TEMA 4.

ESPECTROMETRIA DE FLUORESCENCIA
MOLECULAR

Luminiscencia

Todo fenómeno de emisión de la

radiación electromagnética desde
un estado excitado .
 Las moléculas de analito se


Fluorescencia, excitan para dar una especie
Fosforescencia cuyo espectro de emisión
suministra información para el
Quimiolumiscencia análisis cualitativo y
cuantitativo.

Los métodos de fluorescencia ,

fosforescencia y quimiolumiscencia ,
conocen como procedimientos lumiscentes
moleculares.
 En la fluorescencia y la fosforescencia la
excitación se produce mediante la
absorción de fotones. Por ello a estos
fenómenos de les denomina de manera
general como fotolumiscencia.

La fluorescencia presenta una vida corta ( 10 -5 s)

Ventajas:

• Sensibilidad, límites de detección

inferiores de uno a tres órdenes de
magnitud inferiores a los encontrados en
la espectroscopía de absorción. Los
límites de absorción característicos son
del orden de partes por billón.

• Amplios intervalos de linearidad, que los

encontrados en los métodos de absorción.
En general, los métodos lumiscentes se aplican
menos que los métodos de absorción en los
análisis cuantitativos debido a que el número de
especies que absorben radiación
ultravioleta/visible es mucho mayor que el de
especies que presentan fotolumiscencia tras la
absorción de radiación es esta región del
espectro.
 Teoría de la Fluorescencia y de la
Fosforescencia

La fluorescencia y la fosforescencia tiene lugar en

sistemas químicos, líquidos y sólidos.
Por ejemplo, los electrones 3s de los átomos de
sodio vaporizados pueden ser excitados al estado
3p mediante la absorción de radiación de longitudes
de onda de 5.896 y 5.890 Å.

Los electrones vuelven al estado fundamental

emitiendo radiación de estas dos mismas
longitudes de onda en todas las direcciones
después de 10 -8 a 10 -5 s.
 Estados excitados que producen fluorescencia y
fosforescencia
Espín del electrón

El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no

puede haber dos electrones con los cuatro números cuánticos
iguales. Esta restricción requiere que no haya más de dos
electrones en un orbital, y además, los dos deben tener los
estados de espín opuestos. Cuando esto ocurre, se dice que los
espines están apareados. Debido a esto las moléculas no
presentan un campo electromagnético neto y se dice, por tanto,
que son diamagnéticas , es decir que nos atraídas ni repelidas
por campos magnéticos permanentes.
Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones
desapareados, tienen un momento magnético y,
cosecuentemente, son atraídos cuando se encuentran en un
campo magnético; por ello, de dice que los radicales libres son
paramagnéticos.
Estados excitados singulete/triplete
Un estado electrónico molecular en el cual todos los
espines de los electrones están apareados se llama
estado singulete y cuando la molécula se expone a un
campo magnético no se produce un desdoblamiento de
niveles de energía.

El estado fundamental para para un radical libre, es un

estado doblete, porque el electrón impar puede tomar
dos orientaciones en un campo magnético, lo que
transmite ligeras diferencias de energía al sistema.

Cuando uno de los electrones de una molécula es

excitado a un nivel de energía superior, se forma un
estado singulete o triplete. En el estado triplete los
espines de los dos electrones se han desapareado y, por
tanto, están paralelos.
La multiplicidad molecular, M, se define como:

M = 2S + 1

Donde S es el número cuántico de spín de la

molécula, y es la suma de los spines de cada uno de
sus electrones.
Muchas moléculas orgánicas tienen un número par de
electrones, por lo que S = 0 y M = 1. A dicho estado se
le denomina singulete.
El estado energético más bajo (fundamental) deberá
ser aquel en el cual todos los electrones estén
apareados, y a dicho estado se le denomina estado
singulete fundamental.
Cuando un electrón pasa a un nivel energético
superior puede ocurrir que conserve su spín,
estado singulete excitado
O que se produzca un cambio en su spín, estado
triplete

M=3
Diagramas de niveles de energía para molécula
fotolumiscentes

La figura 1. Es un diagrama de niveles de

energía parcaial para una molécula
fotoluminiscente característica .

