TEMA-5.-ESPECTROMETRIA-DE-FOTOLU...

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Química Analítica II

2º Grado en Farmacia

Facultad de Farmacia
Universidad Complutense de Madrid

Reservados todos los derechos.

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 TEMA 5. ESPECTROMETRÍA DE FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR: FLUORESCENCIA y
FOSFORESCENCIA

INTRODUCCIÓN

Los procesos luminiscentes son aquellos en los que se produce emisión de REM por parte de la
materia previa absorción de energía. La energía absorbida puede ser de muy diversa naturaleza.

➢ Fotoluminiscencia

En la fotoluminiscencia la energía absorbida es radiación UV-Vis.

En la fluorescencia y en la fosforescencia la excitación tiene lugar por absorción de fotones. La

fluorescencia difiere de la fosforescencia en que las transiciones electrónicas responsables de la
fluorescencia no implican un cambio en el espín del electrón. La fluorescencia tiene una vida
más corta, cesando la luminiscencia casi de forma inmediata al abandonar la fuente de
excitación.

Las emisiones de fosforescencia implican un cambio en el espín del electrón, lo cual hace que
la luminiscencia sea detectable durante un intervalo de tiempo mayor.

En la mayoría de los casos, la fotoluminiscencia (tanto para fluorescencia como para

fosforescencia) tiene una longitud de onda más larga que la radiación empleada en la
excitación.

➢ Ventajas de los métodos luminiscentes

o Elevada sensibilidad
o Gran intervalo lineal de concentraciones
➢ Inconveniente: Métodos menos aplicables que los de absorción, debido al limitado
número de sistemas químicos que pueden producir luminiscencia.

TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA Y DE LA FOSFORENCIA

DOS ETAPAS LA FOTOLUMINISCENCIA

1. Excitación por absorción de luz.
2. Desactivación, incluyendo emisión de luz.

DESPLAZAMIENTO DE STOKES
Generalmente la fotoluminiscencia presenta longitudes de onda más largas que la radiación
absorbida. No obstante, si la radiación absorbida es emitida sin cambio en la longitud de onda o
frecuencia, lo que se produce es un fenómeno de radiación de resonancia.

ESPÍN DEL ELECTRÓN. ESTADOS SINGLETES Y TRIPLETE

Cuando uno de los electrones de una molécula es excitado a un nivel de energía superior, da
lugar a un estado singlete o triplete.

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 • El estado triplete es menos energético que el correspondiente estado excitado singlete.
• Una transición singlete/triplete es muy poco probable (prohibida)
• En ciertas moléculas un estado triplete puede ser ocupado desde un estado singlete a
través de un cruce entre sistemas.
• Las propiedades de una molécula en el estado excitado singlete difieren
considerablemente de las de una molécula en el estado excitado triplete (s:

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diamagnética; t: paramagnética).

PROCESOS DE DESACTIVACIÓN
Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental por una combinación de varias
etapas:

• Etapas que implican procesos no radiantes: Relajación vibracional, conversión interna,

conversión externa y cruce entre sistemas.
• Etapas que implican procesos radiantes: Fluorescencia y fosforescencia.

DIAGRAMA DE JABLONKSY

➢ Procesos de desactivación no radiantes

o Relajación vibracional: el electrón puede volver a cualquiera de los niveles
vibracionales de dicho estado fundamental, cayendo al nivel más bajo por
posteriores relajaciones vibracionales. Como consecuencia de la relajación
vibracional, la fluorescencia se desplaza a longitudes de onda mayores respecto
a la banda de absorción.
o Conversión interna: procesos intermoleculares por los que la molécula pasa a
un estado electrónico de más baja energía sin emisión de radiación. Son
procesos muy eficaces.
o Conversión externa: proceso de desactivación por interacción y transferencia de
energía entre la molécula excitada y el disolvente u otros solutos.
o Cruzamiento de sistemas: el que el espín de un electrón excitado se invierte
dando lugar a un cambio en la multiplicidad de la molécula. Después de un
cruzamiento de sistemas a un estado triplete excitado, la desactivación puede
producirse por conversión interna, externa o por fosforescencia.

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Química Analítica II
Banco de apuntes de la
 ➢ Procesos de desactivación radiantes
o Fluorescencia: relajación con emisión de luz desde el nivel más bajo de energía
vibracional de un estado singlete excitado a cualquier nivel vibracional del
estado singlete fundamental.
o Fosforescencia: relajación con emisión de luz desde el nivel más bajo de energía
vibracional de un estado triplete excitado a cualquier nivel vibracional del

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estado singlete fundamental.

