Fluorescencia

Parte 4
Sucede cuando un compuesto fluorescente absorbe luz de alta energía,
provocando que sus electrones se exciten a niveles energéticos superiores.
Cuando estos electrones vuelven a sus estados originales de menor energía,
liberan la energía extra en forma de luz visible.
La fluorescencia es un proceso rápido y generalmente cesa casi
inmediatamente después de que se detiene la fuente de excitación.

Fluoróforos
Son sustancias capaces de fluorescer.
El tipo de transiciones estas sustancias sufren son π*→π y π*→n.
Hay varias características estructurales que están asociadas a la
fluorescencia, entre ellas están las siguientes:
- Compuestos aromáticos.
- Estructura con dobles enlaces conjugados.
- Anillos aromáticos fusionados.
- Rigidez.
- Sustituyentes.

Esquema de un fluorímetro

La fuente de radiación se divide en dos haces.

El haz de la muestra pasa por el monocromador de excitación (selecciona la
longitud de onda) y llega a la muestra. El monocromador de emisión aísla la
fluorescencia emitida antes de que choque contra el fotomultiplicador de
muestra. El haz de referencia es atenuado antes de chocar contra el
fotomultiplicador de referencia. La información detectada por ambos
fotomultiplicadores es amplificada y luego enviada al dispositivo de lectura.
Los fotomultiplicadores detectan al mismo tiempo lo cual permite anular el
efecto de las fluctuaciones y la muestra debe estar a 90º o 180º del detector
ya que emite para todas direcciones.

Espectros de excitación y emisión

Para obtener el espectro de excitación y el de emisión/fluorescencia debo
seguir 3 pasos:
1. Obtención del espectro de absorbancia para determinar la longitud de
onda de absorción. Se hace con espectrofotómetro.
2. Fijar el monocromador de excitación a esta longitud de onda y obtener
el espectro de emisión.
3. Fijar el monocromador de emisión a la longitud de onda seleccionada
en el punto 2 y obtener el espectro de excitación.

Características de un espectro de fluorescencia

El espectro de emisión no depende de la longitud de onda de excitación, es
decir, al explorar diferentes longitudes de onda de excitación, el espectro de
emisión se mantiene constante.
– Desplazamiento de Stokes → es la diferencia en longitud de onda entre el
pico de absorción y el pico de emisión en un espectro de fluorescencia. Esta
diferencia ocurre porque durante el proceso de emisión de fluorescencia,
parte de la energía se pierde debido a la relajación vibracional y otras
interacciones en la molécula. Esto conduce a que la luz emitida tenga una
longitud de onda más larga que la luz absorbida.
Parámetro foto-físicos
Hablamos de los parámetro foto-físicos que describen la fluorescencia y que
son importantes en la toma de medidas. Son cuatro:
- Intensidad de fluorescencia (𝐼𝑓).
- Rendimiento cuántico (ϕ).
- Tiempo de vida (τ).
- Polarización.

– Intensidad de fluorescencia → se refiere a la cantidad de luz emitida como

fluorescencia por una molécula o sustancia cuando es excitada por luz
incidente.
– Rendimiento cuántico → relación entre el número de moléculas que emiten
fluorescencia respecto al número total de moléculas excitadas.
– Tiempo de vida → es la duración promedio durante la cual una molécula
permanece en estado excitado antes de regresar a su estado fundamental y
emitir un fotón de fluorescencia.
– Polarización → se refiere a la dirección de las vibraciones eléctricas y
magnéticas de una onda de luz.

Factores que afectan la fluorescencia

Los factores que afectan la fluorescencia son ocho:
- Estructura molecular.
- Rigidez estructural.
- Temperatura.
- Solvente.
- pH.
- Oxígeno disuelto (quenchers).
- Concentración (autoabsorción/filtro interno).
- Microentorno.

– Estructura molecular → los sistemas que contienen grupos funcionales

aromáticos presentan una fluorescencia más intensa. Estructuras alifáticas y
alicíclicas con dobles enlaces conjugados pueden presentar también
fluorescencia.
– Rigidez estructural → la fluorescencia aumenta con la rigidez.
– Temperatura → un aumento de temperatura provoca la disminución de la
intensidad de fluorescencia.
– Solvente → la fluorescencia puede aumentar o disminuir dependiendo del
tipo de solvente.
– pH → cuando los fluoróforos poseen sustituyentes ácido o básicos en los
anillos aromáticos es común que las formas ionizadas y no ionizadas
presenten diferente longitud de onda e intensidad de excitación y/o de
emisión.
– Oxígeno disuelto → la presencia de oxígeno disuelto en una muestra puede
apagar la fluorescencia debido a la transferencia de energía desde el estado
excitado de la molécula de oxígeno.
– Concentración →la intensidad de la radiación fluorescente es proporcional
al número de fotones de excitación absorbidos por el sistema. A
concentraciones muy altas, las moléculas fluorescentes pueden absorber la
luz emitida por otras moléculas del mismo tipo, lo que disminuye la
intensidad de fluorescencia. Esto se conoce como autoabsorción o efecto de
filtro interno.
– Microentorno → la fluorescencia puede ser influenciada por propiedades
del microentorno, es decir el ambiente cercano y específico en el que se
encuentra una molécula o una sustancia.