• So estado singulete, representa el estado

de energía fundamental de la molécula.
• S1 : Primer singulete electrónico excitado
• S2 : Segundo singulete electrónico excitado
• T1 : Enegía del primer estado triplete excitado
Figura 1. Diagrama de energía parcial para un sistema fotolumiscente .
Como se muestra en la figura 1, la excitación de la molécula se puede
producir por la absorción de dos bandas de radiación, una centrada
alrededor de la longitud de onda  1(So  S1) y la segunda alrededor de
la longitud de onda más corta  2(So  S2) . El proceso de excitación da
Como resultado la conversión de la molécula a cualquiera de los
diversos estados excitados vibracionales.
La excitación directa a un estado triplete no se muestra porque esta
transición no es significativa, ya que este proceso implica un cambio en
la multiplicidad, suceso, que tiene una baja probabilidad de suceder
(una transición de este tipo, de baja probabilidad, se llama prohibida).
Velocidad de absorción y de emisión .

La velocidad a la cual se absorbe un fotón de

radiación requiere del orden de 10 -5 a 10 -4 s. Por el
contrario, la emisión fluorescente, tiene lugar a una
velocidad más lenta.

La velocidad promedio de una transición triplete a

singulete es que menor que la correspondiente
transición singulete a singulete. Por ello, la emisión
fosforescente requiere tiempos comprendidos entre
10 -4 y 10 s o superiores.
Procesos de desactivación

Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental

mediante una combinación de varias etapas.
En la figura 1, las fechas verticales muestran dos de estas etapas,
fluorescencia y fosforescencia, conllevan la emisión de un fotón de
radiación.
Las otras etapas de desactivación, indicadas por flechas onduladas,
son procesos no radiantes.
Si la desactivación por fluorescencia es más rápida que los procesos
no radiantes, se observa tal emisión.
Si la desactivación no radiante tiene una constante de velocidad más
favorable, la fluorescencia desaparece o es menos intensa.
La fotoluminiscencia está limitada a un número relativamente pequeño
de sistemas que incorporan características estructurales y
ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de relajación
de relajación o desactivación no radiantes se ralenticen hasta el punto
en que la reacción de emisión puede competir cinéticamente con
ellos.
 Relajación vibracional

Una molécula, puede promocionarse a cualquiera de los niveles

vibracionales durante el proceso de excitación electrónico. En
disolución el exceso de energía vibracional se pierde como
consecuencia de las colisiones entre las moléculas de las especies
excitadas y las del disolvente. Este proceso de relajación es tan
eficaz que el tiempo de vida medio de una molécula excitada
vibracionalmente es de 10 -12 s o menor.
La fluorescencia de la disolución, cuando tiene lugar, siempre
incluye una transición desde el nivel vibracional más bajo de un
estado electrónico excitado.
La banda de fluorescencia para para una transición electrónica
dada se desplaza hacia menores frecuencias o longitudes de onda
más largas respecto a la banda de absorción (el desplazamiento
Stokes); En la fig. 1, la longitud de onda de la radiación absorbida
que produce el pico de resonancia r se reprenta como r.
 Conversión interna

El término conversión interna describe los

procesos intermoleculares por los cuales la
molécula pasa a un estado electrónico de
más baja energía sin emisión de radiación.
Los dos estados singulete excitados están tan próximos como para
que exista un solapamiento de los niveles de energía vibracional. Lo
que permite aparentemente una transición eficaz. La conversión
interna a través de los niveles vibracionales solapados es
normalmente más probable que la pérdida de energía por
fluorescencia desde un estado excitado más alto.

La excitación producida por la banda de radiación centrada en  2

provoca una banda de fluorescecia centrada en una 3 con
exclusión de la banda que resultaría de una transición entre S2 y S0 .
En este caso la molécula excitada pasa del estado electrónico más
alto al estado más bajo del estado electrónico más bajo por una serie
de relajaciones vibracionales, una conversión interna y nuevas
relajaciones posteriores.

En estas circunstancias, la fluorescencia tiene lugar sólo a 3,

independientemente de que las radiaciones de longitud de onda  1
y  2 sean responsables de la excitación.
La quinina es un ejemplo clásico de este tipo de comportamiento.

Figura 1.Espectros de excitación y emisión de la quinina

Esta sustancia presente en la naturaleza, posee dos

bandas de excitación analíticamente útiles, una centrada a
250 nm y la otra a 350 nm.
 Conversión externa

La desactivación de un estado electrónico excitado puede incluir la interacción y

la transferencia de energía entre la molécula excitada y el disolvente u otros
solutos.

