ENZIMOLOGA I

MARA CRISTINA LUNA LPEZ (1541236)

DIANA YURLEY BRAVO LPEZ (1543171)
LUISA FERNANDA RIVERA FORERO (1543556)
ANGLICA MARA ROJAS MAYOR (1543378)

PRESENTADO A:
NGELA MARA ESCUDERO R. MD.
FACULTAD DE SALUD
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLGICAS

PROGRAMA DE BACTERIOLOGA Y LABORATORIO CLNICO

METABOLISMO

SANTIAGO DE CALI, VALLE.

MAYO 19 DE 2016

Resumen. En esta prctica realizamos procedimientos experimentales para la determinacin del efecto sobre la actividad
enzimtica en la variacin del pH y la temperatura en la enzima fosfatasa, utilizando el sustrato p-nitro-fenilfosfato (PNFP),
obteniendo la mayor absorbancia para una temperatura de 37 C y pH de 9.6.Adems se utiliz la ley de Beer-Lambert para
establecer la concentracin de una muestra realizando una curva de calibracin con un resultado de 0.11 mM en la muestra
problema.
Palabras clave: Enzimas, fosfatasas, pH, temperatura, tiempo.
OBJETIVOS

Conocer y adquirir experiencia en el manejo de los instrumentos empleados en el laboratorio, en especial el espectrofotmetro.
Conocer la naturaleza, caractersticas generales y mecanismos de la regulacin de las enzimas para entender su gran incidencia en los
procesos metablicos que tienen lugar en el organismo.
Determinar el efecto sobre la actividad enzimtica de la variacin del tiempo, pH, temperatura, en la enzima fosfatasa, utilizando el
sustrato sinttico p-nitro-fenilfosfato.
Observar el comportamiento de la enzima fosfatasa que es tan abundante en animales, vegetales y microorganismos.
Identificar cual es la temperatura y PH ptimo para la fosfatasa alcalina.

INTRODUCCIN
Las fosfatasas son un conjunto de enzimas capaces de
hidrolizar los esteres fosfato de diversos fosfolpidos. Si son
activadas a un nivel de pH inferior a 7 se denominan
fosfatasas cidas mientras que si son activadas a un pH
superior a 7 se denominan fosfatasas alcalinas. Son enzimas
con actividad fosfomonoesterasa que se encuentra en las
membranas celulares de diferentes rganos, entre ellos, en el
hueso, placenta, intestino, leucocitos y otros [1]. En el proceso
de clasificacin de las fosfatasas se han sealado cuatro
diferentes tipos de esta enzima:

PROCEDIMIENTO
1.

Curva de calibracin de p-nitrofenol

Con una longitud de onda de 405 se determin la
relacin entre absorbancia y concentracin y entre
transmitancia y concentracin.
En cinco tubos de ensayo se realizaron las siguientes
soluciones y se obtuvieron los resultados contenidos
en la Tabla 1.

Solucin

Fosfomonoesterasa: catalizan la hidrlisis de monoesteres de

cido fosfrico.
Fosfoesterasa: que tienen accin sobre diesteres del mismo
cido.
Pirofosfatasa: las cuales hidrolizan esteres de cido
pirofosfrico
Metafosfatasa: quienes hidrolizan esteres de cido
metafosfrico y (HPO3)n [2]
Existen diferentes factores que influyen en la determinacin de
la actividad enzimtica entre ellos encontramos:
La Temperatura: que en general aumenta la velocidad de la
reaccin del mismo modo que la actividad enzimtica aumenta
sin embargo al alcanzar determinadas temperaturas aparecen
fenmenos de desnaturalizacin de la protena enzimtica y la
enzima se inactiva.
Tampn y pH: existe el valor de pH optimo que es cuando
la efectividad de la enzima es mxima.
Presencia de cofactores: las coenzimas son sustancias que
aumentan la actividad de la enzima y por tanto la sensibilidad
del mtodo analtico.
Concentracin del substrato: si se mantienen constantes el
resto de las variables, la velocidad de la reaccin enzimtica
aumentar hasta un punto determinado con concentraciones
crecientes del substrato. [1]

