Quimioluminiscencia e Inmunofluorescencia

Quimioluminiscencia
‡ La quimioluminiscencia se produce cuando una reacción química genera una especie electrónicamente excitada, que emite luz cuando vuelve al estado fundamental o que transfiere su energía a otra especie que, posteriormente, da lugar a una emisión. (Skoog et al, 2001)

Graw Hill. Principios de Análisis Instrumental 5ta. Editorial Mc. Edición. Madrid España .Skoog et al (2001).

Aplicaciones analíticas ‡ Estos métodos generalmente tienen una elevada sensibilidad. . ya que en ausencia de ruido. se miden bajos niveles de radiación.

. ‡ Es común llevar a cabo una reacción enzimática previa. donde el analito a determinar es el sustrato y los productos de la reacción enzimática se detectan por quimioluminiscencia.Análisis ‡ Para aumentar la selectividad del analito se determinan primero los que no participan en la reacción.

pruebas de aglutinación y análisis dotblot son las más utilizadas.Caso Clínico: Detección del VIH ‡ ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent assay). EIA). especialmente el ELISA que también se denomina análisis inmunoenzimático (abreviado. .

tipo sandwich y de captura. dentro de los primeros los indirectos son más sensibles que los competitivos y éstos mas específicos que aquellos. Los dos últimos suelen ser los más sensibles y específicos.Prueba de ELISA ‡ El antígeno puede proceder del lisado viral de un cultivo (como en los primeros EIA disponibles que se llamaron de 1ª generación) o bien de proteínas recombinantes o péptidos sintéticos de 10-50 aminoácidos específicos del VIH (que se han calificado como EIA de 2ª. . y de 3ª. Según su diseño para reconocer la presencia de anticuerpos se habla fundamentalmente de cuatro tipos de EIA diferentes: indirecto. generación). competitivo.

Proceso ‡ La muestra. . éstos se unen con el antígeno formando un complejo que se pone en evidencia mediante una reacción enzimocromática que puede ser visualizada a simple vista o medida con un fotómetro. Por lo general. a un componente vírico que actúa como antígeno. suero normalmente. Si en el suero existen anticuerpos específicos. la muestra es positiva cuando se desarrolla color. en las técnicas ELISA no competitivas. se enfrenta en un soporte. generalmente un pocillo de una placa de microtitulación.

Inmunoflourescencia .

qb.inmunoquimica.fcen.uba.ar .Propiedad de algunas sustancias Luminiscencia o fotoluminiscencia: Almacenar energía luminosa y liberarla posteriormente como energía luminosa Fosforescencia: Períodos de almacenamiento largo con emisión mucho después de cesada la excitación Fluorescencia: Períodos de almacenamiento cortos 10-7 ² 10-9 seg y emisión www.

A causa de la disipación de energía durante el estado excitado. la energía de este fotón es menor.qb. www.inmunoquimica. Consecuencias: La energía de S1· es parcialmente disipada produciendo un estado excitado relajado desde el que se emite la fluorescencia. pasando a un estado electrónico excitado S1· 2°: Duración del estado excitado: existe por un período de tiempo finito (típicamente 1-10 x 10-9 segundos). existen otros procesos. 3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite.fcen.Fluorescencia Es el resultado de un proceso en tres etapas que ocurre en algunas moléculas (fluoróforos) Diagrama Jablonski 1°: Excitación: se entrega un fotón de energía por una fuente externa a un fluoróforo que absorbe.ar .uba. ya que la emisión del fluoróforo permite distinguirse del background. no todas las moléculas inicialmente excitadas del estado 1 vuelven al estado S0 por fluorescencia. La diferencia de energía es llamada ´Stokes shiftµ (h EX ² h EM) que es fundamental para la sensibilidad de las técnicas de fluorescencia. sufre cambios conformacionales y puede interaccionar con su ambiente molecular. lo que permite el retorno al fluoróforo al nivel S0.

qb. Los espectros de absorción y de fluorescencia de un fluoróforo en general están próximos (P más cortas y P más largas respectivamente). aunque también de la fuente de excitación (comúnmente un láser de ion argón.ar . El ancho de banda del espectro es un parámetro importante para cuando dos fluoróforos son detectados simultáneamente. Para moléculas poliatómicas en solución las transiciones electrónicas son reemplazadas por un espectro de energía llamado espectro de excitación de fluorescencia y de emisión.uba.Espectro de Fluorescencia El mismo fluoróforo puede ser repetidamente excitado y detectado. www.inmunoquimica.fcen. Esto es importante en la elección de los filtros. Para una intensidad satisfactoria de fluorescencia es preciso que se utilicen como excitadoras radiaciones de longitud de onda correspondientes a los máximos de absorción del fluoróforo. La intensidad de emisión es proporcional a la amplitud del espectro de excitación a la longitud de onda de excitación. La intensidad de la señal depende de los mismos parámetros que la absorbancia. El espectro de emisión de fluorescencia es independiente de la longitud de onda a la cual se excita. longitud de 488 nm) y de la eficiencia de recolección del detector.