Estos procesos se llaman conversión interna externa o amortiguación colisional.

Las transiciones no radiantes al estado fundamental desde los estados

excitados singulete y triplete más bajos (fig.1) incluyen, probablemente,
conversiones externas al igual que conversiones internas.

Cruce entre sistemas

El cruce entre sistemas es un proceso en el cual se convierte el espín de un
electrón exctado y da como resultado un cambio en la multiplicidad d la
molécula.

Al igual que en la conversión interna, la probabilidad de esta transición

aumenta si los niveles vibracionales de los dos estados se solapan..
 Cruce entre sistemas
El cruce entre sistemas es un proceso en el cual se convierte el espín de un
electrón exctado y da como resultado un cambio en la multiplicidad d la
molécula.

Al igual que en la conversión interna, la probabilidad de esta transición

aumenta si los niveles vibracionales de los dos estados se solapan..

La transición singulete/triplete que se muestra en la fig.1, es un ejemplo; aquÍ,

el estado vibracional singulete más bajo se solapa con uno de los niveles
vibracionales triplete más elevados y así es más probable un cambio de
espín..

El cruce entres sistemas es más común en moléculas en moléculas que

contienen átomos pesados, como son el yodo o el bromo (efecto del átomo
pesado).

La presencia de especies paramagnéticas en la disolución, como el oxígeno

molecular, también favorece el cruce entre sistemas y en consecuencia
disminuye la fluorescencia.
 Fosforescencia
La desactivación del estado electrónico excitado también puede incluir
la fosforescencia. Después del cruce entre sistemas a un estado
triplete excitado, la desactivación posterior puede tener lugar por
conversión interna o externa o por fosforescencia.

Una transición triplete  singulete es mucho menos probable que una

conversión singulete/singulete; el tiempo de vida media de un estado
triplete excitado respecto a la emisión oscila entre 10-4 y 10 s o más.
Por lo tanto, la emisión causada por una transición de este tipo puede
persisitir durante algún tiempo después de interrumpida la irradiación.

Exste una competición entre la fosforescencia y las conversiones

externas e internas, de tal manera que la emisón De fosforescencia
se observa normalmente sólo a bajas temperas en medios altamente
viscosos o por moléculas que están asdorbidas sobre superficies
sólidas.
 Variables que afectan a la fluorescencia y a la
fosforescencia
Tanto la estructura molecular como el entono químico
van a influir en una sustancia sea o no lumiscente;
estos factores también determinan la intensidad de
emisión cuando tiene lugar la fotolumiscencia.

Rara vez se observa fluorescencia debida a

transiciones *  
Este tipo de emisión está asociada a los procesos
menos energéticos *   y *  n ,

Para la mayoría de los compuestos fluorescentes, la

radiación se produce por una transición n  * o 
* , dependiendo de cuál de ellas sea la menos
energética.
Factores que afectan la Fluorescencia

Estructura molecular : ( transiciones *  

y *  n

- Efecto del átomo pesado

- Rígidez
- Formación de quelatos

Influencia del disolvente

Influencia del pH

Influencia del oxígeno

Ejemplo de compuestos con anillos bencénicos
condensados para dar lugar a núcleos
heterocíclicos, en los que se observa
fluorescencia.
 Efecto del átomo pesado

Las características de la emisión fluorescente (longitud de onda de

máxima emisión y su intensidad) de una molécula orgánica
aromática suele estar muy influida por los sustituyentes en el
anillo bencénico. Así, por ejemplo, cuando los sustituyentes son
halógenos, se observa una disminución de la fluorescencia al
aumentar el peso atómico del halógeno, lo cual parece debido al
llamado efecto del átomo pesado. Este efecto aumenta la
probabilidad de que se produzca el cruzamiento entre sistemas,
con el consiguiente aumento de la fosforescencia ( tabla 1).
Por otra parte, la presencia de un ácido carboxílico en un anillo
aromático hace que tengan lugar transiciones n—>π* con menos
energía que π—>π*, lo cual generalmente inhibe la fluorescencia.
 Rígidez
Experimentalmente se observa que la fluorescencia está
particularmente favorecida en moléculas que poseen estructuras
rígidas. Así, la intensidad de la fluorescencia del fluoreno (1.0) es unas
cinco veces mayor que la del bifenilo (0.2). El resultado de un aumento
en la rígidez es proporcionada por el puente que forma el grupo
metileno en el fluoreno

Fluoreno Bifenilo

Flouresceína Fenolftaleína

la forma rígida (fluoreno y fluoresceína) presenta mayor fluorescencia.