Agua
Buffer
pH 9.6
Barbital
PNFP 2.0
nM
Absorba
ncia
Transmit
ancia

blanco
1.5
1.5

1
1.47
1.5

TUBO (mL)
2
3
1.44
1.41
1.5
1.5

4
1.35
1.5

--------

0.03

0.06

0.09

0.15

0.25

0.66

1.2

1.27

Soluc
in
Probl
ema
0.83

56.2

22

6.4

5.4

14.6

Tabla 1. Datos para la curva de calibracin de p-nitrofenol.

Concentracin de la muestra problema:

A=lc
Donde:
A= Absorbancia

= Coeficiente de extincin molar

c= Concentracin

c=

A
l

[1]

de tiempo de un minuto entre cada tubo se agreg 0.1

mL de la enzima FAL y se dej incubando por otros
tres minutos, Seguidamente se anexaron los datos
obtenidos en la Tabla 3.

1.5
1

ABSORBANCIA

0.5

Soluci
n

TUBO (mL)
blanc
o
2.7

0
0

0.1

0.2

0.3

CONCENTRACIN
Fig 1. Absorbancia vs concentracin
2.

Efecto de la temperatura.
Se prepararon las siguientes soluciones realizando
una preincubacin de cada tubo de ensayo durante
tres minutos. Cumplidos los tres minutos de
preincubacin con diferencias de 1 minuto entre tubo
y tubo se agreg 0.1 ml de la enzima FAL, se dej
incubar nuevamente por tres minutos, los datos
obtenidos se muestran en la
Tabla 2.

Solucin
1

Agua

2.7

2.4

2.4

2.4

2.4

2.4

Buffer
pH 9.6
PNFP 2.0
nM

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

--------

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

25C

4C

30C

37C

50C

100C

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

---

0.08

0.204

0.279

0.189

0.112

Tabla 2. Datos obtenidos sobre el efecto de la Temperatura.

2.4

2.4

2.4

2.4

2.4

2.4

Buffer
0.3 mL

0.3

pH
3.4

pH
8.8

pH
9.2

pH
9.6

pH
10.4

pH
10.8

PNFP
2.0 nM

--------

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

Enzima
FAL
Absorb
ancia

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

---

0.16
5

0.32
1

0.32
8

0.43
8

0.23
9

0.12
5

Tabla 3. Datos del efecto del pH.

0.5
0.4

ABSORBANCIA 0.2
0.1
0
0

Tomando los valores obtenidos para la curva de calibracin del

p-nitrofenol (Tab. 1) y la ec. 1. se obtienen los siguientes
valores para la concentracin:

3
4

50

100

150

TEMPERATURA
Fig 1. Grafica de A Vs Temperatura
Efecto del pH
Se prepararon las soluciones indicadas realizando
preincubacin a cada tubo durante tres minutos a
37C. Cumplidos los tres minutos con una diferencia

10 12

RESULTADOS

Fig 2. Grafica de A vs pH

0.1

pH

BLANCO

0.2

3.

CONCENTRACIN

0.3

ABSORBANCIA

0.3

TUBO (mL)
blanco

Temperat
ura
Ex.
Enzima
FAL
Absorba
ncia
405nm

Agua

ABSORBANCIA

0.04

0.25

0.08

0.66

0.12

1.2

0.2

1.27

Tabla 4. Concentracin de las muestras segn absorbancia.

Para la Muestra Problema, se obtuvo una absorbancia de 0.83.
Calculando con la le Beer-Lambert, se obtiene una
concentracin aproximada de 0.11 mM.
Para determinar la mxima actividad con variaciones del pH,
se midi la absorbancia de cada tubo con pH distintos,
consignados en la siguiente tabla.
ABSORBANCIA

pH

BLANCO

0,3

0,165

3,4

0,321

8,8

0,328

9,2

0,438

9,6

0,239

10,4

0,125

10,8

Tab 5. Absorbancia de p-nitrofenol en diferentes pH.

