Fluorescencia

UNAM

Dra. Guadalupe Pérez Caballero

Fluorescencia y fosforescencia

Fluorescencia y
fosforescencia
son fenómenos
de emisión de luz
 Fosforescencia
La Fosforescencia es
el fenómeno en el
cual ciertas
sustancias tienen la
propiedad de
absorber energía y
almacenarla, para
emitirla
posteriormente en
placton fosforescente
forma de radiación
 Fluorescencia

Fluorescencia es la
propiedad que tienen
algunas sustancias de
absorber energía y
luego emitir parte de
esa energía en forma
de luz

Microscopio fluorescente
¿Cuál es la diferencia?
Diferencia entre fluorescencia y la fosforescencia

En la fosforescencia, a
diferencia de la fluorescencia,
las sustancias continúan
emitiendo luz durante un
tiempo mucho más
prolongado, aún después del
corte del estímulo que la
provoca, ya que la energía
absorbida se libera lenta y
continuamente (incluso
muchas horas después)
Espectroscopia de Fluorescencia
Molecular

Proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la

absorción de radiación electromagnética.
Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando
su exceso de energía en forma de fotones.
Ventaja más atractivas de este método es su sensibilidad inherente,
la cual es, con frecuencia, de uno a tres órdenes de magnitud mejor
que la de la Espectroscopia de absorción.
No obstante, este método se aplica mucho menos que los de
absorción debido al número relativamente limitado de sistemas
químicos que se pueden hacer fluorescer.
TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA

MOLECULAR
 Espectrometría de fluorescencia
La espectrometría de fluorescencia es un tipo de espectroscopia
electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra.
Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los
electrones de las moléculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz
de una menor energía, generalmente luz visible.
 INTRODUCCIÓN
• Principio de exclusión de Pauli: en un átomo no puede haber no puede
haber 2 e-s con los 4 números atómicos iguales.
• Por tanto, sólo hay 2 e-s por orbital y de espines opuestos.
• Lo que implica que la mayoría de las moléculas no tengan campo
magnético lo que resulta en que sean repelidas por campos magnéticos
y que sean DIAMAGNÉTICAS.
• Estado Singulete: Estado electrónico con e-s apareados y no tiene lugar
ningún desdoblamiento del nivel de energía cuando se exponen a un
campo magnético .
• Por el contrario, las especies con los e-s desapareados (radicales libres)
poseen un momento magnético por lo que son atraidas por un campo
magnético y son PARAMAGNÉTCAS.
• Estado Triplete: Estado electrónico con e-s desapareados y por tanto
están paralelos.
• Transición triplete/singulete (o viceversa) es menos probables que una
singulete/singulete .
 Introducción

spines
paralelos

estado singulete estado singulete estado triplete

fundamental excitado excitado
 e- en nivel energético
superior con espines
molécula en estado opuestos
fundamental SINGLETE

h
SINGLETE

e- en nivel energético
superior con espines
paralelos

TRIPLETE
 níveles vibracionales de
los estados excitados

Diagrama de niveles de energía parcial de un sistema fotoluminiscente

Excitación
(absorción)
10-15 s
 Mecanismos de Relajación
Normalmente, el tiempo de vida media de una especie excitada es breve
porque hay diversas formas en las cuales un átomo o una molécula excitada
libera su exceso de energía y se relaja a su estado fundamental.

Dos de los más importantes de estos mecanismos son la relajación

(desactivación) no radiante y la relajación fluorescente.

Relajación vibracional
Relajación no radiante

Conversión interna
 Mecanismos de Relajación no radiantes (10-12 s)
Relajación vibracional: (flechas onduladas cortas entre los
niveles de energía vibracionales), el exceso de energía
vibracional se pierde inmediatamente como consecuencia
de las colisiones entre moléculas excitadas y las moléculas
del disolvente. Durante estas colisiones el exceso de
energía vibracional se transfiere a las moléculas del
disolvente. La ganancia de energía vibracional del
disolvente se refleja en un ligero incremento de la
temperatura del medio.
 Mecanismos de Relajación no radiantes (10-12 s)

Conversión interna (IC):

Puede ocurrir que se pase a un estado electrónico de la
misma energía sin emisión de radiación (S-2 a S-1). (Se
produce cuando dos niveles de energía electrónicos están
suficientemente próximos para que haya un solapamiento de los

niveles de energía vibracionales). Desde este estado excitado la

molécula podría volver a su estado basal vibracional.

sin radiación

10-12 s
 Mecanismos de Relajación no radiantes (10-12 s)

Conversión interna (IC):

También la molécula podría pasar de un nivel vibracional
inferior de un estado electrónico excitado al nivel
vibracional superior de otro estado electrónico. Se ilustra
por las flechas onduladas largas.
Fluorescencia: mecanismo de relajación radiante