Este efecto se debe a que las estructuras más rígidas limitan las
vibraciones, lo cual minimiza la degradación por colisiones y el
cruzamiento de sistemas.
Efecto Quelato
El aumento de fluorescencia en ciertos compuestos orgánicos aumenta
cuando forman quelatos con iones metálicos, debido aun incremento en la
rígidez del sistema. Por ejemplo, la intensidad de fluorescencia de la 8-
hidroxiquinolina es menor que su complejo de cinc:

Complejo de cinc

La formación del quelato aumenta considerablemente la rígidez de la

molécula, al impedir que la molécula gire alrededor del grupo azo.
Efecto de la Temperatura y del Disolvente

El efecto de aumento en la temperatura incrementa el número de

choques moleculares, por lo que la desactivación tiende a
efectuarse a través de procesos no radiativos y por lo tanto se
inhibe la fluorescencia.

La viscosidad del disolvente tiene efectos similares, a mayor

viscosidad menor número de choques moleculares y mayor
intensidad de fluorescencia.

La polaridad del disolvente también tiene influencia en la

fluorescencia, debido al efecto hipsocrómico y batocrómico que
disolvente ejerce sobre el compuesto.
 Efecto del pH
Debido a las diferentes formas químicas que son posibles de
existir a diferentes condiciones de pH, la longitud de onda la
intensidad de fluorescencia también es afectada por ese factor.
Los cambios en la emisión de los compuestos de este tipo
surgen del distinto número de especies resonantes asociadas
con la formas ácidas y básicas de las moléculas. Por ejemplo la
anilina tiene varias formas resonantes, mientras que el ion
anilonio sólo una

Ion anilonio anilina

Cuanto mayor es el número de formas resonantes mayor es la

estabilidad del primer estado excitado; la consecuencia es una
fluorescencia en la región ultravioleta.
La fosforescencia que se observa siempre implica un
proceso de emisión de radiación por el paso de la
especia excitada desde el nivel vibracional más bajo
en energía del primer triplete excitado a alguno de los
niveles vibracionales del singulete basal, por lo que
debe ocurrir una serie de relajaciones vibracionales si
la molécula posee una energía vibracional mayor a la
energía vibracional cero en el triplete excitado.
La fluorescencia y la fosforescencia difieren en el tiempo de
duración del fenómeno.

La fluorescencia cesa de inmediato una vez que la fuente de

excitación ha sido retirada de la substancia (< 10-6 seg) la
fosforescencia dura al menos 10-4 seg y en algunos casos hasta
horas.

En química analítica la aplicación de estos fenómenos está

restringido a la fluorometría, que consiste en la cuantificación de
la radiación emitida por fluorescencia de una especie química
que posee esta característica y que directamente proporcional a
su concentración.
 Rendimiento Cuántico

Rendimiento cuántico F de un proceso de fluorescencia

es una manera de interpretar la eficiencia del mecanismo.

Se define como la proporción entre el número de fotones

emitidos y de fotones absorbidos.
# fotones emitidos
F
# fotones absorbidos

El rendimiento cuántico máximo de fluorescencia es por

lo tanto 1 (100%); esto significa que cada fotón
absorbido resulta de un fotón emitido. Sin embargo
compuesto con rendimiento cuántico de 0.01 se
consideran aún bastante fluorescentes.
 Efecto de la concentracion en la intensidad de
fluorescencia
La potencia de la emisión fluorescente F es proporcional a la potencia
radiante del haz de excitada. Esto es,

(1)

P0 = potencia del haz de luz que incide sobre la disolución

P = potencia después de atravesar una longitud b del medio
K´= depende de la eficacia cuántica del proceso de fluorescencia

Con el fin de relacionar F con la concentración c de especie fluorescente

se escribe la Ley de Beer de la forma

(2)

 = absortividad molar de las molécula fluorescentes

bc= absorbancia, A
Sustituyendo la ec. 2 en la ec. 1, se obtiene

(4)

El témino exponencial de la Ec. 3, puede desarrollarse como

una serie de Maclaurin

(5)

