TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIÉRREZ

Montes Molina Joaquín Adolfo.

Integrantes:

Clemente Rabasa Esmeralda

Cruz González Gloria Jazmín
De Los Santos López Luis Diego
Macal Montoya Iridiana
Olivo Sánchez Isaac Valente de Jesus
Sanchez Ávila Deyanira Judith
Santini Reyes Abril

UNIDAD 3

Espectroscopia de Fluorescencia
La espectrometría de fluorescencia o espectrofluorimetría es el método
espectroscópico óptico más extensivamente usado en mediciones analíticas y en
investigación científica.

• La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas

por la absorción de radiación electromagnética y al relajarse al estado basal
liberan el exceso de energía en forma de fotones.
• Las dos principales ventajas de los métodos de fluorescencia sobre los de
absorción son:
• 1) Una sensibilidad entre 1 y 3 órdenes de magnitud mayor.
• 2) Mayor intervalo de respuesta lineal.
 Espectroscopia de Fluorescencia

Se trata de utilizar un haz de luz, por

lo general luz ultravioleta, que excita
los electrones de las moléculas de
ciertos compuestos y provoca que
emitan luz de una menor energía

Gran sensibilidad Altos nivel alcanzado tanto por los

instrumentos requeridos, como por los
fluoroforos diseñados para aplicaciones
especificas
 TEORÍA DE LA ESPECTROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA

Las moléculas tienen diferentes estados
llamados niveles de energía se refiere
principalmente a estados vibracionales y
electrónicos.
• En general, las especies objeto de examen tendrán un
estado electrónico basal (un estado de baja energía) de
interés, y un estado electrónico excitado de mayor
energía. Dentro de cada uno de estos estados
electrónicos hay diferentes estados vibracionales.

Primero se excita la muestra mediante
la absorción de un fotón de luz, desde
su estado electrónico basal a uno de
los distintos estados vibracionales del
estado electrónico excitado.
• Las colisiones con otras moléculas causan que la
molécula excitada pierda energía vibracional
hasta que alcanza el estado vibracional más bajo
del estado electrónico excitado.

• Mediante el análisis de las

La molécula desciende luego a uno de
los distintos niveles de vibración del
estado electrónico basal, emitiendo un
fotón en el proceso.
diferentes frecuencias de luz
emitida por espectrometría de
fluorescencia, junto con sus
intensidades relativas se puede
determinar la estructura de los
diferentes niveles de vibración
 TEORÍA DE LA
ESPECTROSCOPIA
DE FLUORESCENCIA
• En espectroscopia de
fluorescencia se registran
espectros de excitación y de
emisión. El espectro de
excitación corresponde con el
espectro de absorbancia. Ambos
espectros son una
representación de la intensidad
de fluorescencia en unidades
arbitrarias en función de la
longitud de onda en nm. Para
registrar el espectro de emisión
se fija una longitud de onda de
excitación y para el de
excitación se fija una longitud de
onda de emisión.
• Otra característica de los
espectros de fluorescencia es
que el espectro de emisión es
independiente de la longitud
de onda de excitación, debido
a la disipación parcial de
energía de excitación que
ocurre durante la duración
del estado excitado.
• El espectro de emisión de
fluorescencia varia
marcadamente con la
estructura química del
fluoroforo y del solvente en
el que esta disuelto.
FACTORES QUE AFECTAN LA
FLUORESCENCIA
 INSTRUMENTOS UTILIZADOS PARA
DETECTAR FLUORESCENCIA

• Espectrofluorómetro y detectores de microplacas: miden el promedio de la

fluorescencia de la muestra (el volumen de muestra que mide ronda entra los
microlitros a mililitros.
• Microscopio de fluorescencia: determina la fluorescencia como una función de las
coordenadas espaciales en dos o tres dimensiones para el objetos microscópicos.
• Scanner de fluorescencia: determina la fluorescencia en función de coordenadas
en dos dimensiones de objetos macroscópicos como ser geles de electroforesis,
blotting y cromatografía.
• Otro tipo de instrumentos para detección por fluorescencia son electroforesis
capilar, HPLC y equipos de secuenciación de DNA.
EQUIPOS DE MEDIDA DE FLUORESCENCIA

• Un fluorímetro consta de una fuente de luz y de un sistema de selección de

longitud de onda de excitación. Cuando la muestra es excitada con radiación de
energía apropiada emite radiación en todas las direcciones del espacio. No
obstante la luz emitida se detecta mejor en ángulo recto con respecto al haz de
excitación ya que se evitan problemas de dispersión de la luz y también el haz de
luz excitante que es de mucha mayor intensidad que el haz de luz emitida. La luz
emitida es recogida seleccionando una longitud de onda apropiada y conducida a
un detector donde queda registrada por sistemas similares a los de un
espectrofotómetro de absorción.
• VENTAJAS DE LA FLUORESCENCIA
• Ventaja principal “alta sensibilidad”
• La fluorometría es mas selectiva que la espectrofotometría de absorción UV/VIS
por dos razones:
• 1. Muchas moléculas absorben fuertemente el rango UV/VIS, pero no exhiben
fluorescencia detectable
• 2. En fluorometría, se necesitan dos longitudes de onda para que el proceso se
lleve a cabo ( excitación o emisión ), a diferencia de la absorciometría la cual solo
necesita una longitud de onda de absorción.
APLICACIONES
APLICACIONES
•
La espectrometría de fluorescencia se utiliza en análisis
bioquímicos, médicos, químicos y de investigación de
compuestos orgánicos. También se ha utilizado para
diferenciar los tumores malignos de piel de los benignos.

La fluorescencia también puede utilizarse para reorientar los

fotones.
BIBLIOGRAFÍA

• • Millar, P. D., 1996. Fluorescente studies of DNA and RNA structure and dynamics. Curr Opin Struct Biol
6(3):322-6.
• • Lakowicz, J. R., 1999. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Ed., Kluwer Academic/Plenum
Publishers, New York, USA.
• Ellis, D. W., 1666. Luminiscente instrumentation and experimental details. En: Hercules, D. (Ed.),
Fluorescence and phosphorescence analysis principles and applications. Interscience Publ., USA, pp. 41-
79.