El proceso de emisión de un fotón desde S1 a So se denomina

fluorescencia es decir cuando las moléculas electrónicamente
excitadas se pueden relajar a cualquiera de los estados
vibracionales del estado electrónico fundamental. Este
fenómeno ocurre inmediatamente después de la excitación (en
aprox. 10-7 a 10-9 s) por lo cual, no es posible percibir visualmente la
emisión de fluorescencia una vez eliminada la fuente de excitación.
 Fosforescencia: mecanismo de relajación radiante
Mientras una molécula está en un estado excitado, puede tener
lugar un cambio de espín en un electrón, con lo que se adquiere el
estado triplete. Este proceso de transformación de un estado
singulete a un estado triplete se denomina cruzamiento entre
sistemas, y la probabilidad de que esto suceda aumenta si los
niveles vibracionales se solapan. Una vez adquirido el estado
triplete, la molécula puede llegar al nivel vibracional inferior
mediante procesos de relajación vibracional, y posteriormente
emitir un fotón para retornar finalmente al estado fundamental.
Esta emisión se denomina fosforescencia.
 Fluorescencia de la quinina

emisión
Fluorescencia

excitación

Longitud de onda (nm)

Debido a que las transiciones entre estados de diferentes
multiplicidades están "prohibidas", la emisión fosforescente se produce
con un cierto retraso respecto a la absorción (entre 10–3 y 10 s).
Por ello, con frecuencia, puede ser observada a simple vista después de
cesar la radiación de excitación. Sin embargo, como consecuencia del
mayor tiempo de vida del estado triplete, los procesos de desactivación
en forma de energía no radiante pueden competir más eficazmente con
la fosforescencia que con la fluorescencia. Por esta razón, la
fosforescencia casi nunca se observa a temperatura ambiente, siendo
necesario operar en condiciones criogénicas para que se reduzca la
probabilidad de desactivación por choques.
 • Transición PERMITIDA FLUORESCENCIA

Estado excitado SINGULETE • Rápido retorno al estado fundamental

• Tiempo de vida 10ns

• Transición “PROHIBIDA” FOSFORESCENCIA

Estado excitado TRIPLETE* • Velocidad de emisión lenta

• Tiempo de vida minutos a horas

*Las transiciones desde el estado singulete fundamental hasta el estado

triplete son muy poco probables; normalmente es necesario pasar a través
del estado singulete excitado*
A modo de resumen, puede decirse que los procesos de
desactivación de una especie en forma de energía no radiante
son los más probables, seguidos de la emisión fluorescente, y los
menos probables son los correspondientes a la fosforescencia.
Esto hace que los métodos absorciométricos sean más
numerosos que los fluorimétricos, y éstos, a su vez, más que los
basados en el empleo de la fosforescencia.
Fluorescencia de S1 a So Tiempo de vida 10-8 a 10-4 s

Fosforescencia de T1 a So Tiempo de vida 10-4 a 102 s

 Desplazamiento de Stokes

Se observa que las bandas de fluorescencia molecular están

formadas principalmente por bandas que tienen longitudes de
onda mayores y, por tanto, energías menores que la banda de
radiación responsable de su excitación. Este fenómeno se conoce
como desplazamiento de Stokes.
En aquellos casos en los que la radiación absorbida sea emitida
sin cambio en la longitud de onda (misma energía) se conoce
como radiación de resonancia o resonancia fluorescente.
Desplazamiento de Stokes
 l excitación / nm
300 350 400

(a)
Espectro de fluorescencia de
antraceno en etanol.
a) Espectro de excitación
b) espectro emisión

(b)

300 350 400

l emisión / nm
Fluorescencia en función de la concentración
La potencia de la radiación fluorescente F es proporcional a la
potencia radiante del haz de excitación que es absorbido por el
sistema:

F = FF (Po – P) (1)

F = Potencia de la radiación de la fluorescente

FF = Eficiencia o rendimiento cuántico de luminiscencia
Po = Potencia radiante incidente en la muestra
P = Potencia radiante que emerge de la muestra.
Fluorescencia en función de la concentración
• De la ley de Beer, sabemos que:
P
=10 bC
Po (2)

Sustiyuyendo (2) en (1):

F = F f Po (1 -10 bC )
Si desarrollamos el término exponencial como una serie de Maclaurin

  2.303 εbC   2.303 εbC  

2 3

F = F f Po  2.303 εbC   
 2! 3! 
Siempre que 2.303  bc < 0.05 podemos despreciar los términos posteriores

F = F f Po (2.303 εbC) Cuando C es suficientemente

F = K' Po 2.303 bC
y si Po se mantiene constante:
elevada como para que el término
2.303 bC sea mayor que 0.05, los
términos de mayor orden de la
serie de Maclaurin no son
despreciables y la linealidad se
pierde.

