BIOQUIMICA 1

TRABAJO PRÁCTICO: Actividad y Estabilidad Enzimática

Objetivos:
En este trabajo práctico se desea evaluar el efecto del pH sobre la cinética y sobre la estabilidad de la
enzima fosfatasa ácida comercial. Familiarizarse con la utilización de buffers de distintos pH para determinar el pH óptimo
para la actividad de dicha enzima.
Introducirse al concepto de “condiciones óptima de una reacción enzimática”. Expresar los resultados
experimentales de manera gráfica para una mejor interpretación.

Introducción
Las enzimas son catalizadores proteicos, que aceleran la velocidad de una reacción bioquímica. Estas
reducen la energía de activación, que es esencial para el inicio de cualquier tipo de reacción química. Con un
requisito de bajo consumo de energía para la activación, la reacción tiene lugar más rápidamente. El rendimiento
global de una enzima depende de varios factores, tales como la temperatura, el pH, los cofactores, los activadores y
los inhibidores. Es posible que tener una idea sobre el efecto del pH sobre las enzimas, pero ¿por qué y cómo el pH
y la temperatura afectan las enzimas? En este Trabajo práctico se pone de manifiesto la actividad de la enzima con
la referencia al cambio en el nivel de pH.

La velocidad de una reacción química y/o la actividad de la enzima, está muy influenciad por la estructura
de la enzima. En otras palabras, un cambio en la estructura de la enzima afecta a la velocidad de reacción. Cuando
se producen los cambios de pH de un medio en particular, esto conduce a la alteración en la forma de la enzima. No sólo
en las enzimas, el pH puede afectar también a las propiedades de la carga y la forma del sustrato. Dentro de un rango
estrecho de pH, los cambios en las formas estructurales de las enzimas y los sustratos, pueden ser reversibles.
Pero para un cambio significativo en los niveles de pH, la enzima y el sustrato pueden someterse a la
desnaturalización. En tales casos, no pueden identificarse y por consiguiente, no habrá reacción como tal. Esta es la
razón de por qué el pH afecta la actividad enzimática.

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La conexión entre el pH y las enzimas y/o los efectos del pH sobre las enzimas, es que todas y cada una
de las enzimas se caracterizan por un pH óptimo. En ese pH específico, una enzima en particular cataliza la reacción
al nivel más rápido, que en cualquier otro nivel de pH. Por ejemplo, la enzima pepsina (una enzima proteasa) que
cataliza las proteínas, es más activa a un pH ácido, mientras que la enzima tripsina (otra enzima proteasa), se
comporta mejor en un pH ligeramente alcalino. Por lo tanto, el pH óptimo de una enzima, es diferente al de la otra
enzima.

Cuando estudiamos el pH, se define claramente como la medida de la naturaleza ácida o alcalina de una
solución. Para ser más precisos, el pH indica la concentración de los iones de hidrógeno disueltos (H+) en
una solución en particular. Un aumento o una disminución en el pH, cambia la concentración de los iones en la solución.
Como se menciona anteriormente, estos iones alteran la estructura de las enzimas y/o del sustrato, ya sea debido a la
formación de los enlaces adicionales o la rotura de los enlaces ya existentes. A veces, incluso puede no haber ninguna
reacción en absoluto cuando se producen los cambios en la estructura del sitio activo y el sustrato. Por lo tanto, para
que la reacción química tenga lugar, es necesario ajustar el pH de la solución de tal forma, que es adecuada tanto para
la enzima, como para el sustrato y de esta forma, los efectos del pH sobre la actividad de las enzimas, se puede
estudiar en la práctica.

La velocidad de las reacciones enzimáticas también se ve afectada por los cambios de temperatura, por lo
general aumenta con el aumento de la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y activa. La
actividad enzimática máxima se alcanza a una temperatura óptima, luego la actividad decrece y finalmente cesa por
completo a causa de la desnaturalización térmica progresiva de la enzima.

A bajas temperaturas, las reacciones disminuyen mucho o se detienen porque decrece la cinética
molecular, pero la acción catalítica reaparece cuando la temperatura se eleva a valores normales para la enzima. No
olvidar que una enzima humana típica posee su óptimo a 37 º C, en cambio otros organismos como, por ejemplo, las
bacterias termófilas resistentes a altas temperaturas tienen su óptimo de actividad cercano a los 80º C.

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Desarrollo experimental

Efecto del pH en la actividad enzimática de la Fosfatasa Ácida: La fosfatasa ácida cataliza la hidrólisis
de ésteres fosfato (monoésteres fosfóricos y pirofosfatos). Para cuantificar su actividad biológica se utiliza un
sustrato no biológico, el p-nitrofenil fosfato (PNFP).

Para determinar la velocidad inicial, se mide la liberación de PNF. El PNF en medio alcalino (NaOH 0.2 N)
se ioniza, quedando la molécula con una carga negativa deslocalizada. El compuesto resonante es de color amarillo
y presenta un máximo de absorción a 405 nm (Ɛ400=15.23 cm-1mM-1). La reacción se lleva a cabo en buffer KAc
0.2M (pH 5.6) a 30 ºC.

Soluciones:
Buffer KAc 1M pH 4
Buffer KAc 1M pH 5.6
Buffer Tris HCl 1M pH 9
Agua destilada
PNFP 7mM (disuelto en agua)
Fosfatasa ácida 0.5mg/ml

Procedimiento:
¡¡Se preincuba la mezcla de reacción (M) sin enzima!! a 30ºC por 5 minutos (ver tabla).
A tiempo cero se adicionan 50 µl de enzima.
A intervalos de 3 minutos se toman 200 µl de mezcla de reacción y se agregan sobre un tubo conteniendo
1,0 ml NaOH 0,2N. Tomar al menos 5 puntos (3, 6, 9, 12 y 15 minutos).

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Mezcla de reacción (MR) M1 M2 M3 Concentración

pH = 4 pH = 5,6 pH = 9 final en MR
Buffer KAc 1M pH 4 280 µl - -
Buffer KAc 1M pH 5,6 - 280 µl -
Buffer Tris HCl 1M pH 9 - - 280 µl
Agua destilada 870 µl
PNFP 7mM (disuelto en 200 µl
agua)
Fosfatasa ácida 0,5mg/ml 50 µl
Volumen final

Realizar las curvas de producto vs. tiempo a los distintos pH y determinar las velocidades iniciales (V0).
Graficar V0 vs. pH. Analizar los resultados y estimar el pH óptimo.

Cuestionario

a) ¿Qué precauciones debe tener cuando se eligen los tiempos de medida?

b) ¿Qué concentraciones de PNFP debería ensayar para determinar los parámetros cinéticos de la
enzima?
c) ¿Qué condiciones se deben cumplir para que la medida corresponda a una velocidad inicial? ¿Es
importante que la medida sea de una velocidad inicial? En experiencias anteriores, se ha determinado que aun
habiéndose consumido un 7% del total del sustrato original, la relación [producto] vs tiempo se mantiene lineal.
¿Cómo se determina este porcentaje?
d) ¿De qué manera analizará los datos que se obtengan de la experiencia?
e) ¿Qué forma espera para la curva [P] vs. t?
f) El método de detección del producto es espectrofotométrico. ¿Es necesario preparar blancos? De ser así
¿cuál es la utilidad de los mismos y cómo los incorpora al análisis de los resultados?
g) ¿Para qué se utiliza el NaOH? ¿Podría prescindir su uso? Justifique.