Efecto de solvente: corrimiento de Stokes

Parte de la pérdida de energía por interacción con el solvente se debe al
reordenamiento del solvente ante el cambio del momento dipolar del estado
excitado respecto al estado basal.
De este modo, solventes menos polares tienden a inducir un menor
corrimiento de Stokes y un mayor rendimiento cuántico. Lo opuesto ocurre
con los solventes más polares, que sensan mejor el cambio del momento
dipolar del fluoróforo y aumentan el corrimiento de Stokes.

Procesos no radiactivos del estado excitado

Se refiere a cuando una molécula excitada regresa a su estado fundamental
sin emitir radiación electromagnética. Estos procesos implican la relajación
de los electrones en la molécula hacia niveles de energía más bajos,
liberando la energía extra en formas diferentes a la radiación
Algunos de estos procesos son:
- Relajación por solvente.
- Transferencia de energía.
- Quenching.
- Transferencia de carga.
- Disociación.
 +
- Pérdida de 𝐻 .
- Formación de complejos.

– Relajación por solvente → cuando una molécula excitada interacciona con

el solvente circundante, puede transferir parte de su energía excitada al
solvente, disipando así la energía y regresando al estado fundamental.
– Transferencia de energía → implica la transferencia de energía desde una
especie excitada a otra especie, que puede estar en estado excitado o en
estado fundamental. Puede ocurrir entre moléculas cercanas y puede ser de
naturaleza radiativa (emisión de fotones) o no radiativa (sin emisión de
fotones).
– Quenching → se refiere a la transferencia de energía no radiante desde una
especie excitada hacia otras moléculas generando una disminución en la
intensidad de emisión fluorescente.
– Transferencia de carga → implica el movimiento de electrones entre dos
especies, una excitada y otra en estado fundamental o excitado.
– Disociación → se refiere a la ruptura de enlaces químicos en una molécula
debido a la absorción de energía. En estados excitados, las moléculas
pueden ganar suficiente energía para romper enlaces y formar fragmentos
moleculares diferentes.
+
– Pérdida de 𝐻 → una molécula excitada puede perder un protón para
formar una especie diferente.
– Formación de complejos → implica la interacción entre diferentes
moléculas o especies para formar una entidad más grande y estructurada.
En estados excitados, la formación de complejos puede cambiar debido a las
propiedades y estéricas alteradas.

Procesos que compiten con la fluorescencia

Hay tres procesos que compiten con la fluorescencia:
- Fenómeno de Transferencia de Energía de Resonancia Föster (FRET).
- Quenching estático.
- Quenching dinámico.

– FRET → es un mecanismo de transferencia no radiativa de energía entre

dos fluoróforos que están en proximidad cercana. Se basa en la transferencia
de energía desde un fluoróforo excitado (dador) a otro fluoróforo cercano
(aceptor) que luego emite luz.
– Quenching estático → involucra la disminución duradera y continua de la
emisión de luz fluorescente de un fluoróforo debido a la presencia de un
quencher que afecta la transición de la molécula desde su estado excitado al
estado fundamental. Esto puede deberse a la formación de complejos
moleculares, transferencia de carga o reacciones químicas que cambian las
propiedades electrónicas del fluoróforo, evitando que emita luz.
– Quenching dinámico → implica una disminución temporal y reversible en la
emisión de fluorescencia de un fluoróforo debido a la transferencia de
energía a otra especie cercana, en lugar de la emisión de luz. Este proceso
puede ocurrir en sistemas donde los fluoróforos están en proximidad
suficiente para permitir la transferencia de energía no radiativa.

Estados de 𝑂2 y quenching
El oxígeno molecular puede actuar como un quencher.
Cuando una molécula fluorescente está en un entorno rico en oxígeno, éste
puede interactuar con el fluoróforo y actuar como un agente de quenching
debido a que el oxígeno puede aceptar energía excitada de la molécula
fluorescente provocando que la molécula no emita luz y la fluorescencia se
apague o atenúe.

Arreglos instrumentales
Dos tipos: 90º y front face.
Tienen la finalidad de optimizar la detección de la fluorescencia de una
muestra y minimizar el quenching no deseado de la señal fluorescente.