uba. si se utilizan dos con el mismo espectro de excitación pero distinto espectro de emisión. en el retorno.inmunoquimica. se pueden medir dos características al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores).qb. al no rotar no emite calor y sí luz) Rodamina 6G Rodamina B Isotiocianato fluoresceína Fluoresceína Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y excitación característicos. www.ar .fcen.Fluoróforos Generalmente son compuestos heterocíclicos o hidrocarbonos poliarómaticos: moléculas rígidas (varios niveles a los cuales pueden ser excitados.

inmunoquimica. Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia.Inmunofluorescencia Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos. exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos. inmunofluorescencia) www.fcen. frotis de microorganismos o de células.uba.ar . o cultivo de tejidos en capa única. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o una enzima que cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia Clínica (Diagnósticos) Utilidades Investigación (inmunohistoquímica.qb.

Alta sensibilidad Detección universal Vida media alta Alta resolución Múltiples pasos. Biotinas endógenas.Elección de marcado para inmunoensayos Marcado Método de detección Ventajas Desventajas Enzimático sustratos cromogénicos detectados por abs Avidina/ Estreptavidina acoplada a marcadores Excitación en UV y emisión en el visible detección en micro fluorescencia Vida media alta. Enzimas endógenas Biotina Vida media alta.uba. Alta sensibilidad Múltiples pasos.fcen. Fluorescencia Autofluorescencia quenching Método enzimático Sensibilidad Resolución Método fluorescencia www.qb.inmunoquimica.ar .

uba.fcen.ar .inmunoquimica. mucho Ac 1º) Señal poco amplificada Es necesario purificar el Ac El Ac puede perder afinidad Se necesitan muchos pasos de tinción Con ag múltiples se necesita que los Ac 1º sean de distintas especies www.Inmunofluorescencia directa Utiliza un solo anticuerpo Inmunofluorescencia indirecta Utiliza un 2° anticuerpo conjugado Anticuerpo 2° Anticuerpo 1° Antígenos Anticuerpo 1° Antígenos Ventajas Se necesitan pocos pasos Menos problemas de background Posibilidad de doble marcación El mismo anticuerpo conjugado se utilizan para distintas reacciones Son comerciales Se evita la disminución de afinidad del Ac 1° Desventajas Menor sensibilidad (nec.qb.

uba.Lavados en Koplin .qb.ar .Lavados -Montar con PBS Importante: Permeabilizar Tb se fija con formamida y se permeabiliza con Tritón X100 www.Secar y fijar con metanol frío 30· .Agregado de Ac 1° e incubación .inmunoquimica.Agregar el Ac 2° conjugado a fluorocromo e incubar .Lavado de células -Resuspender el pellet y hacer frotis .Lavado de células -Bloqueo con suero normal de la especie del Ac 2° .Resuspender el pellet .Inmunofluorescencia de superficie Inmunofluorescencia citoplasmática .Agregar el Ac 2° conjugado a fluorocromo e incubar en cámara húmeda .Agregado de Ac 1° e incubaciónen cámara húmeda .fcen.Lavados .Lavados .Hacer el frotis en porta .Secar y fijar con metanol frío 30· -Hidratar los portas en PBS 30· -Bloqueo con suero normal de la especie del Ac 2° .

T. MOYA y MISAEL CHINCHILLA ‡ Departamento de Parasitología. BONILLA. A.Caso Clínico ‡ ESTUDIO SEROLOGICO POR INMUNOFLUORESCENCIA DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EN COSTA RICA ‡ LILIANA REYES. Facultad de Microbiología y Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales. . Universidad de Costa Rica.

La técnica de IF se realizó según Camargo.Metodología ‡ Se analizaron 1. pero la mayoría de las muestras (47%) fueron pacientes entre 20 y 39 años (Tabla 1). Sweden. . Un 19% correspondía a personas menores de 9 años. utilizando anti-IgG humana marcada con fluoresceína (SBL National Bacteriological Laboratory. cruzi (cepa CR4). de estudiantes de la provincia de Limón y de la Facultad de Microbiología de la Universidad de Costa Rica.073 sueros obtenidos por punción venosa de pacientes (470 hombres y 603 mujeres). ‡ El antígeno para IF se obtuvo de epimastigotos de T. molar F/P ratio = 4.3. Lot N° SH 803905-1). cultivados en medios de Schneider. Se consideraron como positivas aquellas muestras con títulos de 1:32 o más. atendidos en la consulta externa de diversas clínicas de Costa Rica.

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encontrándose la menor (0.9%.1% en la población general.2% de positividad. La mayor positividad se presentó en la provincia de San José con 3.Resultados ‡ La Tabla 2 muestra un porcentaje de positividad de 2. once eran mayores de 30 años y los dos restantes tenían entre 20 y 30 años. . Con respecto a la edad. mientras que en Puntarenas se obtuvo un 1.5% de pacientes positivos.6% seguida de Guanacaste con 1. Las provincias de Alajuela.8%) en Heredia. Cartago y Limón presentaron 1. nueve se hallaban entre los 10 a 20 años. ‡ De los veintitrés pacientes positivos 15 eran mujeres y 8 varones.

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