EFICACIA CUÁNTICA

𝑛º 𝑚𝑜𝑙é𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑞𝑢𝑒 𝑒𝑚𝑖𝑡𝑒𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎

𝜙=
𝑛º 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙é𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑒𝑥𝑐𝑖𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠
Cálculo de la eficacia cuántica fluorescente a partir de las constantes de velocidad relativas:
𝑘𝑓
𝜙=
𝑘𝑓 + 𝑘𝑛

• Kf velocidad del proceso fluorescente: probabilidad de que la molécula excitada pierda

el exceso de energía por fluorescencia.
• Kn velocidad de los procesos no fluorescentes: probabilidad de que la molécula excitada
pierda el exceso de energía por mecanismos diferentes (r. vibracional, c. interna, c.
externa, cruce entre sistemas, predisociación, disociación).

TIEMPO DE VIDA

La intensidad de fluorescencia decae exponencialmente al cesar la excitación (cinética 1º orden).

𝑡
−
𝐼 = 𝐼0 · 𝑒 𝜏

It: intensidad de fluorescencia a un tiempo t

I0: intensidad de fluorescencia a tiempo cero

τ: tiempo de vida de fluorescencia

LEY DE KAVANAGH

𝑆𝐹 = 𝐾 · 𝐶
CONCENTRACIÓN MÁXIMA
La proporcionalidad entre la señal de fluorescencia y la concentración se cumple siempre que la
concentración no sobrepase un valor máximo.
0,05
𝐶𝑚𝑎𝑥 =
𝜀·𝑏
DESVIACIONES DE LA LEY DE KAVANAGH
• Autoatenuación
• Autoabsorción

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 FACTORES QUE AFECTAN A LA FOTOLUMINISCENCIA
➢ Factores experimentales
o I0, intensidad de la radiación procedente de la fuente de radiación
o b, espesor de la cubeta
o f(α), factor geométrico, ángulo sólido visto por el detector
o f(λ), sensibilidad del detector para cada longitud de onda
o C, concentración del compuesto
o ε, coeficiente de absorción molar del compuesto a la l de excitación
➢ Factores específicos de la sustancia fluorescente o fosforescente
o Estructura molecular
▪ Tipos de tránsitos
• La fluorescencia rara vez se observa como resultado de
absorción de radiación UV de λ < 250 nm. Las transiciones
σ→σ* no suelen producir fluorescencia.
• La fotoluminiscencia se restringe a procesos menos energéticos
como son las transiciones π→π* y n→π*.
o Los compuestos con dobles enlaces conjugados:
fluorescencia (tránsito π→π*)
o La transición n→π* favorece el cruce entre sistemas y,
por tanto, la fosforescencia.
▪ Estructura molecular
• Hidrocarburos alifáticos saturados (σ→σ*): no producen
fotoluminiscencia.
• Hidrocarburos alifáticos insaturados:
o Con dobles enlaces aislados: fluorescencia débil.
o Con dobles enlaces conjugados: alta fluorescencia.
• Hidrocarburos aromáticos (π→π*): alta probabilidad de
fluorescencia. La condensación de anillos favorece la
fluorescencia y disminuye la fosforescencia.
▪ Rigidez molecular: favorece la fluorescencia.
▪ Sustituyentes
• Sustituyentes dadores de electrones: favorecen la
fluorescencia.
• Sustituyentes aceptores de electrones: disminuyen o inhiben
la fluorescencia.
• Efecto del átomo pesado interno:
o Inhiben fluorescencia.
o Aumentan la probabilidad de fosforescencia.
• Grupos carbonilos o átomos de nitrógeno en moléculas
aromáticas: favorecen fosforescencia.
o Factores ambientales
▪ Temperatura: Al aumentar la T, disminuye eficacia cuántica de procesos
fotoluminiscentes.

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 ▪ Disolvente: Al aumentar la viscosidad del disolvente se favorece la
fluorescencia y la fosforescencia
• Fluorescencia
o Por tránsito n→π*: favorecida en disolventes polares
o Por tránsito π→π*: favorecida en disolventes apolares
• Fosforescencia: efecto del átomo pesado externo. Disolventes

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con átomos pesados favorecen la fosforescencia.
▪ Efecto del pH: los compuestos fotoluminiscentes y que tengan carácter
ácido-base, pueden presentar diferentes λemisión y señal
fotoluminiscente para sus formas ionizada y no ionizada.