– Fluorescencia de 90º → evita que la luz de excitación directa alcance el

detector. Al dirigir la luz de excitación desde una dirección y medir la
fluorescencia emitida en un ángulo de 90º con respecto a dicha luz, se
minimiza la interferencia de la luz de excitación dispersada en el detector.
– Front face → la superficie de la muestra que emite fluorescencia está
directamente frente al detector, lo que permite una medición precisa de la
luz emitida.

Instrumentación
– Fuente de luz → se puede utilizar lámparas de Xenón/Xenón-Mercurio o
Laser.
– Monocromador → grating (rejillas).
– Detector → fotomultiplicador.
Opcionalmente se puede utilizar un control de tiempo, celdas de flujo y
polarizador.
Aplicaciones
– Cuantitativas.
– Propiedades fotofísicas de fluoróforos.
– Cinética.
– Mecanismos de reacción.
– Estructura de proteínas (polarización y fluorescencia).
– Desnaturalización de proteínas.
– Interacciones metal-ligando, fluoróforo-solvente y moléculas biológicas.
– Marcaciones biomédicas (fluoróforos extrínsecos).
– Microscopio.

Proteínas: aminoácidos fluorescentes

Los aminoácidos fluorescentes exhiben propiedades de fluorescencia
intrínseca por lo que pueden absorber luz a una cierta longitud de onda y
emitir luz a una longitud de onda más larga.
Los más conocidos son el triptófano (Trp), la tirosina (Tyr) y la fenilalanina
(Phe).

Sondas fluorescentes para proteínas

Las sondas fluorescentes son moléculas diseñadas específicamente para
unirse a componentes biológicos y emitir fluorescencia cuando se excitan
con luz.
Existen varios tipos que se utilizan para etiquetar proteínas y demás pero los
más utilizados son:
- Fluoresceína y rodamina → absorben y emiten en el visible y son de
alto rendimiento.
- – DNS-CI → sensible a la polaridad del entorno por lo que da
fluorescencia polarizada.

Marcadores fluorescentes para ácidos nucleicos

Una vez unidos a los ácidos nucleicos, emiten fluorescencia cuando se
excitan con luz ultravioleta o visible.
– Bromuro de Etidio → se intercala en el ADN aumentando 20 veces su
intensidad de emisión.
– Naranja de Acridina → atraviesa membranas y se intercala en ADN/ARN.
– DAPI → atraviesa membranas y se enlaza a regiones A-T.
Polarización de la fluorescencia
Polarización = anisotropía.
– Polarización de fluorescencia → se utiliza para estudiar la dinámica y
orientación de moléculas en solución y se basa en cómo la luz polarizada (de
una dirección) se comporta durante la absorción y la emisión de
fluorescencia de moléculas.

La absorción y la emisión de luz por parte de una molécula están vinculadas

a cómo los dipolos de esa molécula se alinean en relación con la dirección de
la onda electromagnética incidente y la luz que se emite.
Si la población de fluoróforos se excita con luz polarizada verticalmente, la
luz emitida retendrá parte de esa polarización en función de la rapidez con la
que gira en la solución, es decir, la luz emitida va a estar polarizada del
mismo modo que la luz de excitación.
Cuanto más rápido sea el movimiento de orientación, más despolarizada
será la luz emitida mientras que, cuanto más lento sea el movimiento, más
luz emitida retiene la polarización.

Polarización de la luz
– Luz polarizada → todas las ondas de luz oscilan en la misma dirección o en
planos paralelos.
La radiación electromagnética tiene un componente eléctrico y uno
magnético que se propagan en fase pero en forma perpendicular. La
dirección de polarización es paralela al campo eléctrico.
La luz natural se dice que es no polarizada porque emite en todas las
direcciones.

Cómo se estudia la anisotropía de fluorescencia

La anisotropía se estudia con un equipo muy similar al de fluorescencia pero

con una pequeña variante: se le agrega un polarizador de excitación y un
polarizador de emisión.
Se utilizan para controlar la polarización de la luz de excitación y medir la
polarización de la luz emitida para, luego, poder sacar la anisotropía de
fluorescencia.
Hay que tener en cuenta que la orientación espacial de la molécula
fluorescente, su movilidad y su tamaño (volumen) afectan la dirección y
magnitud de la polarización de la luz.

Aplicaciones de la anisotropía de fluorescencia

Se usa para varios casos pero los más importantes son:
- Estudio de interacciones biomoleculares-
- Evaluación de estructuras moleculares.
- Investigación de membranas celulares.
- Estudios de transporte intracelular.
- Estudios de interacciones proteína-lípido.
- Detección de cambios conformacionales.
- Desarrollo de fármacos.
- Investigación de sistemas coloidales y poliméricos.