F=KC
Determinación de galactosa
APLICACIONES DE LOS MÉTODOS DE FLUORESCENCIA

 Los métodos de fluorescencia presentan gran sensibilidad , ya que ésta se

puede incrementar, aumentando la energía del haz de excitación o por la
amplificación de la señal del detector.
 Es de destacar que ninguna de estas opciones mejora la sensibilidad de los
métodos basados en los procesos de absorción porque en la ley de Beer , la
concentración es proporcional al logaritmo de una proporción: -logP0/P=bC

 Al aumentar la energía P0 se incrementa proporcionalmente P y no tiene

efecto sobre la sensibilidad. De manera parecida, incrementando la amplificación
de la señal del detector se influye en las dos magnitudes medidas de forma
idéntica, lo que evita cualquier mejoría.
Determinación fluorimétrica de especies inorgánicas

Los métodos fluorimétricos de determinación de especies inorgánicas

pueden ser de dos tipos:
• Los métodos directos que implican la formación de un quelato
fluorescente y la medida de su emisión y un segundo grupo que se basa en
la disminución de la fluorescencia que resulta de la acción atenuadora de
la sustancia que va a ser determinada. Esta última técnica ha sido más
ampliamente utilizada en la determinación de aniones.
• Los reactivos fluorimétricos que más éxito tienen para el análisis de
cationes son los que presentan estructuras aromáticas con dos o más
grupos funcionales dadores que permitan la formación de quelatos con el
ion metálico.
 Determinación fluorimètrica de especies
orgánicas y bioquímicas

El número de aplicaciones del análisis fluorimétrico a especies

orgánicas es muy elevado. Por ejemplo existen métodos para
la determinación de: enzimas, agentes medicinales,
productos naturales, esteroides, vitaminas, etc.
Sin lugar a dudas, las aplicaciones más importantes de la
fluorimetría están en el campo del análisis de productos
alimentarios, farmacéuticos, muestras clínicas y
productos naturales. La sensibilidad y selectividad del
método lo hace una herramienta particularmente valiosa en
estos campos.
INSTRUMENTACIÓN
 Componentes de un fluorímetro
Filtro o Monocromador Radiación dispersada
de excitación

Fuente Muestra

Fluorescencia

Atenuador Filtro o Monocromador

del haz de emisión

Fotomultiplicador de Fotomultiplicador de la
referencia muestra

Amplificador
diferencial

Dispositivo de lectura
 Los componentes básicos de un fluorímertro son:

1. Fuente de luz de excitación (energía radiante): Se pueden

emplear lámparas de arco de xenón o lámparas de mercurio
2. Rendijas de excitación y emisión: Son iguales a las del
espectrofotómetro (orientan el haz de luz)
3. Monocromadores de excitación: para seleccionar la longitud de
onda de excitación deseada.
4. Monocromadores de emisión: para eliminar las longitudes de onda
emitidas no deseadas
5. Celdas: De sílice o cuarzo. Las de plástico pueden causar
fluorescencia adicional con pérdida de sensibilidad.
6. Detector: Fotomultiplicadores.
Monocromador : Un monocromador selecciona una longitud de onda de
excitación, y la fluorescencia se examina con un segundo monocromador el
cual se coloca de manera que forme un ángulo de 90º con la luz incidente.
Manteniendo fija la lex y haciendo un barrido de la radiación emitida, se
obtiene un espectro de emisión. Si la lem se mantiene constante y se hace
variar la lex, se obtiene el espectro de excitación.

Fuentes: En la mayoría de las aplicaciones se necesita una fuente más

intensa que las lámparas de wolframio o de deuterio utilizadas para la
medida de absorción. Esto se debe a que la magnitud de la señal de
salida, y por tanto la sensibilidad, es directamente proporcional a la
potencia de la fuente P0. Normalmente se utiliza una lámpara de arco de
xenón o de mercurio.
 Fuentes de Radiación

Se requieren fuentes de radiación que emitan

continuamente sobre un amplio intervalo
espectral; generalmente se emplea:

Lámpara de Tungsteno-Halógeno

Lámpara de arco de alta presión de Xenón que

emite de 300 a 1300nm a una temperatura de
6000K

Laser cuando se requieren altas intensidades

para generar la excitación
 Fuentes de Radiación
Fuente Líneas Principales (nm)

Lampara de arco de Hg 366, 405, 436, 546, 578*

Lampara de arco de Xe 250–1000 *
Lampara de Tungsteno-halógeno 350–1000 *
Laser de Cd-He 325, 442
Laser de ion argón 457, 488, 514
Laser de Nd 532
Laser de He-Ne 543, 594, 633
Laser de ion Kr 568, 647

*Fuente continua de luz Dra.

blanca
Gabriela Vargas
Filtros y monocromadores: En los fluorímetros se utilizan tanto los filtros de
interferencia como los de absorción, mientras que los espectrofluorímetros
están equipados con monocromadores de red.

