ = 0.2584 𝑔 𝐻2𝑂2
2𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4 1 𝑚𝑜𝑙 𝐻2𝑂2
𝑔
𝑑𝑒 30% 𝐻2𝑂2 = 1,195
𝑚𝑙

1𝑚𝑙
0, 2584 𝑔 𝐻2𝑂2 ∗ = 0,2162 𝑚𝐿 𝐻2𝑂2
1,195 𝑔

Nº T (MIN) KMNO4 (ML)

4 4 28.5

1𝐿 0,1𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐾𝑀𝑛04
28.5 𝑚𝐿 KMnO4 ∗ ∗ = 2.85 ∗ 10−3 𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4
1000𝑚𝐿 1𝐿 𝐾𝑀𝑛04

5𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐻2𝑂2 34𝑔 𝐻2𝑂2

2.85 ∗ 10−3 𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4 ∗ ∗ = 0.2422 𝑔 𝐻2𝑂2
2𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4 1 𝑚𝑜𝑙 𝐻2𝑂2
𝑔
𝑑𝑒 30% 𝐻2𝑂2 = 1,195
𝑚𝑙

1𝑚𝑙
0, 2422 𝑔 𝐻2𝑂2 ∗ = 0,2027 𝑚𝐿 𝐻2𝑂2
1,195 𝑔

Nº T (MIN) KMNO4 (ML)

5 6 20.4

1𝐿 0,1𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐾𝑀𝑛04
20.4 𝑚𝐿 KMnO4 ∗ ∗ = 2.04 ∗ 10−3 𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4
1000𝑚𝐿 1𝐿 𝐾𝑀𝑛04

5𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐻2𝑂2 34𝑔 𝐻2𝑂2

2.04 ∗ 10−3 𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4 ∗ ∗ = 0.1734 𝑔 𝐻2𝑂2
2𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑀𝑛𝑂4 1 𝑚𝑜𝑙 𝐻2𝑂2
𝑔
𝑑𝑒 30% 𝐻2𝑂2 = 1,195
𝑚𝑙
 1𝑚𝑙
0, 1734 𝑔 𝐻2𝑂2 ∗ = 0,1451 𝑚𝐿 𝐻2𝑂2
1,195 𝑔

Discusión

La temperatura, junto con el pH, es uno de los principales factores que intervienen en las
actividades enzimáticas. Por lo que, los diferentes grados de temperatura causan efectos
en la actividad enzimática (Jimenez & López, 2015)

El peróxido de hidrogeno es toxico para la mayoría de los organismos vivos por la cual
muchos son capaces de destruirlo a través de una reacción espontánea antes de que pueda
realizar más daño (Jimenez & López, 2015)

Al hablar acerca de la catalasa, se sabe que esta se encuentra en la sangre (en este caso de
un bovino) a un Ph neutro, razón por la cual la preparación se debió hacer en una solución
buffer con Ph 7, para simular las condiciones de la sangre. Se analizó el efecto que tiene
la concentración de la encima en varias concentraciones, en total fueron 5 y titulando
cada una con KMnO4, en la primera muestra el volumen de KMnO4 fue mucho mayor a
los demás debido a que la enzima no tuvo tiempo de actuar con los demás componentes,
en el segundo matraz de igual manera la enzima no tuvo mucho tiempo de actuar con los
demás componentes y aunque el volumen de KMnO4 fue menos, de igual manera se
utilizó gran cantidad, se prosiguió con el mismo procedimiento hasta llegar al matraz
número 5 en el cual su tiempo de actuación con los otros compuestos fue de 6 minutos,
por este motivo la enzima tuvo tiempo de actuar y al momento de realizar la titulación
fue casi al instante ocupando un volumen de KMnO4 de solo 20,4.

Todos estos resultados se dan debido a que la enzima desde el matraz 1 hasta el 5 tuvo
tiempos de activación o de actuación con los compuestos y al momento de titular se puede
ver de mejor manera el tiempo de reacción de la enzima, añadiéndole también la
importancia del ph y de la temperatura para que la misma actúe (Estrella & Castro, 2005)

Conclusiones

Cuestionario
 1. En base a la práctica de laboratorio realizada, diseñar un protocolo que le
permitan determinar los siguientes parámetros:

a. Temperatura

b. pH óptimo

c. Constante de Michaelis (Km) y velocidad máxima (Vmax)

d. Efecto del calentamiento sobre la actividad enzimática

Aplicación biotecnológica

Bibliografía

Anexos