Se concluye que el pH ptimo para la fosfatasa es de 9.6,
evidenciando la actividad alcalina de la enzima.
Al evaluar la actividad enzimtica al variar la temperatura, se
obtuvo una mxima absorbancia de 0.279 a una temperatura
de 37 C, valor aproximado a la temperatura corporal normal.
ABSORBANCIA

TEMPERATURA

BLANCO

25

0,08

0,204

30

0,279

37

0,189

50

0,112

100

Tab 6. Absorbancia de p-nitrofenol en diferentes temperaturas.

DISCUSIN DE RESULTADOS
Los resultados de la prctica experimental pese a que fueron
precisos, son susceptibles a errores; esto se debe
principalmente a errores humanos, dados por un inexperto
manejo de los equipos y mala calibracin de los mismos por
parte de los estudiantes, posibles fallas en el espectrofotmetro
debido a su tiempo de uso, posibles errores debido a la
prdida de calor al llevar el tubo del bao de mara al
instrumento y la falta de control sobre el tiempo que pasaron
las soluciones expuestas al calor. No obstante, la prctica fue
considerada como satisfactoria, ya que permiti relacionar el
pH y la temperatura con la actividad de la fosfatasa alcalina,
as como relacionarlo con su efecto en el cuerpo humano.
En el cuerpo humano, la fosfatasa alcalina est presente
principalmente en las membranas plasmticas de osteoblastos,

clulas del hgado, rin, bazo y placenta y su papel principal

est asociado a la desfosforilacin de nucletidos y protenas.
Mediante la prctica experimental su pudo determinar que la
temperatura ptima para la fosfatasa alcalina corresponde a
37 C, lo que en el organismo del hombre se considera la
temperatura normal. Cuando dicha temperatura aumenta los
niveles de esta enzima aumentan y con ello su actividad, lo
que a largo plazo puede indicar infeccin de la va biliar,
neoplasia heptica, tuberculosis miliar, linfoma, hipernefroma,
mononucleosis o citomagalovirus.
El pH ptimo para la fosfatasa alcalina es de 9.6, ya que es el
punto donde existe la mayor absorbancia esto debido a que la
enzima funciona mejor en medios alcalinos, esto se debe a la
influencia del pH en el estado de ionizacin de los grupos
funcionales en la molcula de enzima y el sustrato. El pH
tiene una relacin intrnseca con el lugar donde se encuentra la
fosfatasa alcalina en el cuerpo ya que como su nombre lo dice
acta en un medio alcalino (pH ptimo 8,6 a 9,1), est
normalmente presente en la sangre y los tejidos con cantidades
ms altas de FA abarcan el hgado, las vas biliares y los
huesos.
CONCLUSIN
Con los resultados obtenidos durante la prctica, se observa
que son satisfactorios al cumplir parcialmente con los valores
aceptados de absorbancia para cada concentracin de pnitrofenol, y por variar al cambio de pH al reflejar una mxima
absorbancia en un pH de 9.6. Los valores de temperatura del
medio en el que se encuentra la enzima y la absorbancia
reflejan una actividad enzimtica alta a los 37 C, valor
cercano a la temperatura corporal.
REFERENCIAS
[1] J. Diaz, Portillo. M.T, Fernandez del barrio. F. P,
Salido.Aspectos bsicos de bioqumica clnica. Madrid Estaa.
1997.
[2] Solrzano Martha. Prcticas de laboratorio Metabolismo.
Universidad del Valle. Facultad de salud. Departamento de
Ciencias fisiolgicas. Cali, 2016.
[3] Lehninger,A. Principios de bioquimica- Enzimas.
Ediciones Omega, S.L., 2014