▪ Efecto del oxígeno disuelto: la presencia de oxígeno disuelto disminuye

la fluorescencia debido a sus propiedades paramagnéticas, que
favorecen el cruce entre sistemas con posterior conversión externa.
▪ Influencia de agentes amortiguadores (Quenchers): la señal de
fluorescencia de una sustancia puede ser menor en presencia de otras.
𝐹𝑜
= 1 + 𝐾𝑒 · [𝐴]
𝐹𝐴
Fo: SF en ausencia de amortiguador
FA: SF en presencia de amortiguador
Ke: cte de amortiguación
A: concentración de amortiguador

INSTRUMENTACIÓN

FLUORIMETRÍA
➢ Diseño especial: ángulo recto entre fuente y detector

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 ➢ Selector de λ
o Tipos de instrumento en función del selector de λ
▪ Filtros interferenciales: en fluorímetros

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▪ Monocromadores: espectrofluorímetros

o Hay dos selectores:

▪ El primero aísla la REM de excitación.
▪ El segundo aísla la REM de fluorescencia emitida.
➢ Fuentes: alta intensidad
o Lámpara de vapor de mercurio (fluorímetros): fuente de líneas.
o Lámpara de arco de xenón (espectrofluorímetros): proporciona un espectro
continuo.
o Lámpara de láser: haz de luz monocromático de alta intensidad. Se emplea
cuando se requiere alta sensibilidad.
➢ Espectros de excitación y emisión
o Espectro de excitación: se mantiene fija la λ de emisión y se varía la λ de la REM
de excitación. Del espectro se obtiene λexcitación óptima.
o Espectro de absorción: se mantiene fija la λ de excitación y se varía la λ de
emisión. Del espectro se obtiene λemisión óptima.
Desplazamiento de Stokes
𝜆𝑒𝑥𝑐𝑖𝑡𝑎𝑐𝑖ó𝑛 < 𝜆𝑒𝑚𝑖𝑠𝑖ó𝑛

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 FOSFORIMETRÍA
La fosforescencia se observa preferiblemente a bajas temperaturas, en medios altamente
viscosos, o en condiciones que protejan especialmente el estado triplete.

➢ Fosforímetro
o El dispositivo irradia la muestra y después de un tiempo adecuado se mide la
intensidad de fosforescencia.
o Introducción de la muestra:
▪ En N2 líquido (77 K)
▪ Adsorbida en soporte rígido (papel de filtro)
▪ En medios micelares
o Instrumentación similar a los espectrofluorímetros
➢ Componentes adicionales
o Fosforoscopio u obturador rotatorio: permite irradiar la muestra de forma
alternada para poder diferenciar la fosforescencia de una posible emisión
fluorescente.
o Vaso Dewar: recipiente diseñado para proporcionar aislamiento térmico. Se
puede introducir:
▪ N2 líquido
▪ Muestra solidificada tras ser disuelta en disolvente orgánico

APLICACIONES

MÉTODOS FLUORIMÉTRICOS
➢ Muestras a analizar
o Sustancias con fluorescencia nativa.
o Sustancias que desarrollen fluorescencia mediante tratamiento fisicoquímico.
o Compuestos no fluorescentes que se unen a un marcador fluorescente.
➢ Áreas de aplicación
o Química analítica
o Fármacos y drogas
o Estudios medioambientales
o Análisis de alimentos
➢ Sustancias inorgánicas:
o Determinación directa: compuestos de uranilo.
o Formación de quelatos fluorescentes: algunos cationes metálicos
o Determinación indirecta: aniones CN- y F-.
➢ Sustancias orgánicas: Hay una amplia variedad de compuestos que pueden
determinarse con alta sensibilidad (ppm-ppb).

MÉTODOS FOSFORIMÉTRICOS
• Aplicaciones menos numerosas (limitación de trabajo a bajas temperaturas y poca
precisión en las medidas)
• Técnica sensible y selectiva
• Compuestos fosforescentes: adenina, antraceno, aspirina, ácido benzoico, cafeína,
cocaína, piridina, sulfonamidas, triptófano.
• En sangre sólo el triptófano presenta fosforescencia: se puede emplear la fosforimetría
para el análisis selectivo de cantidades traza de fármacos/drogas.

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 COMPARACIÓN DE MÉTODOS FOTOLUMINISCENETES VS ABSORCIOMÉTRICOS

UV-VIS
Absorciometría UV-VIS Fluorimetría Fosforimetría
Sensibilidad + ++ +++
Linealidad + ++ +++
Selectividad + ++ +++

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Versatilidad +++ ++ +
Precisión +++ ++ +
Sencillez +++ ++ -

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