Detectores: La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por

tanto, se necesitan factores de amplificación altos para estas medidas. Los
tubos fotomultiplicadores son los más utilizados como detectores en
instrumentos de fluorescencia sensibles.

Celdas: Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto celdas cilíndricas

como rectangulares fabricadas con vidrio o más normalmente con sílice.
VARIABLES QUE AFECTAN A LA
FLUORESCENCIA
FACTORES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA

o Rendimiento Cuántico

o Estructura molecular

o Temperatura

o Disolvente

o pH
 RENDIMIENTO CUÁNTICO
El rendimiento cuántico o la eficacia cuántica de la fluorescencia es la relación
entre el número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al número total
de moléculas excitadas.

Número de fotones emitidos como fluorescencia

F =
Número de fotones absorbidos

Aumento de la fluorescencia

0 1
0 < F > 1

Los rendimientos cuánticos de fluorescencia y de fosforescencia de una

sustancia pueden medirse fácilmente comparando su emisión con la de
una sustancia patrón de rendimiento cuántico conocido.
 ESTRUCTURA MOLECULAR
• La Fluorescencia ocurre en moléculas aromáticas con
grupos funcionales o con dobles enlaces con conjugación
múltiple, ya que tienen enlaces p deslocalizados que
pueden generar estados singulete de excitación.
• La eficacia cuántica aumenta con el número de anillos y
con su grado de conjugación.
•Los
.
compuestos que contienen estructuras alifáticas y
alicíclicas de carbonilo o estructuras con dobles enlaces
muy conjugados.
• La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no
sustituidos.
 Efecto de la Temperatura

• Al aumentar la temperatura la eficacia cuántica

disminuye, ya que aumenta la frecuencia de las colisiones
entre la molécula excitada y el solvente, lo que
incrementa la probabilidad de desactivación por
conversión externa (desactivación no radiante).
 Efecto del disolvente

• Una disminución en la viscosidad del disolvente aumenta la

probabilidad de conversión externa .

• La fluorescencia de una molécula se reduce en presencia

de disolventes que contienen átomos pesados o de solutos
con dichos átomos en su estructura; como por ejemplo, el
tetrabromuro de carbono y el yoduro de etilo.
 Efecto del disolvente
 En general, un aumento de la viscosidad, aumenta FF

Transiciones p –> p* desplazamiento de

l max hacia el rojo
 Aumento de la polaridad

Transiciones n –> p* desplazamiento de

l max hacia el azul

Solventes con átomos pesados

 Efecto del átomo favorecen tripletes
pesado: FF disminuye
Solutos con átomos pesados
 Efecto del pH

La fluorescencia de un compuesto aromático con

sustituyentes ácidos o básicos en el anillo depende
normalmente del pH. Tanto la l como la intensidad
de emisión son diferentes para la forma ionizada y no
ionizada del compuesto. Por lo tanto será muy
frecuente en los métodos fluorimétricos, el control
estricto del pH.
 Efecto del pH
Compuestos aromáticos con sustituyentes ácidos o básicos en el
anillo dependen del pH. Este fenómeno se asocia por el número de
especies resonantes.
Factores del Compuesto

•Extensión del sistema de electrones p

•Rigidez estructural

•Efecto de átomo pesado interno

•Formación de complejos organometálicos

•Efectos de los sustituyentes

Extensión del sistema de electrones p

•Transiciones p→p* de grupos funcionales.

• Grupos carbonilo en estructuras alifáticas.
• Estructuras con dobles enlaces conjugados
 Rigidez estructural

Entre menor sea la rigidez de una molécula provoca el aumento en KIC

(la constante de conversión interna) y el correspondiente aumento en
la relajación no radiante
 Rigidez estructural
Empíricamente se encuentra que la fluorescencia está particularmente
favorecida en moléculas que poseen estructuras rígidas.
Por ejemplo, las eficacias cuánticas para el fluoreno y el bifenilo están
próximas a 1.0 y 0.2, respectivamente, bajo condiciones similares de medida.

FF=1.0 FF=0.2
 Efecto de los sustituyentes

 Los electrodonadores: -NH2, -NHR, -NR2, -OH, y -OR

aumentan la eficacia de la fluorescencia.

 Los electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y –NO2, reducen

la eficacia de la fluorescencia al introducir una transición n-p *.

 Los grupos sulfónicos no modifican significativamente la

fluorescencia.
Efecto del sustituyente heteroátomo
FLUORESCENCIA
F
RELATIVA

100% Las interacciones

espín orbital
Cl aumentan con
7% estos átomos
provocando el
Br
cambio de espín y
0.2% favoreciendo la
fosforescencia
I

<0.05%