Siempre que 2,303 abc = A  0.05, los términos posteriores del

corchete son despreciables respecto al primero; en estas
condiciones el error relativo máximo cometido al despreciar los
términos excepto el primero es de 0.3 por cien, por ello se puede
escribir,
 (6)
o cuando P0 es constante,

(7)

Así, la representación gráfica de la potencia fluorescente de una

disolución frente a la concentración de las especies emisoras
debería ser lineal a bajas concentraciones. Cuando c es tan
elevada que la absorbancia es mayor que aproximadamente 0.05,
los términos de mayor orden de la ec. 4, adquieren importancia y
la linaridad se pierde; entonces F toma un valor inferior al
obtenido en la extrapolación de la línea recta de la representación
gráfica.
1.- Un tónico es analizado en su contenido de quinina por
espectrofotometría de fluorescencia, con 350 nm de longitud de onda
de excitación y midiendo la intensidad de fluorescencia a 450 nm.
1.0 mL del tónico es aforado a 100 mL con H2SO4 0.05M y la
intensidad de emisión de esta solución es de 8.44 (unidades relativas).
Se prepara una serie de estándares de quinina y sus intensidades de
fluorescencia son las siguientes:

Concentración I.F.
_________________________________
1 ppb 0.015
10 ppb 0.158
100 ppb 1.26
1 ppm 12.0
10 ppm 52.3
100 ppm 293.0
____________________________________

La intensidad de fluorescencia del blanco, solución 0.05 M de H2SO4

es insignificante.
Grafique fluorescencia contra concentración y determine el contenido
de quinina teórico.
De la ec. 7, se observa que la intensidad de fluorescencia F es
directamente proporcional a la concentración C

(7)
350

300
IF 250

200
y = 2.8833x + 6.3935
150 R² = 0.9939

100

50

0
0 20 40 60 80 100 120

ppm
8.44 - 6.3935
x= = 0.70 Se convirtieron
2.8833
las ppb a ppm
para hacer la
0.70(100) gráfica.
=70 ppm
(1)
 Problema 2.

Dos muestras de orina en pacientes que reciben terapia de quinina para

combatir la malaria, son analizadas para determinar sus niveles de
quinina. Las muestras preparadas son las siguientes: Muestra A. Un
blanco de agua destilada; B. Un estándar que contiene 2 ppm de quinina
diluido en agua destilada; C. Un blanco de orina, el cual no contiene
quinina; D. muestra paciente No.1; E. Muestra paciente No.2.
Se toman 2mL de cada muestra de orina así como del estándar yel pH
se eleva a 9 con hidróxido de amonio concentrado y luego se hace una
extracción con 4 mL de cloroformo. 2 mL del extracto de cloroformo son
extraídos nuevamente con 2 mL de H2SO4, después de lo cual se hace
la determinación midiendo la intensidad de fluorescencia a 450 nm. Las
IF relativas son: A 1.7, B 50.2, C 14.3, D. 82.8, E. 58.7.

Haciendo ajustes por los blancos, y considerando la IF directamente

proporcional a la concentración de quinina, encuéntrese la concentración
de quinina en las dos muestras de orina.
 RESPUESTA

1.- AJUSTE DE BLANCO DE AGUA:

Espectros de emisión y excitación

La figura 3, muestra los tres tipos de espectros fotolumiscentes del

fenantreno. Los espectros de excitación (E en la figura) se obtienen
midiendo la intensidad luminiscente a una longitud de onda fija mientras se
varía la longitud de onda de excitación.

Figura 3, Espectros del fenantreno: E, exctación; F,

fluorescencia; P, fosforescecia.
Como la primera etapa en la generación de emisión fluorescente es la
absorción de radiación, para crear los estados excitados, un espectro de
excitación es prácticamente idéntico a un espectro de absorción
realizado bajo las mismas condiciones.
Los espectros de fluorescencia y de fosforescencia (F y P,
respectivamente), suponen la excitación a una longitud de onda fija
mientras se registra la intensidad de emisión como función de la longitud
de onda. La fotolumiscencia tiene lugar a longitudes de onda de
excitación. Las bandas fosforescentes se encuentran a longitudes de
onda más largas que las bandas de fluorescencia, ya que, en la mayoría
de los casos, el estado triplete excitado tiene menor energía que el
correspondiente estado singulete. De hecho, la diferencia de longitudes
de onda entre los dos proporciona una medida útil de la diferencia de
energía entre los estados excitados singulete y triplete.